Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.

Abstract

הקומפלקס גולג'י מורכב cisternae ממברנה מוערמים באופן סדרתי אשר יכולים להיות מסווגים נוספים לתוך אזורים תת-גולג'י, כולל את חבר העמים-המדיאלי-גולג'י, גולג'י, טרנס-גולג'י ושומן טראנס-רשת גולג'י. פונקציות הסלולר של גולג'י נקבעים לפי ההתפלגות האופיינית מהחלבונים תושב. הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי הוא נמוך מדי כדי לפתור sub-גולג'י מבנה או cisternae. לפיכך, מיקרוסקופ אלקטרונים חיסונית-זהב היא שיטה של בחירה כדי להתאים לשפה חלבון ברמה תת-גולג'י. עם זאת, הטכניקה ואת כלי הנגינה הם מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. נתאר כאן שיטת רזולוציה סופר שפותחו לאחרונה שלנו נקרא גולג'י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM) למקם באופן שיטתי, באופן כמותי חלבון גולג'י. GLIM מבוסס על קרינה פלואורסצנטית רגילה פרוטוקולים תיוג ו רחב-שדות קונבנציונלי או מיקרוסקופ קונפוקלי. זה כרוך הכיול של אברציה כרומטית-shift של המערכת מיקרוסקופיים, רכישת התמונה הניתוח שלאחר הרכישה. לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון מבחן מבוטאת באופן כמותי המנה לוקליזציה. ישנם ארבע היתרונות העיקריים של GLIM; זה מהיר, המבוסס על שיטות קונבנציונליות וכלים, התוצאה לוקליזציה היא כמותית, היא מעניקה ~ 30 ננומטר רזולוציה מעשית לאורך הציר גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול מפורט של GLIM כדי להתאים לשפה בדיקת חלבון גולג'י.

Introduction

המתחם גולג'י ממלא תפקידים חיוניים ב סחר הפרשה/endocytic של חלבונים ושומנים (להלן וחקלאיים) תאים בתרבית של1,2,3. -גולג'י, ושינוע מטענים הם לא רק ממוין to תאים סלולריים תת השונים אלא גם שונה על-ידי סוגים מגוונים של גליקוזילציה. המתחם גולג'י יונקים כוללת רבים ערימות גולג'י מחוברים רוחבית, אשר מורכב בדרך כלל 4-11 ממברנה בחוזקה סמוכים ושטוחים שקי שנקרא cisternae. Cisternae גולג'י באופן סדרתי מוערמים מסווגים, מקצה אחד לשני, כמו חבר העמים, המדיאלי, טרנס-cisternae. - טרנס-הצד של ערימה גולג'י, טרנס-שק ממברנה רוב מתפתח מרשת ממברנה צינורי, רשת הנקראת טרנס-גולג'י רשת (TGN)4. השביל הפרשה וחקלאיים נגזר תוך-פלזמית (ER) הזן ערימה גולג'י-שלה cis-בצד ולאחר מכן ברצף להעביר דרך המדיאלי, טרנס-cisternae. וחקלאיים לצאת בסופו של דבר את גולג'י- טרנס-גולג'י או TGN destining קרום פלזמה, endosomes או בגרגרים הפרשה.

המנגנונים הסלולר המולקולריים של איך וחקלאיים מעבר ערימה גולג'י ושומר על איך גולג'י האירגון cisternal להישאר מסתורי והן נמצאות כרגע עדיין תחת דיונים1. אחד הקשיים בתחום זה היא כי cisternae גולג'י בלבד ניתן לפתור תחת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאז הרזולוציה של מיקרוסקופ אופטי (~ 200 ננומטר) אינה מספיקה לפתור גולג'י בודדים cisternae (< 100 ננומטר בעובי שני cisternal והמרחק). לכן, לוקליזציה תת-גולג'י של חלבונים תושב, הם מגיעים וחקלאיים כמקובל נקבעות לעוב חיסונית-זהב. עם זאת, לעוב חיסונית-זהב הוא תובעני מאוד טכנית, זה מעבר ליכולת של רוב מעבדות ביולוגיה של התא. למרות הרזולוציה של האלקטרומגנטיות יכול להיות תת ננומטר, הרזולוציה המוענקת על ידי לעוב חיסונית-זהב היא במידה רבה הקשו על ידי הגודל של הנוגדן מורכב (יסודי בתוספת הנוגדן המשני) לבין החלקיק זהב, זה יכול להיות גרוע יותר 20 ננומטר. יתר על כן, תמונות EM מתקבלים ממקטעים 2D דק-במקום תצוגה גלובלית תלת-ממד של גולג'י, אשר עלולה לגרום מסקנות שגויות בהתאם המיקום היחסי ואת כיוון ההדפסה של 2D סעיף5. לדוגמה, ללמוד מקטע יחיד אם אין אפשרות להבחין בצורה אמינה של שלפוחית מהתצוגה אורתוגונלית של צנורית, מאז שניהם ניתן להציג פרופילים זהים ממברנה עגול. הופעתו האחרונה של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה, כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה תלת-ממד (3D-SIM), גירוי דלדול פליטה (STED), מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ ( סופה), מאפשר לפתור מבנים תת-גולג'י תחת מיקרוסקופ אור6. עם זאת, ישנם חסרונות לפחות ארבעה זה יכול להגביל באופן משמעותי את השימושים שלהם בחקר התא הביולוגי גולג'י. 1) רזולוציה סופר הנוכחי טכניקות דורש הגדרת תצורה של חומרה יקר ומיוחד אשר אינה רוב מעבדות ביולוגיה של התא. 2) פרוטוקולים תיוג זריחה מיוחד יש צורך כמה טכניקות סופר רזולוציה. 3) למרות, בתנאים הטובים ביותר, טכניקות אלו טוענים nm 20-110, רזולוציה מרחבית, הרזולוציה המעשי שהושג בדגימות אמיתי יכול להיות הרבה יותר גרוע. 4) בהשוואה מיקרוסקופ רגיל, טכניקות אלו סופר-רזולוציה עדיין יש קשיים בביצוע ססגוניות, תלת-ממד או לחיות תא הדמיה, ביחידים או בשילוב. כנראה והכי חשוב, חיסונית-זהב EM והן את הטכניקות מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה תשואות איכותי במקום נתונים כמותיים לוקליזציה.

ניסיון חלקית לפתור את הבעיות שהוזכרו לעיל, לאחרונה פיתחנו שיטה המקובלת מיקרוסקופ אור מבוסס, אשר הוזכר גולג'י חלבון לוקליזציה על ידי הדמיה מרכזי מסה (GLIM), למקם באופן שיטתי, באופן כמותי גולג'י חלבונים ברזולוציה מקבילה לזו של EM חיסונית-זהב7. בשיטה זו, גולג'י בתרבית תאים בתרבית של מפוזרת כמו מיני גולג'י-במחסן על ידי הטיפול של nocodazole, תרופה depolymerizing microtubule. מחקרים מקיפים הוכיחו כי nocodazole-induced גולג'י מיני-במחסן (להלן גולג'י מיני-ערימות) הדומים יליד ערימות גולג'י הארגון והן תאיים8,9,10, 11. ניתן לרכוש את המנה לוקליזציה (LQ) של חלבון מבחן דרך GLIM, זה מרמז על לוקליזציה תת כמותית-גולג'י. ניתן להשוות את הערכים המספריים של LQs, קיו מסד נתונים של יותר מ-25 גולג'י סמני הייתה זמינה.

ב GLIM, גולג'י מיני-במחסן הם עם התווית משולשת על ידי אנדוגני או ביטוי exogenously GM130, גולט-mCherry החלבון מבחן (x). GM130 וגולט-mCherry, cis- וטרנס-סמני גולג'י בהתאמה12,13, לספק נקודות התייחסות. טריפל פלורסצנטיות, אדום (R), ירוק (G) ומרחיקת אדום (B), באופן מלאכותי מוצגים כמו אדום, ירוק וכחול, בהתאמה. מרכז מסה קרינה פלואורסצנטית (להלן-המרכז) הוא מאומץ כדי להשיג תת פיקסל ברזולוציה. הציר גולג'י מוגדר וקטור ממרכז של GM130 לזה של גולט-mCherry. הערימה מיני גולג'י הוא המודל כמבנה גלילי עם אינסוף סימטריה סיבובית סביב הציר גולג'י. לכן, ערימה מיני גולג'י שניתן למדל נוספות כמו מבנה חד-ממדי לאורך הציר גולג'י. מנת משכל של החלבון במבחן x מוגדרת בתור dx/d1, שבו dx הוא המרחק מן המרכז של x לזו של GM130, בעוד d1 הוא המרחק מן המרכז גולט-mCherry של GM130. אם המרכז של x מהציר, מרחק צירית שלה הקרנה משמש לחישוב. המשתנים, כולל גולג'י ציר, זווית צירית, dx, d1, הזווית α β זווית, עבור GLIM מומחשים סכמטי באיור1. LQ היא עצמאית של הזווית צירית גולג'י למרות גולג'י מיני-במחסן אוריינט באקראי בתא.

גולג'י מיני-במחסן מופיעים inhomogeneous בתמונות. פיתחנו שלושת הקריטריונים לבחירת בקופסאת גולג'י מיני-ערימות עבור GLIM. 1. קריטריון) יחס אות לרעש, שבו היחס בין עוצמת ערימה מיני גולג'י כדי סטיית התקן (SD) של הרקע הכולל הוא ≥ 30 בכל ערוץ. קריטריון זה נועד להבטיח דיוק מיקום מרכז מסה, אשר תלויה יחס אות לרעש של מיני גולג'י-במחסן. 2) מפוח הזווית או המרחק הקריטריון, המחייב d1≥ 70 ננומטר. d1 יורדת עם העלייה של הזווית צירית גולג'י. כאשר הזווית צירית מתקרב 90° או אנכי, הערימה המצומצמת תהיה בלתי-ניתן לפתור כמו d1 מתקרב 0. d1≥ 70 nm יכול לכלול ביעילות ליד מיני גולג'י אנכי-במחסן.... 3 קריטריון) co-ליניאריות, שבו גם | שיזוף α | או | שיזוף β | הוא ≤ 0.3. קריטריון זה מבטיח שלושת המרכזים ערימה מיני יהיו מספיק co-ליניארי עבור שלנו מודל חד-ממדי של הערימה מיני גולג'י. מיקרוסקופ אור כל סובלים אברציה כרומטית אשר ברצינות יכולה לעוות את המיקומים היחסיים של מרכזי פלורסצנטיות מרחיקת אדום, ירוק ואדום. אברציה כרומטית של מיקרוסקופ מערכות השפעול מכויל על ידי הדמיה 110 חרוזים ננומטר, אשר עם התווית שלוש פעמים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום, ירוק ואדום. עבור כל תמונה חרוז, מרכז אדום מוגדר מיקומו האמיתי של החרוז, כרומטית-משמרות של מרכזי מרחיקת אדום וירוק הם מצויד ידי פונקציות פולינום מסדר ראשון. מוקדי גולג'י מיני-במחסן הם נתון את פונקציות פולינום לתקן כרומטית-במאזן ערוצי מרחיקת אדום וירוק.

באמצעות GLIM ניתן להשיג רזולוציה של ~ 30 ננומטר לאורך הציר גולג'י בתנאים רגילים. חשוב, זה מספק שיטה שיטתית למפות באופן כמותי את כל חלבון גולג'י. GLIM יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון שדה רחב או מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות פרוטוקולים תיוג נפוצות של זריחה. הדמיה ועיבוד נתונים יכול לקחת קצר ככל שעה. דרך GLIM, ישירות הראו את המעבר פרוגרסיבי של המטען הפרשה מחבר ציס- טרנס-הצד של גולג'י7.

Protocol

הערה: בהמשך הוא פרוטוקול צעד אחר צעד של GLIM לקביעת מתויג מנת משכל של EGFP tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), אנזים תושב גולג'י, בתאים הלה.

1. הכנת התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית גולג'י מיני-במחסן

  1. להכין coverslips זכוכית דקה
    1. בינוני (DMEM aliquot 0.3 mL עקר Dulbecco ששינה הנשר) כדי טוב של צלחת 24-ובכן בשכונה תרביות רקמה.
    2. נגב חתיכת באופן כללי 12 מ"מ No.1.5 זכוכית coverslip בעזרת נייר טישו רך נכנס עם 70% אתנול להסרת פסולת על פני השטח של coverslip זכוכית. השתמש זוג מספריים חדים בקצרה לטבול את coverslip 70% אתנול, להעביר אותו המשקולת 24-ובכן, שקעו זה של DMEM סטרילי המכיל גם.
      הערה: coverslips זכוכית דקה כמקובל סטריליים על ידי בוער. עם זאת, coverslips תחת טיפול כזה לפצח בקלות במהלך טיפול לאחר מכן. 70% אתנול השריית יעילה לחיטוי coverslips זכוכית דקה מבלי לפגוע בהם.
    3. עם המכסה מכוסה, להשאיר הצלחת 24-ובכן ב- 37 ° C CO2 מגשים עד השימוש.
  2. תאי זרע
    1. התרבות התאים הלה (להלן תאים) בקבוקון T-25 ב DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS) (להלן שלם בינוני) בחממה2 37 ° C CO מסופקים עם 5% CO2. אנטיביוטיקה אינם הכרחיים כאן.
    2. כאשר תאים להגיע ~ 80% confluency, תשאף המדיום תרבות. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק, דגירה התאים חממה2 ° 37 C CO 2 דק להוסיף 1 mL בינוני מלא לתוך הבקבוק, לשטוף בעדינות את התאים מהקיר את הבקבוק על ידי pipetting.
    3. העברת תאים מנותקת צנטריפוגה סטרילי צינור ו ספין-500 x g למשך 2 דקות הצניפה התאים. וארוקן את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא בינוני מלא 1 מ"ל.
    4. האחות המדיום בבאר של צלחת 24-ובכן המכילות את coverslip זכוכית מעוקר ואת זרע ~ עונה 1 פרק 105 תאים בתוך הבאר. למעלה את עוצמת הקול של הבאר עם שלם בינוני עד 0.5 מ"ל. דגירה של 37 ° C CO2 מגשים שסופק עם 5% CO2. התרבות התאים ~ 80% confluency.
  3. Transfect תאים
    הערה: תאים היטב להפיץ הם יתרון הדמיה מיני גולג'י מפוזר-במחסן....
    1. Transfect ~ 80% תאים confluent עם ng גולט-mCherry 807 ו- 320 ng TPST1-EGFP (ראה טבלה של חומרים) ה-DNA פלסמידים באמצעות תגובה כימית תקנים לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן. דגירה ב חממה2 37 ° C CO. לשנות את המדיום לאחר 4-6 h הדגירה. התאים הם מוכנים ~ 12 שעות מאוחר יותר.
  4. טיפול Nocodazole כדי ליצור מיני גולג'י-במחסן
    1. להכין פתרון מניות nocodazole (33 מ מ) על ידי המסת אבקה nocodazole 10 מ ג של 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד. Aliquot הפתרון מניות וחנות ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    2. למהול 1 µL של nocodazole מניות פתרון (33 מ מ) 1 מ"ל 37 ° C מלא בינוני (מיקרומטר 33 הריכוז הסופי). צנטריפוגה בשיא המהירות כדי להסיר חלקיקי החומר.
    3. האחות המדיום בבאר ולהוסיף 0.5 מ של 33 nocodazole מיקרומטר המכילות בינוני מלא. דגירה התאים חממה2 ° 37 C CO עבור 3 ח' להמשיך כדי immunofluorescence תיוג (סעיף 1.5).
  5. תיוג immunofluorescence
    הערה: לשמור תאים בחושך כדי להימנע photobleaching של גולט-mCherry, TPST1-EGFP.
    1. להכין ריאגנטים עבור תיוג immunofluorescence
      1. כדי להכין פתרון paraformaldehyde 4%, לפזר אבקת 4% (w/v) paraformaldehyde חמות 1 X buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45. הפתרון שניתן לאחסן ב-20 ° C.
        התראה: Paraformaldehyde רעילים ומסרטנים, זה יכול לגרום לגירוי העור. ללבוש את המתאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי).
      2. כדי להכין מאגר דילול קרינה פלואורסצנטית (FDB), מערבבים 5% (v/v) FBS ו- 2% (w/v) שור אלבומין (BSA) ב 1 x PBS. לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.45 ולאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
      3. להמיס 5.35 g NH4Cl אבקת 1 ליטר מים להכין 100 מ מ NH4Cl ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
      4. לפזר אבקת סאפונין 10% (w/v) במים כדי להכין 10% סאפונין, aliquot ולאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
    2. קיבעון
      1. לשטוף פעם 0.5 מ ל 1 x PBS פתרון ולהוסיף 0.5 מ ל 4% paraformaldehyde פתרון. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף היטב פעמיים PBS 1 x 0.5 mL, פעמיים עם 0.5 mL 100 מ מ NH4Cl. יש לשטוף היטב פעמיים עם PBS 1 x 0.5 mL. ניתן לשמור תאים ב- 1 x PBS ב 4 ° C בלילה בחושך.
    3. קרינה פלואורסצנטית תיוג
      1. למהול 1 µL העכבר anti-GM130 ראשי נוגדנים ב 500 µL FDB המכיל סאפונין 0.1%. הפוך את המכסה של צלחת 24-ובכן ולהחיל 10 התערובת נוגדן ראשוני µL על המכסה.
      2. השתמש זוג מספריים חדות כדי לחלץ ולהעביר את coverslip זכוכית אל הירידה של נוגדן תערובת להבטיח כי הצד התא הוא בקשר עם התערובת. דגירה התאים עם התערובת נוגדן ראשוני לשעה בטמפרטורת החדר.
        הערה: ניתן להניח את המכסה עם coverslip בשקית פלסטיק humidified בחושך.
      3. השתמש זוג מספריים חדות כדי לחלץ, להעביר coverslip את הבאר עם הצד תא למעלה, שוטפים אותה ב- PBS 1 x 0.5 mL במשך שלוש פעמים ב ≥ 30 דקות טלטול היא מיותרת.
      4. למהול 1 µL fluorophore מרחיקת אדום עז מצומדת אנטי-העכבר IgG (נוגדנים משניים) 500 µL FDB המכיל סאפונין 0.1%.
      5. לשטוף ולנקות את השטח הפוכה של המכסה של צלחת 24-. טוב. החל µL 10 נוגדנים משניים מרחיקת אדום התערובת על המכסה. חזור על שלבים 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. הרכבה
      1. הכן המדיום גובר על ידי ערבוב 1 g גליצרול, poly(vinyl alcohol) 2.2 g (MW ~ דה 31,000), 1.2 מ ל 1 מ' טריס (pH 8) ו- 8.8 מ ל H2O. להמיס התערובת בתוך אמבט מים 60 ° C עם מדי פעם vortexing. לאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
      2. להפשיר את המדיום הרכבה ולהעביר µL 10 על זכוכית. מכסים את coverslip (תא בצד למטה) על גבי הירידה של הרכבה בינונית. דגירה השקופית זכוכית-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר עבור h 1 להקשיח את המדיום הרכבה. לסגור את coverslip עם לק שקוף ולאחסן את השקופית זכוכית ב-20 ° C.

2. הכנת חרוזים פלורסנט לתיקון כרומטית-shift

  1. Coverslip ניקוי
    1. בזהירות המקום חתיכה של coverslip זכוכית No.1.5 25 מ מ על גבי ארון פלסטיק.
    2. העברה האצטבה עם coverslip גביע 400 מ ל מלא 300 מ"ל 1 M NaOH, sonicate ב sonicator אמבט (35 וואט) במשך 15 דקות בקצרה שטיפה המדף בתוך 400 מ ל מלא יונים 300 מ"ל מים. להעביר את המדף גביע 400 מ ל מלא 300 מ ל 99% אתנול, sonicate ב sonicator אמבט במשך 15 דקות בקצרה שטיפה המדף בתוך 400 מ ל מלא יונים 300 מ"ל מים.
    3. חזור על שלב 2.1.2 עוד פעמיים.
    4. לשטוף האצטבה עם coverslip יונים 300 מ"ל מים בתוך 400 מ ל במשך 10 דקות חזור על השלב פעמיים נוספות. להעביר את ארון תנור 60 ° C ויבש את coverslip עבור 1 ח' חנות coverslip מיובשות בצלחת פטרי ללא אבק.
  2. קיבעון החרוזים פלורסנט coverslip זכוכית
    1. לדלל 110 nm צבע רב פלורסנט חרוזים 80-fold ב 1 x PBS המכיל 0.1 µg/µL BSA. בקצרה מערבולת הצינור לפיזור אגרגטים חרוז. להפיץ 60 חרוזים µL מדולל על גבי coverslip זכוכית (ראו סעיף 2.1) No.1.5 25 מ מ באופן כללי נקי באמצעות טיפ פיפטה. יבש את coverslip ב desiccator מחובר משאבת ואקום בחושך והר את coverslip על זכוכית במדיום הרכבה 50 µL (ראה שלב 1.5.4.2).

3. ייבוא תמונות

הערה: GLIM דורשת תמונות של יחס אות לרעש גבוה (SNR) לחישוב מרכז מסה ברמת דיוק גבוהה. התמונה ניתן לרכוש באמצעות מיקרוסקופים רגילים כגון סריקת קונאפוקלית, לייזר דיסק ספינינג מיקרוסקופ קונפוקלי או שדה רחב. מיקרוסקופ שדה רחב מצויד עם עדשות מטרת התכנית-apochromatic, חיישן התמונה רעש נמוכה, כגון תשלום מצמידים מכשיר (CCD), מדעי משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (sCMOS) יכול לשמש. פרמטרים עבור חיישן התמונה מותאמים כדי להבטיח טווח דינמי לקריאה-רעש וגבוה נמוכה. המיקרוסקופ חייב להיות מצויד תצורת אופטימלית של מסנני קרינה פלואורסצנטית ירוק, mCherry, fluorophore מרחיקת אדום, בטח יש קרינה פלואורסצנטית זניח צולבות לדבר. באופן אידיאלי, מערכת ההדמייה משיגה קצב הדגימה של נייקוויסט ב- x, y ו- z, ציר בדרך כלל דורש x, y ו- z לגודל voxel פחות מ 100, 100 ו-200 nm, בהתאמה. X ו- y של voxel תמיד שווים בגודלם מכונים pixel_size. Pixel_size יכול להיות מחושב על ידי חלוקת גודל חיישן המצלמה על-ידי ההגדלה המערכת.

  1. תמונת צבע רב חרוזים
    1. תמונת צבע רב חרוזים בערוצים מרחיקת אדום, אדום וירוק בתחילתו ובסופו של דבר של כל הפעלה הדמיה.
      הערה: כאן, תמונות נרכשו דרך מיקרוסקופ אפינפרין רחב-שדות קונבנציונלי-זריחה (הפוכה) מצוידים 100 מטרת התכנית-apochromatic X 1.4 נה, הבמה ממונע, מקור האור של 200 וואט מטאל-הליד, מצלמה 16 סיביות sCMOS. אורכי הגל עבור מסנן עירור (הלהקה pass), מראה ודיקרואיק זוהר (פס ארוך), מסנן פליטה (הלהקה pass) של הקוביה מסנן הערוץ הירוק הם 465-495, 505 ו- 515-555 ננומטר; עבור הקוביה מסנן הערוץ האדום אלו 528-553, 565 ו 578-633 ננומטר; ואלו עבור הקוביה מסנן ערוץ מרחיקת אדום 590-650, 660, 663-738 ננומטר. במהלך הרכישה, לגודל voxel לאורך ה-x, y ו- z ציר הוא 64, 64 ו- 200 ננומטר, בהתאמה.
    2. למצוא מבט שדה עם חרוז טוב צפיפות.
    3. רוכשים את אוספי תמונות תלת-ממד בערוצים מרחיקת אדום, אדום וירוק (ערוץG, ערוץR, ערוץB, בהתאמה). לקחת 3 סעיפים מעל ומתחת את הטוב במישור המוקד (7 סעיפים לכל מחסנית). שמור את שלוש ערימות. שלושה קובצי TIFF.
      הערה: זמן החשיפה לכל ערוץ נקבע מדעית כדי להגדיל את הטווח הדינמי, להימנע פיקסל רוויה ולצמצם את photobleaching. פרמטרים נוספים, כגון מסננים, x, y ו- z לגודל voxel, נבחרו כמתואר לעיל.
  2. גולג'י מיני-אוספי תמונות
    1. שימוש TPST1-EGFP mCherry גאלט transfected, fluorescently עם תוויות שקופיות (סעיף 1.5) כדי לחפש את התאים את TPST1-EGFP אקספרס, רמה נמוכה או בינונית של גולט-mCherry. רוכשים את אוספי תמונות תלת-ממד כפי שמתואר בשלב 3.1.3.

4. תמונות ניתוח

  1. רכישת מרכזים של חרוזים פלורסנט
    1. ב- ImageJ, פתח את קבוצת תמונות חרוז המורכב שלושה קובצי TIFF (קובץ > תמונות > פתח).
    2. ממוצע 3 סעיפים רצופים סביב המקטע ממוקד ביותר בערוץR על ידי תמונה > ערימות > פרויקט Z. קלט מספר סעיף "התחל slice" ו- "Stop slice" ובחר בין אפשרויות של "השלכה"סוג","בעוצמה ממוצעת".
    3. צייר אזורים מעניינים (ROIs) המכילים אין חרוזים בתמונה באמצעות "מצולע בחירות". ב "נתח > הגדרת המידות", בדוק רק "ערך אפור מרושע" ואת "סטיית תקן". והוציאו "נתח > מדד" כדי להשיג את מתכוונת ו- SD של רועי.
    4. לחשב את עוצמת רקע כמו "אומר + 6 × SD". להחסיר את התמונה עם ערכי העוצמה של הרקע המתאים על-ידי "תהליך > מתמטיקה > הפחת", קלט בערך העוצמה רקע התואם לערוץ הזה.
    5. חזור על שלבים 4.1.2 כדי 4.1.4 עבור ערוץG ואוספי תמונות ערוץB באמצעות ההתחלה זהה ולהפסיק פרוסה ואת הרקע באותו ROI. שימו לב: רועי בשימוש בשלב 4.1.3 ניתן להעתיק אל ערוץG ותמונות ערוץB .
    6. למזג את שלוש תמונות רקע המופחת (תמונה > צבעים > מזג ערוצים) על-ידי בחירת ערוץR כאדום, ערוץG ירוקה, ערוץB בכחול. ניתן להשיג תמונה ללא הפרדות צבע אחת המורכבת בשלושה ערוצי.
    7. השקת רועי מנהל (נתח > כלים > רועי מנהל). צייר של רועי מרובע סביב חרוזים יחיד ולהבטיח כי יש חרוז אחד בלבד בתוך כל רואי. להוסיף את רועי מנהל רועי על-ידי לחיצה על "t" במקלדת. חזור על תהליך זה ולהוסיף ROIs רבים ככל האפשר.
    8. ב "נתח > הגדרת המידות", לבדוק רק "מרכז מסה".
    9. בחר ערוץR, במנהל רועי, לחץ על "למדוד" כדי להשיג מרכזי; שתי העמודות, התואמים את x ו- y קואורדינטות של מוקדי ROIs יוצג בחלון "תוצאת". העתק והדבק את שתי עמודות גיליון אלקטרוני.
    10. חזור על צעד 4.1.9 ערוץG וערוץB.
    11. לארגן את הקואורדינטות של מרכזי גיליון יחיד לפי הסדר הבא: xR, yR, xG, yGxB, ו- yB. שמור את הגיליון האלקטרוני בתבנית ". csv" "beads.csv". להשאיר מקום בשם הקובץ.
  2. בחר ולמדוד גולג'י מיני-במחסן
    1. להתקין שתי פקודות מאקרו (לצרף תוספת חומרים) ב- ImageJ, "רועי מאקרו-גולג'י פיקוח", "פלט מאקרו 3 ערוצי נתונים" על ידי תוספים > להתקין ". מנהל רועי ברורים והחלון תוצאה.
    2. פתח קבוצה של תמונות בערימה מיני גולג'י המורכב שלושה קובצי TIFF (קובץ > תמונות > פתוח).
    3. חזור על שלבים 4.1.2 - 4.1.5 ולשמור את שלוש המופחת-רקע תמונות לשימוש מאוחר יותר. הרשומה רקע מרחביות עבור ערוץR, ערוץG וערוץB SDR, SDG ו- SDB, בהתאמה, מאוחר יותר לשימוש.
    4. לשכפל את שלושת המופחת-רקע תמונות שנוצרו משלב 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. ב- "תהליך > מחשבון תמונה", להוסיף הרקע-יש לחסר אותם זה ערוץG לתמונות ערוץR . להוסיף את התמונה המתקבלת לתמונה המופחת-רקע ערוץB . על התמונה המתקבלת, ב "תמונות > התאם > הסף", בחר "קבע" קלט "1" כמו "רמת הסף הנמוך". לאחר לחיצה על "החל", תמונה בינארית בשחור לבן היא תוצאה.
    6. ב "נתח > לנתח חלקיקים", קלט את גודל הטווח עבור "גודל (פיקסל ^ 2)". קלט "50-אינסוף". בדוק "אי-כלילה של בקצוות" ו- "הוסף למנהל". ROIs המכילה מיני גולג'י-במחסן יתווספו עכשיו מנהל רועי.
      הערה: גודל הטווח מדעית להיקבע להוציא קולות אשר בדרך כלל.
    7. למזג את שלוש תמונות רקע המופחת (תמונה > צבעים > מזג ערוצים) משלב 4.2.3 על-ידי בחירת ערוץR כאדום, ערוץG ירוקה, ערוץB בכחול. תמונה ללא הפרדות צבע אחת המורכבת בשלושה ערוצי נוצר.
    8. להפעיל את המאקרו "רועי מאקרו-גולג'י פיקוח" על-ידי בחירה "תוספים > מאקרו-גולג'י רועי הבדיקה". בתיבת הדו-שיח האינטראקטיבי, חזותית לבדוק כל רועי לשמור או לדחות אותה. בחר ROIs המכילים אובייקט בודד כל שלושה ערוצים.
      הערה: לאחר הפעלת כלי זה, שנדחו ROIs מסולקות מהמנהל רועי.
    9. צ'ק-אין רק "אזור", "ערך אפור רשע", "מרכז מסה" "נתח > הגדרת המידות". להשיג נתונים על-ידי שיגור כלי מאקרו של "פלט מאקרו שלושה ערוצי נתונים" (תוספים > מאקרו-פלט 3 ערוצי נתונים).
      הערה: אזורים, כלומר עוצמות ומרכזי (x ו- y) של ROIs ערוץR, ערוץG , ערוץB מוצגים בחלון "תוצאת".
    10. העתק x ו- y הקואורדינטות של מרכזי לתוך גיליון אלקטרוני ולסדר אותם לפי הסדר הבא: xR, yR, xG, yGxB, ו- yB. שמור את הגיליון האלקטרוני קובץ "csv" (ministacks. csv). להשאיר מקום בשם הקובץ. המשך תיקון כרומטית-shift המרכזים (סעיף 4.3) וחישוב מנת משכל (סעיף 4.4).
  3. תיקון כרומטית-shift של מרכזי
    1. התקן Matlab מהדר זמן ריצה (בתפוז).
    2. להתקין את הקבצים הבאים בתיקיית עבודה ייעודי: my_train.exe ו- my_test.exe. העתק והדבק "beads.csv" ו-"ministacks. csv" קבצים באותה תיקיה.
    3. השקת "שורת הפקודה" של Windows ועבור אל תיקיית העבודה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה " cd path_of_working_folder".
    4. צור קובץ כיול כרומטית-shift באמצעות מרכזי של חרוזים. הקלד את הפקודה הבאה "my_train.exe חרוזים. csv כיול.mat 1". קובץ בשם"כיול.mat" נוצר בתוך תיקיית העבודה. התעלם קבצים אחרים שנוצרו.
    5. תקן כרומטית-משמרת המרכזים של מיני גולג'י-במחסן על-ידי הקלדת הפקודה הבאה "my_test.exe ministacks. csv corrected_ministacks. csv כיול.mat 1".
      הערה: קובץ בשם"corrected_ministacks. csv" נוצר בתוך תיקיית העבודה. הוא מכיל כרומטית-shift הציון המתוקן של מרכזי, אשר מסודרים לפי הסדר של xG, yG,B ו- yB. התעלם קבצים אחרים שנוצרו. שימו לב המוגדר ערוץ הצבע האדום חינם של אברציה כרומטית, ולכן xR ו- yR זהים כנתונים גולמיים.
  4. חישוב LQs
    1. להפעיל את תוכנת ניתוח נתונים, העתק והדבק, להלן רצף, מתכוון ערכי אפור, אזורים, רקע מרחביות המתקבל שלב 4.2.3 (למקם אותם בשורה 1) וכרומטית-shift מתוקן x ו- y הקואורדינטות של מיני גולג'י-ערימות ערוץR ל גליון כעמודות A עם אי באופן דומה, העברת הנתונים המתאימים עבור ערוץG וערוץB על עמודות F J, K כדי O, בהתאמה.
    2. להוסיף עמודות חדשות 8 P W, בשם "משולב האינטנסיביות של ערוץ R", "משולב האינטנסיביות של ערוץ G", "משולב האינטנסיביות של ערוץ B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b), קיו.
      1. העליון של העמודה בהתאמה קליק ימני ובחר "להגדיר ערכי עמודה" לחישוב ערכים עבור כל אחת מהעמודות. עבור עמודה P, קלט "Col(A)Col(B)"; עבור עמודה קיו, קלט "Col(F)Col(G)"; עבור עמודה R, קלט "Col(K)Col(L)"; עבור עמודה זו, קלט "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" שם "pixel_size" הוא גודל הפיקסל ב ננומטר; עבור עמודה T, קלט "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; עבור עמודה U, קלט "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; עבור עמודה V, קלט "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; עבור עמודה W, קלט "Col (T) / Col (S)".
    3. לסנן את המיני גולג'י-במחסן לפי שלושת הקריטריונים המתוארים מבוא.
      1. תוכנת ניתוח של נתונים, כנס ל "גליון עבודה > שאילתת גליון" בחר עמודה משתנים למבחן "אם". להקצות הכינויים הבאים I1, I2, I3, d1, A ו- B עבור עמודות "עוצמה משולבת של ערוץ R", "משולב האינטנסיביות של ערוץ G", "עוצמה משולבת של ערוץ B", d1, ABS(tan a) ו- ABS (tan b), בהתאמה. ב "אם התנאי" תיבת, קלט "I1 > =30*cell(1,3), I2 > =30*cell(1,8) ו- I3 > =30*cell(1,13) AND d1 > = 70 AND (A < = 0.3 או B < = 0.3)".
      2. בחר "לחלץ את גליון חדש", לחץ על "החל". העמודות A-W של מיני גולג'י בקופסאת-במחסן מחולצים לגליון עבודה חדש.
    4. בגליון העבודה החדש, לחץ לחיצה ימנית העליונה של העמודה W, בחר "סטטיסטיקה בעמודה > הדו-שיח פתיחה". הסימון "הכולל N", "רשע", "SE של ממוצע", "היסטוגרמות". ניתוח סטטיסטי של LQs לאחר מכן, מוצגים.

תוצאות

המחקר המודרני כיתה מיקרוסקופ אור מצויד עם עדשת apochromatic התוכנית, כמו זה בשימוש במעבדה שלנו, מראה אברציה כרומטית מינימלי (איור 2א). עם זאת, בדיקה זהירה של תמונת צבע רב חרוז פלורסנט יכול לחשוף את המשמרת של תמונות צבע שונה של החרוז אותו (איור ...

Discussion

בעבר, הלוקליזציה של חלבון גולג'י תחת מיקרוסקופ אור הייתה לכמת בעיקר על ידי מידת המתאם או חופפים של התמונה של החלבון עם התמונה של סימן גולג'י לוקליזציה ידוע15,16, 17. המתאם המתקבל או מקדם חופפים משקף כמה קרוב החלבון הבדיקה היא דה מרקר גולג'י במ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ד סטיבנס (אוניברסיטת בריסטול, בריסטול, אנגליה) על פלסמיד דנ א TPST1-EGFP, וכן Narasimhan Govindarajan לאקשמי שעזרת עם תוכנת אופטימיזציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן נבחרת המועצה למחקר רפואי (NMRC/CBRG/007/2012), משרד החינוך (RG Tier1 AcRF 18/11, RG 48/13 ו- RG132/15 ו- AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) שראשי

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beadsInvitrogenT7279As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)MenzelCB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazoleMerck487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherryMade in our lab.
paraformaldehydeMerck1.04005.1000
saponinSigma-Aldrich47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Mouse anti-GM130BD Biosciences610823Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgGInvitrogenA-21235Far red fluorescence conjugated secondary antibody

References

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved