Localização de quantitativa de uma proteína de Golgi por imagem sua massa centro de fluorescência

Resumo

A localização exacta dos residentes de Golgi é essencial para a compreensão de Golgi a funções celulares. No entanto, a microscopia óptica convencional é incapaz de resolver a estrutura sub-Golgi. Aqui descrevemos o protocolo para um método de super-resolução microscopia convencional baseado determinar quantitativamente a localização sub-Golgi de uma proteína.

Resumo

O complexo de Golgi consiste de pequenos membrana empilhados em série que podem ser classificados ainda mais em regiões sub-Golgi, incluindo o cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi e trans-rede de Golgi. Funções celulares do Golgi são determinadas pela distribuição característica de suas proteínas residentes. A resolução espacial de microscopia de luz convencional é demasiado baixa para resolver pequenos ou sub-Golgi estrutura. Assim, a microscopia eletrônica de imuno-ouro é um método de escolha para localizar uma proteína ao nível sub-Golgi. No entanto, o instrumento e a técnica estão além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Descrevemos aqui nosso método recentemente desenvolvido Super-resolução chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM) sistematicamente e quantitativamente localizar uma proteína de Golgi. GLIM baseia-se na rotulagem protocolos padrão de fluorescência e campo amplo convencional ou microscópios confocal. Envolve a calibração de aberração cromática-mudança do sistema microscópico, a aquisição de imagens e a análise de pós aquisição. A localização de sub-Golgi de uma proteína de teste é expressa quantitativamente como o quociente de localização. Existem quatro principais vantagens de GLIM; é rápida, com base em métodos convencionais e ferramentas, o resultado de localização é quantitativo e que proporciona ~ 30 resolução de nm prático ao longo do eixo de Golgi. Aqui descrevemos o protocolo detalhado de GLIM localizar um teste de proteína de Golgi.

Introdução

O complexo de Golgi desempenha funções essenciais no tráfico endocítica/secretoras de proteínas e lipídios (doravante cargas) em células de mamíferos^1,2,3. No Golgi, cargas não são apenas classificadas para vários compartimentos celulares sub mas também modificadas por diversos tipos de glicosilação. O complexo de Golgi dos mamíferos compreende várias pilhas de Golgi lateralmente ligadas, que normalmente consiste de sacos de membrana firmemente adjacentes e plana de 4-11 chamados pequenos. Os pequenos de Golgi empilhados em série são mais categorizados, de um lado para o outro, como cis, medial e trans-pequenos. Para o trans-lado de uma pilha de Golgi, o trans-sac de membrana mais se desenvolve em uma rede de membrana tubular e retículo chamada trans-Golgi rede (TGN)⁴. Na via secretora, cargas derivadas do retículo endoplasmático (ER) Insira uma pilha de Golgi em seus cis-lado e em seguida sequencialmente passar medial e trans-pequenos. Cargas eventualmente sair do Golgi na trans-Golgi ou TGN destining à membrana plasmática, endossomos ou grânulos secretórios.

Os mecanismos moleculares e celulares de como cargas de trânsito uma pilha de Golgi e como o Golgi mantém sua organização cisternal permaneçam misteriosos e atualmente ainda estão sob um acalorado debate¹. Uma das dificuldades neste campo é que pequenos de Golgi só podem ser resolvidos sob a microscopia de elétron (EM), desde a resolução do microscópio óptico (~ 200 nm) é insuficiente para resolver pequenos individuais de Golgi (< 100 nm em ambos espessura cisternal e a distância). Portanto, a localização de sub-Golgi das proteínas residentes e cargas em trânsito são convencionalmente determinado pelo EM imuno-ouro. No entanto, o EM imuno-ouro é tecnicamente muito exigente e está além da capacidade da maioria dos laboratórios de biologia celular. Embora a resolução da EM pode ser sub nanômetros, a resolução proporcionada pelo imuno-ouro EM grandemente é dificultada pelo tamanho do complexo anticorpo (primária mais anticorpo secundário) e a partícula de ouro e pode ser pior que 20 nm. Além disso, EM imagens são obtidas a partir 2D-cortes finos em vez de uma vista global 3D do Golgi, que pode resultar em conclusões errôneas dependendo da posição relativa e orientação do 2D seção⁵. Por exemplo, estudar uma única EM-seção é incapaz de confiantemente diferenciar uma vesícula do vista ortogonal de um túbulo desde que ambos podem exibir perfis idênticos membrana redondo. O recente advento de técnicas de microscopia de super-resolução, tais como a microscopia de iluminação 3D-estruturado (3D-SIM), estimulou a depleção de emissão (STED), microscopia de localização fotoativados (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia ( TEMPESTADE), torna possível resolver estruturas sub-Golgi sob microscópios de luz⁶. No entanto, existem pelo menos quatro inconvenientes que podem limitar significativamente seus usos no estudo biológico celular do Golgi. 1) atual Super-resolução técnicas exigem a configuração de hardware caro e especial, que está além da maioria dos laboratórios de biologia celular. 2) protocolos de etiquetagem de fluorescência especiais são necessárias para algumas técnicas de super-resolução. 3) embora, nas melhores condições, estas técnicas afirmam 20-110 nm na resolução espacial, resolução prática obtida em amostras reais pode ser muito pior. 4) em comparação com a microscopia convencional, essas técnicas de super-resolução ainda tem dificuldades em realizar multicoloridas, 3D ou vivem a célula de imagem, isoladamente ou em combinação. Provavelmente o mais importante, tanto EM imuno-ouro e as técnicas de microscopia de super-resolução rendem qualitativo em vez de dados quantitativos de localização.

Tentar resolver parcialmente os problemas mencionados acima, recentemente desenvolvemos um método de microscopia de luz convencional com base, que é chamado a localização da proteína de Golgi por imagem centros de massa (GLIM), sistematicamente e quantitativamente localizar um Golgi proteína em uma resolução equivalente do imuno-ouro EM⁷. Neste método, o Golgi em células de mamíferos cultivadas é dispersado como minipilhas de Golgi pelo tratamento de nocodazole, uma droga depolymerizing de microtúbulos. Extensos estudos têm demonstrado que induzida por nocodazole Golgi minipilhas (doravante Golgi mini-stacks) assemelham a pilhas de Golgi nativas em organização e funções celulares^{8,9,10, 11}. O quociente de localização (LQ) de uma proteína de teste pode ser adquirido através de GLIM e denota a localização sub-Golgi quantitativa. Os valores numéricos de QI pode ser comparados e um banco de dados do QI de mais de 25 marcadores de Golgi está disponível.

Em GLIM, minipilhas de Golgi são triplo-etiquetados por GM130 expressa forma exógena ou endógena, GalT-mCherry e a proteína de teste (x). GM130 e mCherry-GalT, cis- e trans-marcadores de Golgi^12,13, fornecem, respectivamente, pontos de referência. A fluorescência tripla, vermelha (R), verde (G) e far-red (B), artificialmente são exibidos como vermelho, verde e azul, respectivamente. Centro de massa da fluorescência (doravante centro) é adotado para alcançar sub pixels de resolução. O eixo de Golgi é definido como o vetor do centro de GM130 ao de GalT-mCherry. Pilha mini de Golgi é modelada como uma estrutura cilíndrica com simetria de rotação infinita em torno do eixo de Golgi. Portanto, uma pilha mini de Golgi pode ser ainda mais modelada como uma estrutura unidimensional ao longo do eixo de Golgi. O QI da proteína teste x é definido como d_x/d₁, em que d_x é a distância do centro da x ao de GM130, enquanto d₁ é a distância do centro de GalT-mCherry ao de GM130. Se o centro do x está fora do eixo, sua distância de projeção axial é usada para o cálculo. As variáveis, incluindo Golgi eixo, ângulo axial, d_x, d₁, ângulo α e β ângulo, para GLIM são ilustradas esquematicamente na Figura 1. LQ é independente do ângulo axial Golgi embora minipilhas de Golgi orientam-se aleatoriamente em uma célula.

Minipilhas de Golgi aparecem não homogênea em imagens. Desenvolvemos três critérios para selecionar o minipilhas de Golgi analisáveis para GLIM. 1) o critério da relação sinal-ruído, em que a relação da intensidade total de uma pilha de Golgi mini para o desvio padrão (SD) do plano de fundo é ≥ 30 em cada canal. Este critério é garantir a exatidão de posicionamento do centro de massa, que varia de acordo com os rácios de sinal-ruído de minipilhas de Golgi. 2) o critério ângulo ou distância axial, que exige d₁≥ 70 nm. d₁ diminui com o aumento do ângulo axial de Golgi. Quando o ângulo axial se aproxima de 90° ou vertical, a mini pilha torna-se não puder ser resolvido como d₁ aproxima-se 0. d₁≥ 70 nm pode excluir efetivamente perto de minipilhas de Golgi verticais. 3) o critério de co-linearidade, em que | tan α | ou | tan β | é ≤ 0.3. Este critério garante que os três centros de um mini pilha são suficientemente co-linear para nosso modelo unidimensional de pilha mini de Golgi. Todos os microscópios de luz sofrem de aberração cromática que pode seriamente distorcem a posição relativa dos centros de fluorescência vermelha, verde e far-red. A aberração cromática de sistemas microscópio experimentalmente é calibrada por imagem 110 grânulos nm, que são triplo-etiquetados por fluorescência vermelha, verde e far-red. Para cada imagem do grânulo, o centro de vermelho é definido como a verdadeira posição do cordão de e cromático-turnos de verdes e far-red centros estão equipados por funções polinomiais de primeira ordem. Centros de minipilhas de Golgi estão sujeitos às funções polinomiais para corrigir os turnos-cromática nos canais verdes e far-red.

Através de GLIM nós pode alcançar uma resolução de ~ 30 nm ao longo do eixo de Golgi sob condições normais. Importante, ele fornece um método sistemático para quantitativamente, mapear qualquer proteína de Golgi. GLIM pode ser executada por microscópios convencionais, tais como campo amplo ou microscópios confocal, usando protocolos de etiquetagem de fluorescência comuns. A imagem e processamento de dados podem levar tão curtos quanto uma hora. Através de GLIM, diretamente demonstrámos a transição progressiva da carga secretora de cis- Trans-lado do Golgi⁷.

Protocolo

Nota: Abaixo está um passo a passo protocolo de GLIM para determinar a tyrosylprotein marcadas LQ de EGFP sulfotransferase 1 (TPST1), uma enzima residente de Golgi, em células HeLa.

1. preparação de pilhas de Golgi fluorescência-etiquetada Mini

1. Preparar as lamelas de vidro
   1. Médio (DMEM do alíquota 0,3 mL estéril Dulbecco modificado águia) para um bem de uma placa de 24 em um capuz de cultura de tecidos.
   2. Limpe um pedaço da lamela de vidro do No.1.5 12 mm Φ usando papel de tecido macio dabbed com etanol a 70% para remover os resíduos na superfície da lamela de vidro. Use um par de Pinças afiadas para brevemente embeber a lamela em etanol a 70%, transferi-lo para a placa de 24 e afundá-lo no fundo do DMEM estéril contendo bem.
      Nota: As lamelas de vidro convencionalmente são esterilizadas por flamejante. No entanto, as lamelas sob tal tratamento facilmente crack durante manipulação posteriormente. imersão de etanol 70% é eficaz na esterilização as lamelas de vidro sem danificá-los.
   3. Com a tampa coberta, deixe a placa de 24 a 37 ° c CO₂ incubadora até o uso.
2. Células de semente
   1. Cultura HeLa células (daqui por diante) em um frasco de T-25 em DMEM suplementado com 10% Fetal bovino soro (FBS) (doravante completo médio) numa incubadora 37 ° C CO₂ fornecido com 5% de CO₂. Os antibióticos não são necessários aqui.
   2. Quando atingem células ~ 80% confluência, Aspire o meio de cultura. Adicionar 1 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para o balão e incube as celulas em uma incubadora de 37 ° C CO₂ por 2 min. adicionar 1 mL de meio completo para o frasco e lave delicadamente as células da parede do balão pipetando.
   3. Transferi células destacadas para um tubo de centrifugação estéril e girar a 500 x g por 2 min para as células de Pelotas. Aspirar o sobrenadante e suspender o centrifugado em 1 mL de meio completo.
   4. Aspire o meio no poço da placa de 24 contendo a lamela de vidro esterilizado e semente ~ 1 x 10⁵ células no poço. Completar o volume do poço com meio completo a 0,5 mL. Incube numa incubadora 37 ° C CO₂ fornecida com 5% de CO₂. Cultura de células para ~ confluência de 80%.
3. Transfect células
   Nota: Células bem-distribuídos são vantajosas para minipilhas de Golgi dispersos de imagem.
   1. Transfect ~ 80% confluentes com 80 ng GalT-mCherry⁷ e 320 ng TPST1-EGFP plasmídeos de DNA (ver Tabela de materiais) usando um reagente de Transfeccao de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Incube em uma incubadora de 37 ° C CO₂ . Mude o meio após incubação de 4-6 h. As células estão prontas ~ 12 h depois.
4. Tratamento de Nocodazole para gerar pilhas de Golgi mini
   1. Prepare uma solução stock de nocodazole (33mm) dissolvendo-se 10 mg de pó de nocodazole em Dimetilsulfóxido 1ml. Alíquota da solução estoque e loja a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
   2. Dilua 1 µ l de solução-mãe de nocodazole (33mm) médio completo 37 ° C e 1 mL (concentração final 33 µM). Centrifugar a velocidade máxima para remover partículas em suspensão.
   3. Aspire o meio no poço e adicionar 0,5 mL de 33 nocodazole µM, contendo meio completo. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C CO₂ por 3 h. proceder à imunofluorescência rotulagem (seção 1.5).
5. Rotulagem de imunofluorescência
   Nota: Manter as células no escuro para evitar fotobranqueamento de GalT-mCherry e TPST1-EGFP.
   1. Preparar os reagentes para a rotulagem de imunofluorescência
      1. Para preparar a solução de paraformaldeído 4%, dissolver o pó de paraformaldeído 4% (p/v) em quente 1 X salina tamponada fosfato (PBS) e filtrar a solução através de filtro de 0,45 µm. A solução pode ser armazenada a-20 ° C.
         Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico e cancerígeno e pode causar irritação da pele. Use o equipamento de protecção adequado (EPI).
      2. Para preparar o tampão de diluição de fluorescência (FDB), misture 5% (v/v) FBS e 2% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x. Filtrar a solução através de filtro de 0,45 µm e armazenar a solução a-20 ° C.
      3. Dissolva 5,35 g NH₄Cl pó em 1 L de água para preparar 100 mM NH₄Cl e armazenar a solução à temperatura ambiente.
      4. Dissolver o pó de saponina de 10% (p/v) em água para preparar 10% saponina, alíquota e armazenar a solução a-20 ° C.
   2. Fixação
      1. Lave uma vez bem com 0,5 mL 1 x solução de PBS e adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído 4%. Incube durante 20 min à temperatura ambiente. Lave o bem duas vezes com PBS 1x de 0,5 mL e duas vezes com 0,5 mL 100mm NH₄CL Rinse poço duas vezes com 0,5 mL 1X PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a 4 ° C durante a noite, no escuro.
   3. Rotulagem de fluorescência
      1. Diluir 1 µ l do mouse anti-GM130 anticorpo primário em saponina de 0.1% contendo 500 µ l FDB. Reverter a tampa da placa de 24 poços e aplique a mistura de anticorpo primário 10 µ l para a tampa.
      2. Use um par de Pinças afiadas para extrair e transferir a lamela de vidro sobre a gota de anticorpo mistura garantindo que o lado de célula está em contato com a mistura. Incube as células com a mistura de anticorpo primário por 1h à temperatura ambiente.
         Nota: A tampa com a lamela pode ser colocada em um saco plástico umidificado no escuro.
      3. Usar um par de Pinças afiadas para extrair e transferir a lamela para o poço com o lado da célula acima e enxaguá-lo em 0,5 mL 1X PBS para três vezes em ≥ 30 min. agita é desnecessária.
      4. Dilua 1 µ l fluoróforo far-red cabra conjugado anti-mouse IgG (anticorpo secundário) em saponina de 0.1% contendo 500 µ l FDB.
      5. Lave e limpe a superfície reversa da tampa da placa de 24 poços. Aplica a mistura de far-red anticorpo secundário 10 µ l para a tampa. Repita os passos de 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
   4. Montagem
      1. Preparar o meio de montagem pela mistura de glicerol 1 g, poly(vinyl alcohol) 2,2 g (MW ~ Da 31.000), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) e 8,8 mL H₂O. dissolver a mistura em um banho de água de 60 ° C com ocasionalmente num Vortex. Armazenar a solução a-20 ° C.
      2. Descongelar o meio de montagem e transferência de 10 µ l de uma lâmina de vidro. Sobreposição de lamela (lado da célula para baixo) para a gota de meio de montagem. Incube a 37 ° C por 30 min ou temperatura ambiente durante 1 h endurecer o meio de montagem a lâmina de vidro. Selar a lamínula com esmalte incolor e armazenar a lâmina de vidro a-20 ° C.

2. preparação dos grânulos fluorescentes para correção cromática-turno

1. Lamela limpeza
   1. Cuidadosamente coloque um pedaço de 25 mm No.1.5 lamela de vidro em uma cremalheira plástica.
   2. O rack com a lamela de transferência para um copo de 400 mL cheio de 300 mL, 1 M de NaOH e proceda à sonicação em um sonicador de banho (35 Watts) por 15 min. brevemente enxaguar o rack em um copo de 400 mL cheio de 300 mL de água desionizada. Transferir o rack para um copo de 400 mL cheio de 300 mL 99% de etanol e proceda à sonicação no sonicador de banho durante 15 min. brevemente enxaguar o rack em um copo de 400 mL cheio de 300 mL de água desionizada.
   3. Repita a etapa 2.1.2 mais duas vezes.
   4. Enxágue o rack com a lamela em 300 mL de água desionizada num copo de 400 mL por 10 min. repetir o passo mais duas vezes. Transferir o rack para um forno de 60 ° C e secar a lamela para h. 1 loja a lamela secada em um prato de Petri livre de poeira.
2. Imobilização dos grânulos fluorescentes no sentido do lamela de vidro
   1. Dilua 110 nm multi cor fluorescente grânulos em 80-fold 1 x PBS contendo 0,1 µ g / µ l BSA. Brevemente o vórtice do tubo para dispersar os agregados do grânulo. Espalhar 60 grânulos µ l diluída no sentido do Φ limpo 25mm No.1.5 vidro lamela (ver secção 2.1) utilizando uma pipeta de ponta. Secar a lamela num exsicador ligado a uma bomba de vácuo no escuro e montar a lamela numa lâmina de vidro no meio de montagem 50 µ l (consulte a etapa 1.5.4.2).

3. aquisição de imagem

Nota: GLIM requer imagens de alta relação sinal-ruído (SNR) para cálculo do centro de massa de alta precisão. A imagem pode ser adquirida por microscópios convencionais, tais como o exploração do laser confocal, microscópio confocal ou campo amplo de disco girando. Um microscópio de campo amplo, equipado com lentes de objetivas plano-apocromático e um sensor de imagem de baixo ruído, como um dispositivo de carga acoplada (CCD) e científico complementares de óxido metálico semicondutor (sCMOS) pode ser usado. Parâmetros para o sensor de imagem são ajustados para garantir uma gama dinâmica de leitura-ruído e alta baixa. O microscópio deve estar equipado com a configuração ideal dos filtros de fluorescência para verde, mCherry e far-red fluoróforo, e deve ter conversas cruzadas-fluorescência insignificante. Idealmente, o sistema da imagem latente atinge uma taxa de amostragem de Nyquist no x, eixo y e z, que normalmente requer o x, y e z de tamanho de um voxel para ser menos de 100, 100 e 200 nm, respectivamente. O x e y tamanho de voxel de sempre são igual e são referidos como pixel_size. O pixel_size pode ser calculado dividindo o tamanho do sensor de câmera pela ampliação do sistema.

1. Grânulos de cores multi imagem
   1. Grânulos de cores multi imagem nos canais verdes, vermelhos e far-red no início e no final de cada sessão de imagens.
      Nota: Aqui, imagens foram adquiridas através de um microscópio convencional campo amplo epi-fluorescência (invertido) equipado com 100 X at 1.4 plano-apocromático objetivo, palco motorizado, fonte de luz de metal haleto de 200 watts e câmera de 16 bits sCMOS. Os comprimentos de onda de excitação filtro (passa-banda), espelho dicroico (passe longo) e filtro de emissão (passa-banda) do cubo filtro canal verde são 465-495, 505 e 515-555 nm; para o cubo do filtro de canal vermelho são 528-553, 565 e 578-633 nm; e são para o cubo do filtro de canal far-red 590-650, 660 e 663-738 nm. Durante a aquisição, o tamanho de um voxel ao longo do x, y e z axis é 64, 64 e 200 nm, respectivamente.
   2. Encontre um campo de visão com densidade de bom do grânulo.
   3. Adquira pilhas de imagem 3D em verdes, vermelhos e far-red canais (canal_G, canal_R, canal_B, respectivamente). Tome 3 seções acima e abaixo o melhor plano focal (7 seções por pilha). Salve as três pilhas como três arquivos TIFF.
      Nota: O tempo de exposição para cada canal é determinado empiricamente para maximizar a gama dinâmica, evitar saturação de pixel e minimizar fotobranqueamento. Outros parâmetros, tais como filtros e o x, y e z tamanho do voxel, são escolhidos, como discutido acima.
2. Minipilhas de Golgi imagem
   1. Uso TPST1-EGFP e GalT-mCherry transfectadas e fluorescente etiquetado slides (seção 1.5) para encontrar as células que expressa TPST1-EGFP e um nível médio ou baixo de GalT-mCherry. Adquira pilhas de imagem 3D, conforme descrito na etapa 3.1.3.

4. análise de imagens

1. Adquirir centros de grânulos fluorescentes
   1. No ImageJ, abrir um conjunto de imagens de grânulo, consistindo de três arquivos TIFF (arquivo > imagem > abrir).
   2. Média de 3 seções consecutivas em torno de seu melhor focado no canal_R por imagem > pilhas > projeto Z. O número de seção de "Fatia de início" e "Stop fatia" de entrada e entre as opções de "tipo de projeção", selecione "Intensidade média".
   3. Desenhe as regiões de interesse (ROIs) que contêm sem grânulos na imagem usando "Seleções polígono". Em "Analyze > conjunto de medições", olha só o "Valor médio cinza" e o "Desvio padrão". Em seguida, executar "Analyze > medida" para obter a média e o SD do ROI.
   4. Calcular a intensidade de fundo como "médio + 6 × SD"_. Subtrair a imagem com os valores de intensidade de fundo correspondente por "processo > matemática > Subtract", o valor de intensidade de fundo correspondente a este canal de entrada.
   5. Repita etapas 4.1.2 para 4.1.4 para canal_G e pilhas de imagem de canais_B usando o mesmo iniciar e parar a fatia e o mesmo fundo ROI. Observe que o ROI usado na etapa 4.1.3 pode ser copiado para o canal_G e imagens do canal_{B .}
   6. Mesclar as imagens de fundo-subtraídos três (imagem > cor > Mesclar canais), selecionando o canal_R como vermelho,_G como verde do canal e canal_B como azul. Uma única imagem composta consistindo de três canais será obtida.
   7. Inicie o Gerenciador de ROI (Analyze > Ferramentas > Gerenciador de ROI). Desenhe um quadrado ROI em torno de grânulos único, garantindo que não há apenas uma pérola dentro de cada ROI. Adicione o ROI para Gerenciador de ROI pressionando "t" do teclado. Repita esse processo e adicionar ROIs tantos quanto possível.
   8. Em "Analyze > conjunto de medições", verificar apenas "centro de massa".
   9. Selecione o canal_R, no ROI Manager, clique em "Medir" para obter os centros; duas colunas correspondentes para x e y coordenadas dos centros de ROIs serão exibida na janela de "Resultado". Copie e cole as duas colunas em uma planilha.
   10. Repita a etapa 4.1.9 para canal_G e canal_B.
   11. Organizar as coordenadas dos centros em uma única planilha na seguinte ordem: x_R, y,_R, x_G, y,_G, x,_Be y_B. Salve a planilha no formato "CSV" como "beads.csv". Deixe nenhum espaço no nome do arquivo.
2. Selecione e medir minipilhas de Golgi
   1. Instalar duas macros (anexadas em Materiais suplementares) em ImageJ, "Inspeção de Macro-Golgi ROI" e "Dados de 3 canais de saída-Macro" por Plugins > instalar ". Clara ROI manager e janela de resultado.
   2. Abrir um conjunto de imagens de mini pilha de Golgi composto por três arquivos TIFF (arquivo > imagem > abrir).
   3. Repita as etapas 4.1.2 - 4.1.5 e salvar as imagens de fundo-subtraídos três para uso posterior. Recorde o fundo SDs para canal_R, canal_G e canal_B como SD_R, SD_G e SD_B, respectivamente, para mais tarde usar.
   4. Duplica as três imagens subtraídas de fundo geradas da etapa 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
   5. No "processo > Calculadora de imagem", primeiro adicionar o plano de fundo-subtraído do canal_G para imagens canal_R . Adicione a imagem resultante para a imagem de fundo-subtraído o canal_B . A imagem resultante, em "imagem > ajustar > limiar", selecione "definir" a entrada "1" como "Nível de limiar mais baixo". Depois de pressionar "Aplicar", uma preto e branca imagem binária é resultou.
   6. Em "Analyze > analisar partículas", o intervalo de tamanho de entrada "tamanho (pixel ^ 2)". Entrada "50-infinito". Verifique "Exclui nas bordas" e "Adicionar ao Gerenciador". ROIs contendo pilhas de Golgi mini agora são adicionados ao Gerenciador de ROI.
      Nota: A escala do tamanho deve ser determinada empiricamente a excluir os ruídos que são geralmente pequenos.
   7. Mesclar as imagens de fundo-subtraídos três (imagem > cor > Mesclar canais) da etapa 4.2.3 selecionando o canal_R como vermelho,_G como verde do canal e canal_B como azul. É gerada uma imagem composta única, consistindo de três canais.
   8. Executar a macro "Inspeção de Macro-Golgi ROI", selecionando "Plugins > inspeção Macro-Golgi ROI". Na caixa de diálogo interativo, inspecione visualmente cada ROI para manter ou rejeitá-lo. Selecione ROIs que contêm um único objeto em todos os três canais.
      Nota: Depois de executar essa ferramenta, ROIs rejeitados são eliminados do gerente do ROI.
   9. Verificar apenas "Área", "Valor de cinza médio" e "Centro de massa" "Analyze > conjunto de medições". Aquisição de dados com a ferramenta macro "Dados de 3 canais de Macrosaída" de (Plugins > Macrosaída 3 canais de dados).
      Nota: Áreas, médios intensidades e centros (x e y) de ROIs em canal_R, canal_G e canal_B são exibidos na janela de "Resultado".
   10. Cópia x e y coordenadas dos centros em uma planilha e organizá-los na seguinte ordem: x_R, y,_R, x_G, y,_G, x,_Be y_B. Salve a planilha como um arquivo "CSV" (ministacks. csv). Deixe nenhum espaço no nome do arquivo. Proceda à correção cromática-deslocamento dos centros (seção 4.3) e cálculo de QI (seção 4.4).
3. Correção cromática-deslocamento dos centros
   1. Instale o Runtime de compilador Matlab (MCR).
   2. Instalar os seguintes arquivos em uma pasta de trabalho dedicado: my_train.exe e my_test.exe. Copiar e colar "beads.csv" e"ministacks. csv" arquivos na mesma pasta.
   3. Inicie o "Prompt de comando" do Windows e vá para a pasta de trabalho, digitando o seguinte comando " cd path_of_working_folder".
   4. Gere um arquivo de calibração cromática-turno usando centros dos grânulos. Digite o seguinte comando "my_train.exe grânulosCSV calibraçãoMat 1". Um arquivo chamado"calibraçãoMat" é criado na pasta de trabalho. Ignore outros arquivos que são gerados.
   5. Corrigi o cromática-shift de centros de minipilhas de Golgi, digitando o seguinte comando "my_test.exe ministacks. csv corrected_ministacks. csv calibraçãoMat 1".
      Nota: Um arquivo chamado"corrected_ministacks. csv" é criado na pasta de trabalho. Ele contém cromático-turno corrigidas coordenadas dos centros, que são organizados na ordem de x_G, y,_G, x_B e y_B. Ignore outros arquivos que são criados. Tome nota que o canal vermelho é definido como livre de aberração cromática e, portanto, x_R e y_R são os mesmos como dados brutos.
4. Cálculo do LQs
   1. Lançar o software de análise de dados e copiar e colar, no abaixo sequência, quer dizer, áreas, valores de cinza de fundo SDs obtidos de passo 4.2.3 (colocá-los na linha 1) e cromática-shift corrigido x e y coordenadas do minipilhas de Golgi no canal_R em um planilha como colunas à E. Da mesma forma, transferi dados correspondentes para canal_G e canal_B para colunas F, J e K para O, respectivamente.
   2. Adicione oito novas colunas P a W, chamado "intensidade integrada de canal R", "intensidade integrada de canal G", "intensidade integrada de canal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (bronzeado b) e LQ.
      1. Parte superior da coluna respectiva com o botão direito e selecione "Definir valores da coluna" para calcular os valores de cada coluna. Para coluna de P, a entrada "Col(A)Col(B)"; para coluna Q, entrada "Col(F)Col(G)"; para coluna R, entrada "Col(K)Col(L)"; para coluna S, entrada "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" onde "pixel_size" é o tamanho do pixel em nm; para coluna T, entrada "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; para coluna U, entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; para coluna V, entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; coluna W, entrada "Col (T) / Col (S)".
   3. Filtro minipilhas de Golgi, os três critérios descritos na introdução.
      1. Do software de análise de dados, vá para "planilha > planilha consulta" e selecionar as variáveis de coluna para teste "If". Atribuir os seguintes aliases I1, I2, I3, d1, A e B para colunas "integrado intensidade do canal R", "intensidade integrada de canal G", "intensidade integrada de canal B", d1, ABS(tan a) e ABS (bronzeado b), respectivamente. Na "se condição" caixa de entrada "I1 > =30*cell(1,3) e I2 > =30*cell(1,8) e I3 > =30*cell(1,13) e d1 > = 70 e (A < = 0.3 ou B < = 0.3)".
      2. Selecione "Extrair para nova planilha", clique em "Aplicar". Colunas A-W de minipilhas de Golgi analisáveis são extraídos para uma nova planilha.
   4. Na nova planilha, clique direito no topo da coluna W, selecione "estatísticas sobre coluna > caixa de diálogo aberta". Seleção "Total de N", "Média", "SE de dizer", "Histogramas". A análise estatística do LQs é exibida.

Resultados

O pesquisa moderna da classe microscópio equipado com uma lente apocromático plano, como o usado em nosso laboratório, mostra uma aberração cromática mínima(Figura 2). No entanto, uma examinação cuidadosa da imagem do grânulo fluorescente multi cor pode revelar a mudança de imagens de cor diferente da mesma esfera (Figura 2B). Definimos que o canal vermelho é livre de aberração crom...

Discussão

Anteriormente, a localização de uma proteína de Golgi sob a microscopia de luz principalmente foi quantificada pelo grau de correlação ou a sobreposição da imagem da proteína com a imagem de um marcador de Golgi de localização conhecida^{15,16, 17}. A correlação resultante ou sobreposta coeficiente reflete o quão perto a proteína de teste é o marcador de Golgi espacialmente. Existem pelo menos três advertências pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody