الكشف عن الخلايا السلف محمر المانحة المتبقية بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم للمرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس

Summary

مطلوب التقدير الكمي للخلايا المستمدة من الجهات المانحة لرصد engraftment بعد زرع الخلايا الجذعية في المرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس. مزيجاً من التدفق الخلوي تقوم الخلية الفرز والمقايسة تشكيل مستعمرة والتحليل اللاحق للترادف قصيرة يكرر يمكن استخدامها لتقييم انتشار والتفريق بين فروعه في حجرة محمر.

Abstract

ويلاحظ وجود تشيميريسم غير مكتملة في نسبة كبيرة من المرضى بعد زرع نخاع العظم الثلاسيميا الكبرى أو مرض الخلية المنجلية. وهذه الملاحظة آثار هائلة، كما يمكن تحسين استراتيجيات المرباة العلاجية اللاحقة النتائج السريرية. تقليديا، يستخدم تحليل يستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتحديد تشيميريسم في خلايا الدم المستمدة من الجهات المانحة. بيد أن هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا المنواه ولا يميز بين الأنساب خلية واحدة معزولة. ونحن تطبيق تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتدفق الخلايا السلف المكونة للدم سيتوميتريك فرز ومقارنة ذلك مع تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب التي تم الحصول عليها من وحدة تشكيل انفجر مختارة-المستعمرات محمر، سواء التي تم جمعها من العظم نخاع. بهذه الطريقة نحن قادرون على إثبات انتشار مختلفة والتفريق بين الخلايا المانحة في حجرة محمر. هذا الأسلوب مؤهلاً لاستكمال الرصد الحالية من تشيميريسم في زرع الخلايا الجذعية الإعداد وبالتالي قد تكون الدراسات السريرية في المستقبل التطبيقية وأبحاث الخلايا الجذعية وتصميم تجارب العلاج بالجينات.

Introduction

زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة (هسكت) هو النهج العلاجية متوفرة فقط لمجموعة متنوعة من الاضطرابات الوراثية فطرية للنظام المكونة للدم، وتحقيق معدلات البقاء خالية من المرض لأكثر من 90% لالا شديدة الخطر و ¹من المرضى الحياة محدودة. وقد تم تحسين فعالية هذه الأداة العلاجية الهامة عن طريق الحد من سمية قبل-وبعد زرع الأنظمة العلاجية²، ولكن أيضا من التدخلات الرامية إلى الحفاظ على وظيفة مستقرة الفساد، الذي هو كمياً بالرصد الدقيق ل الخلايا المستمدة من المانحين^3،،من⁴⁵.

بشكل عام، تشيميريسم كاملة (CC) يعني استبدال مجموع من حجرة ليمفوهيماتوبويتيك بالخلايا المستمدة من الجهات المانحة، في حين يستخدم مصطلح مختلطة تشيميريسم (MC) عندما تكون الخلايا المستمدة من الجهات المانحة والمستفيدة الحالية في وقت واحد في مختلف نسب. تقسيم تشيميريسم (SC) يدل على التعايش بين تشيميريسم المختلطة التي لوحظت في الأنساب خلية واحدة، كما هو الحال في حجرة محمر. سرعة البت في وضع تشيميريسم عقب هسكت أمر بالغ الأهمية، كما أنها قد تساعد في تحديد المرضى عرضه للانتكاس المرض واستراتيجيات immunomodulatory اللاحقة بدء، مثل المانحين اللمفاويات دفعات أو الحد من كآبته ⁶من العلاجات.

وقد وضعت عدة أساليب لرصد engraftment بعد هسكت. إيسوتيبينج المناعية وتحليل cytogenetics حساسية فقيرة ومحدودة من حيث قدرتها على الكشف عن تعدد الأشكال^7،8. الأخذ بتهجين الفلورسنت في الموقع (الأسماك) يمكن تعزيز الحساسية في رصد تشيميريسم بعد هسكت، ولكن يقتصر على الجنس متطابقة اللوجرافتس⁹. في الوقت الراهن، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الأسلوب الأكثر انتشارا المستخدمة للكشف عن تشيميريسم، وهو يستند إلى التقليدية [اغروس]-الاكريلاميد جل التفريد ليكرر جنبا إلى جنب رقم متغير (فنترس) أو تكرار قصيرة جنبا إلى جنب (المشبوهة). تستخدم بشكل روتيني PCR الكمي قادراً على الكشف عن نسبة ضئيلة للغاية من خلايا المانحين المتبقية بعد هسكت. القيد الرئيسي للدراسات حتى الآن هو أن الكشف MC يكاد يقتصر على وجود الخلايا المنواه، بدلاً من الكريات الحمراء الناضجة، إلا وهي الخلايا أن وظيفيا حاسمة بالنسبة للمرضى الذين يتأثرون هيموجلوبينوباثيس. في المرضى الذين يعانون من مختلف فصائل الدم، فإنه يجدر بنا أن نتذكر أن التحليل سيتوفلوروميتريك غير قادرة على تحديد تشيميريسم في خلايا الدم الحمراء باستخدام الأجسام المضادة الموجهة نحو المستضدات كرات الدم الحمراء أبو وج، ج، د، ه، وه^{10 , 11}-وسائل مختلفة، ولكن مثيرة جداً للاهتمام لتقييم تشيميريسم في النسب محمر هو المزيج من تدفق سيتوميتريك فرز موروث محمر ومختارة من مختلف أنواع السلف محمر باستزراع في فحوصات كلونوجينيك، يتبع بتحليل لشارع¹². هذا النهج قادرة على قياس الارتفاع النسبي للمانح-مقابل-المتلقي تشيميريسم في حجرة محمر ويمكن استخدامها في الاستراتيجية الرامية إلى إدامة الفساد نخاع العظام.

Protocol

1-"عزل خلايا نخاع العظام المكونة للدم" عن طريق تنشيط Fluorescence معلمة متعددة "الخلية فرز"

1. تلطيخ عينة
   1. قبل البدء في العملية، تحتاج إلى البنود التالية التي سيتم جمعها وأعد:
      1. وسائط متدرجة لإعداد وحيدات النوى الخلايا (جنرال موتورز)، 50 مل مخروطية أنابيب
      2. أنابيب تدفق 12 × 75 مم لتلطيخ الخلايا
      3. Staining المخزن المؤقت: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 3% مصل العجل الجنين (FCS)
      4. الماصات
      5. FC كتلة وتلطيخ أجسام مضادة (CD34 APC، CD36 فيتك، V450 CD45، دينار بحريني العلوم البيولوجية). مع هذا الجمع fluorochrome هناك لا تذكر امتداده إلى قنوات أخرى، ولكن أي تركيبة fluorochrome مناسبة أخرى ومن المحتمل أيضا.
      6. حبات التعويض (إذا لزم الأمر)
      7. تعليق المخزن المؤقت: هانك ' s حل متوازن الملح (حبس) + 25 مم حبيس + FCS 3%
      8. تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير
      9. أنابيب جمع: أي المتوسطة الغنية بأنابيب المصل عالية (الذي يحتوي على 1 مل FCS + 25 مم حبيس) يمكن أن تستخدم لجمع الخلايا مفروزة.
      عينة
      10. نخاع العظام: المستنيرة لخزعة نخاع العظم من الحرقفي في الجزء الخلفي عظم الفخذ مطلوب عادة. عينة نخاع العظم مما أبقى في الحقن هيبارينيزيد في الرايت حتى تلطيخ. يتم تنفيذ الخطوات التالية البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة ' s لجنة أخلاقيات البحوث البشرية لرفاه الإنسان.
   2. توليد تعليق خلية واحدة فقط من عينة نخاع العظم. أضف 3 مل من جنرال موتورز إلى أنبوب الطرد المركزي. طبقة مل 4 من تعليق خلية مفردة على الحل الآلية العالمية بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 550 غ لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية (ج) (الفرامل يتم إيقاف تشغيل). رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية ماصة معقمة، تاركاً طبقة الخلايا وحيدات النوى دون عائق في الواجهة باستخدام. نقل طبقة الخلايا وحيدات النوى إلى أنبوب عقيمة للطرد مركزي باستخدام ماصة معقمة.
   3. بعد الغسيل مع مل 5 تلطيخ المخزن المؤقت، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لتعليق 2 مل وتحديد تركيز الخلية. 5 مكان ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب اختبار ملولبة. إضافة ميليلتر 95 من 0.2% تريبان الأزرق وصمة عار. مزيج دقيق. السماح إلى الوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملء هيموسيتوميتير أما بالنسبة لخلية العد. تحت مجهر، نلاحظ إذا كان غير قابل للحياة ملطخة وحساب الخلايا قادرة على البقاء-
   4. الطرد المركزي الخلايا في غ 250 لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في تلطيخ المخزن المؤقت بتركيز يصل إلى 1 × 10 ⁶ لكل 100 ميليلتر.
   5. FcR كتلة باستخدام 2.5 ميكروغرام كتلة Fc الواحدة 1 × 10 ⁶ خلايا على الجليد ل 10-15 دقيقة
   6. إضافة مزيج مناسب من 10 ميكروغرام ماب وصمة عار 1 × 10 ⁶ خلايا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، تليها خطوة غسيل مع مل 3 تلطيخ المخزن المؤقت. لتعويض الصحيح، ملطخة مختبرين صغيرة من الخلايا (أو يفضل التعويض الخرز) مع واحد من الأجسام المضادة كل؛ واحد قاسمة المتبقية أونستينيد.
   7. ضبط التركيز إلى 20 × 10 ⁶ خلايا/مل.
   ويصل
   8. مجموعة الأمثل فارز الخلية. عملية إنشاء تدفق سيتوميتير والبرمجيات هي موحدة مع تعليمات مفصلة قدمتها الشركة والاحتياجات التي ينبغي أن تؤديها إلى أفراد مدربين تدريبا مناسباً.
2. الفرز على فارز خلية
   1. إعداد أنابيب جمع من الخطوة 1.1.1.9.
   2. إعداد قالب يحتوي على مؤامرة المتغيرين لعرض المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC).
   3. تشغيل الخلايا وضبط منتدى التعاون الأمني/SSC لوضع سكان اهتمام بمقياس
   4. سجل أنبوب مراقبة سلبية.
   5. تشغيل أنابيب التحكم إيجابية واحدة؛ وتسجيل البيانات لكل أنبوبة.
   6. حساب التعويض أما يدوياً أو تلقائياً مع الدالة المقدمة من البرنامج اقتناء.
   7. الحصول على العينة التجريبية، وبوابة لهم على المتغيرين منتدى التعاون الأمني/SSC دوت قطعة ( الشكل 1A) لتضمين الخلايا اللمفاوية والنقوي على حد سواء. استبعاد دوبليتس والمجاميع بمقارنة الإشارات المختلفة من منتدى التعاون الأمني (أي والارتفاع والعرض والمنطقة) ( الشكل 1B). تصور الخلايا القميص على مؤامرة دوت المتغيرين عرض CD45 و CD36 ( الشكل 1). الأحداث الإيجابية ل CD45 leucocytes (بما في ذلك المتكفل بهم)، وتلك السلبية ل CD45 وهي إيجابية بالنسبة CD36 المتكفل محمر. استخدام أدوات النابضة لتعريف CD36 + (إذا كان مطلوباً، هذه الخلايا يمكن كذلك تقسيم CD36 عالية ومنخفضة إذ تعرب عن الخلايا) والخلايا CD45 +. تصور أحداث CD45 + في آخر الأرض دوت عرض معلمات CD34، والتعاون بين بلدان الجنوب. استخدام النابضة أدوات لتعريف CD34 + الخلايا (الكريات البيض فروعه) وال SSC عالية الخلايا (الخلايا النقوي في مراحل مختلفة من التمايز).
   8. متى تحددت البوابات، البوابات يمكن تحديده للفرز في أنابيب جمع خارجي-
   9. المضي قدما مع الفرز عند 4 درجة مئوية حتى تم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا
   10. القيام بتحليل ما بعد فرز لتحديد نقاء الخلية فرز السكان ( الشكل 1E، 1F).

2. الإنزيم كلونوجينيك

1. إعداد الكواشف
   قبل البدء في هذه العملية، تحتاج العناصر التالية جمعها وإعداد:
   1. الماصات ولوحات 100 مم
   2. تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير
   3. إعادة تشكيل الاريثروبويتين الماشوب البشري (EPO) في U/mL 500 في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على مالا يقل عن 0.1% ألبومين المصل البشري. تقسيم هذا الحل إلى مختبرين الصغيرة وتبقى في-20 درجة مئوية لتجنب تجميد أذاب المتكررة.
   4. تحضير إكمال Iscove ' s دولبيكو التعديل ' s المتوسطة (إيمدم) مع التركيزات النهائية من السفح 5%، 2 مم الجلوتامين، 100 وحدة/مل البنسلين/ستربتوميسين (PS). إضافة البشري الماشوب الاريثروبويتين (EPO) بتركيزات مختلفة في آبار منفصلة للمتوسط إيمدم كاملة: 3 وحدات المكتب الأوروبي للبراءات/حسنا، 6 وحدات المكتب الأوروبي للبراءات/جيدا و 12 مكتب البراءات الأوروبي وحدات/جيدا (1 x, 2 x, 4 x EPO على التوالي)-
2. إعداد خلايا نخاع العظم
   1. 10 مل عينة نخاع العظم تضعف مع 20 مل برنامج تلفزيوني يتم ببطء طبقات أعلى 15 مل الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل مخروطية، الحفاظ على واجهة واضحة بين المرحلتين، وكنت nder ظروف معقمة. ثم الطرد المركزي أنابيب مخروطية الشكل 15 مل في 550 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع تسارع على النحو 9 والتباطؤ في تعيين ك 0 (أو الفرامل قبالة).
   2. بعد الطرد المركزي، إزالة الواجهة في أنبوب 50 مل جديدة وإضافة برنامج تلفزيوني لوحدة تخزين نهائي من 50 مل.
   3. بعد الطرد المركزي مع 250 غرام لمدة 10 دقائق في 10 درجة مئوية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المتوسط إيمدم كاملة في حوالي 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل. تأخذ 10 ميليلتر من تعليق خلية في microtube وتخلط مع نفس الحجم من محلول تريبان الأزرق (0.4%) والعد باستخدام هيموسيتوميتير.
   4. سبشونال: هي إثراء CD34 + الخلايا بالخلية المغناطيسية الفرز مع الخرز CD34 ميلتيني وفقا للتعليمات الصادرة عن التصنيع. والميزة الرئيسية لهذه الخطوة تخصيب اليورانيوم هو الكشف عن نوعية الخلايا الجذعية المكونة للدم، والتي تزرع في مصفوفة شبه صلبة أضيف مع 50 نانوغرام/مل الخلايا الجذعية عامل (SCF)، 20 نانوغرام/مليلتر بلعم المحببات محفزة لمستعمرة عامل (GM-CSF)، 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين-3 (إيل-3) 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين-6 (إيل-6)، عامل تحفيز مستعمرة المحببات 20 نانوغرام/مليلتر (ز-CSF) وتركيزات مختلفة 3 من مكتب البراءات الأوروبي كما هو الحال في 1.4.
   5. تمييع الخلايا إلى 0.1-0.15 × 10 ⁶ وحيدات النوى خلايا/مل أو 2 × 10 ³ CD34 ⁺ خلايا/مل بإضافة كاملة إيمدم المتوسطة وتستكمل مع ميليلتر 300 البراءات ونقل إلى 3 مل المتوسطة H4434 ميثوكولت. بعد الانفعالات وحضانة قصيرة للوحة 5 دقيقة ثلاث مرات 1.1 مل على طبق 35 ملم. اثنان من هذه الأطباق الثقافة إلى جانب ثالث-مليئة بالمياه-وتوضع في لوحات 100 مم-
   6. هي الخلايا المستزرعة في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع 5% CO ₂ لمدة 14 يوما-
3. تحليل مستعمرات
   1. وسجل المستعمرات وفقا التشكل مع مجهر مقلوب في 40 X التكبير في صحن ثقافة ملحوظ مع شبكة التهديف. لأغراض الفحص لدينا، وتصنف الوحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي) في 4 فئات: السلف مولتيبوتينتيال الخلايا (زيمبابوي-جيم)، خلايا السلف بلعم المحببات (زيمبابوي-جنرال موتورز)، انفجر تشكيل وحدة-محمر (أولما-E) ومستعمرة تشكيل وحدة-محمر (زيمبابوي-E). راجع الشركة المصنعة ' s التعليمات لمزيد من مستعمرة سوبكلاسيفيكيشن.
   2. لمزيد من التحليل، الخلايا من لوحة المقايسة زيمبابوي يتم استرداد كل على حدة وفقا للفئات 4 تعليق في درجة حرارة الغرفة 4 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% FCS/إيمدم. بعد الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، حراكه في برنامج تلفزيوني الخلايا وحسابها ومعالجتها لاستخراج الحمض النووي-

3. تحليل تشيميريسم

1. عزل الحمض النووي
   1. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 400 غرام للحد الأدنى 10
   2. "عزل الحمض النووي" استخدام دم طقم استخراج الحمض النووي (أدوات استخراج كيمب الحمض النووي الدم). قبل الحارة شطف المخزن المؤقت (AE) عند 37 درجة مئوية لتعزيز العائد من الحمض النووي التيد.
   3. قياس تركيز الحمض النووي مع شحني الأطياف ND نانودروب-1000. وتستخدم عينات مع 260/280 OD بين 1.8 2.0 لمزيد من التحليل.
   4. "الحمض النووي تضعف" مع دناسي مجاناً ح ₂ س إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر في إجمالي حجم 50 ميليلتر.
2. STR-تحليل
   1. إقامة تفاعل PCR بمزج خليط من رد الفعل، أمبلتاق الذهب دنا بوليميريز والتعريف بالإضافة إلى تعيين التمهيدي مع 20 ميليلتر الحمض النووي (0.1 نانوغرام/ميليلتر) وفقا للدليل (يحتوي على عدة التمهيدي الإشعال غير المسماة في المخزن المؤقت لتضخيم المكاني شارع D3S1358، الإرشاد، فجا، D8S1179، D21S11، D18S51، D5S818، D13S317، و D7S820، وأميلوجينين ماركر بين الجنسين). وتشمل المياه خالية من نوكلياسي كالمراقبة السلبية و 9947A كمراقبة إيجابية. قبل زرع الحمض النووي من الجهات المانحة والمتلقية على السواء مدرجة أيضا.
   2. "بكر القيام" رد فعل استخدام التدرج ماستيرسيكلير ايبندورف مع الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 11 دقيقة، تليها دورات التضخيم 28 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة, 59 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية ل 45 دقيقة
   3. مجموعة أعلى جزء تحليل رد فعل إضافة 12 ميليلتر فورماميد دي مرحبا و 0.5 ميليلتر "جينيسكان 500 روكس الحجم القياسي" (جميع النظم البيولوجية التطبيقية) إلى 1 ميليلتر من منتج PCR. مطلوب في المركز الأول والأخير "سلم الاليلي" (أمبير جينوتيبير فلوريدا شارع الأزرق والثانية الأخضر والأصفر، النظم البيولوجية التطبيقية)-
   4. تبدأ الصك التفريد الكهربي واقتناء.
   5. "تحليل المكاني"، الآليلات ومرتفعات الذروة للعينات والضوابط مع البرمجيات ¹³-

النتائج

الفصل بين فروعه ليمفوهيماتوبويتيك بنظام مراقبة الأصول الميدانية الخلية الفرز

نحن هنا إظهار النتائج من فرز السكان خلية اللازمة لتحليل تقارير عن المعاملات المشبوهة المتلقين للمعلومات. خلايا نخاع العظام كانت ملطخة CD45 المضادة مت?...

Discussion

وهدف الدراسة الحالية تقديم مزيج من النهجين الجمهور لتحليل تشيميريسم الجهات المانحة والمتلقية في فروعه محمر بعد هسكت في المرضى علاج هيموجلوبينوباثيس: 1.) الأسفار تنشيط الخلية الفرز خلايا السلف المكونة للدم في عينات نخاع العظم متبوعاً بتحليل ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب و 2). وحدة تشكيل مستعمرة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR