זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

Summary

כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.

Abstract

הנוכחות של chimerism לא שלם הוא לציין אחוז גדול של חולים לאחר השתלת מח עצם תלסמיה הגדולות או מחלה חרמשית. התבוננות זו השלכות עצומות, כפי immunomodulation טיפולית עוקבות אסטרטגיות יכול לשפר את התוצאה הקלינית. כמקובל, ניתוח המבוסס על תגובת שרשרת פולימראז של טנדם קצר חזרה משמש לזיהוי chimerism בתאי הדם נגזר התורם. עם זאת, שיטה זו מוגבל לתאים nucleated, מסוגל להבחין בין שושלות תא בודד חלופה מועדפת. אנו החלת הניתוח של טנדם קצר חזרה לזרום ממוין cytometric hematopoietic ובתאים, לעומת זה הניתוח של חזרה קצרה טנדם המתקבל שנבחר להיוות פרץ יחידה - מושבות erythroid, שניהם שנאסף העצם מח. בשיטה זו אנו מסוגלים להפגין את התפשטות שונה ואת התמיינות תאי התורם בתוך התא erythroid. טכניקה זו זכאי להשלמת ניטור הנוכחי של chimerism ב השתלת תא גזע הגדרת וייתכן לפיכך מחקרים קליניים עתידיים יישומית, מחקר תאי גזע ועיצוב של ג'ין טיפול משפטי.

Introduction

השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic (HSCT) היא גישה המרפא זמין רק עבור מגוון רחב של הפרעות גנטיות מולדת של המערכת hematopoietic, להשגת שיעורי ההישרדות ללא מחלה של למעלה מ-90% עבור אחרת מאוד בסכנה, מטופלים חיים מוגבל¹. היעילות של כלי טיפולי חשוב זה הותאם על ידי הגבלת הרעילות של טרום-שלאחר ההשתלה משטרי², אך גם על ידי התערבויות שמטרתה לקיים תפקוד שתל יציב, אשר הוא לכמת על ידי מעקב צמוד של תאי התורם-derived^3,4,5.

באופן כללי, בו מלאה chimerism (CC) מרמז על התחליף הכולל של תא lymphohematopoietic על ידי התורם-derived תאים, ואילו המונח מעורב chimerism (MC) משמש כאשר תאי התורם, נמען-נגזר נוכחים בו זמנית שונות הפרופורציות. פיצול chimerism (SC) מציין קיום של מעורבות chimerism הנהוגות שושלות מתא בודד, כגון בתוך התא erythroid. בקש התאקלמות chimerism בעקבות HSCT היא קריטית, כמו זה יכול לעזור לזהות חולים חשופה התדרדרות המחלה, אסטרטגיות immunomodulatory הבאים אתחול, כמו חליטות לימפוציט התורם או הפחתת לדיכוי המערכת החיסונית טיפולים⁶.

פותחו מספר שיטות לניטור engraftment לאחר HSCT. Isotyping של immunoglobulins וניתוח של ציטוגנטיקה יש רגישות המסכן, מוגבלים ביכולתם לזהות פולימורפיזם^7,8. המבוא של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) יכול לשפר רגישות בפיקוח chimerism לאחר HSCT, אך מוגבלת תואמים-סקס allografts⁹. כיום, תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא השיטה הנפוצה ביותר המשמשים לזיהוי chimerism והוא מבוסס על agarose קונבנציונלי-אקרילאמיד בג'ל של משתנה מספר טנדם חזרה (VNTRs) או טנדם קצר חוזר (STRs). בשימוש שגרתי PCR כמותי הוא מסוגל לזהות של אחוז קטן מאוד של תאים שיורית התורם בעקבות HSCT. המגבלה העיקרית של המחקרים עד כה הוא כי זיהוי MC מוגבל באופן כמעט בלעדי על נוכחות של תאים nucleated, יותר מאשר בוגר אריתרוציטים, כלומר תאים כי מבחינה פונקציונלית מכריע עבור חולים הושפעו פתולוגיות של המוגלובין. בחולים עם קבוצות דם שונות, אך חשוב לזכור כי ניתוח cytofluorometric הוא מסוגל לזהות chimerism בתאי דם אדומים על ידי ניצול נוגדנים חד-שבטיים מכוונים כדוריות דם אדומות אנטיגנים ABO ו- C, c, D, E ו- e^{10 , 11}. אמצעי שונה, אבל מאוד מעניין הערכת chimerism בשושלת erythroid הוא השילוב של זרימה cytometric מיון של אבות erythroid, מבחר סוגים שונים של קדמון erythroid לפי culturing במבחני clonogenic, בעקבות ניתוח של סטראדה¹². גישה זו היא היכולת לכמת כמויות יחסיות של chimerism התורם-נגד-נמען בתא erythroid, עשוי להיות מנוצל האסטרטגיה כדי לקיים את השתלת מח עצם.

Protocol

1. בידוד של Hematopoietic תאים במח העצם על ידי מופעל מרובה פרמטר קרינה פלואורסצנטית מיון תא

1. מכתים מדגם
   1. לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריכים להיות שנאספו מוכן:
      1. צבע מדיה עבור הכנת תאי תאי (GM), 50 מ ל חרוט צינורות
      2. 12 x 75 מ מ צינורות זרימה עבור צביעת תאים
      3. Staining מאגר: פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) + 3% עגל עוברית סרום (FCS)
      4. פיפטות < /l אני >
      5. FC לחסום ו מכתים נוגדנים (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD החיים). עם השילוב fluorochrome והתאמת זניח לתוך ערוצים אחרים, אבל כל שילוב fluorochrome מתאימים אחרים אפשרי גם.
      6. חרוזים פיצוי (במקרה הצורך)
      7. מאגר ההשעיה: האנק ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS) + 25 מ מ HEPES + 3% FCS
      8. Trypan blue ו- hemocytometer
      9. צינורות איסוף: ניתן להשתמש בכל אמצעי עשיר עם צינורות גבוהה סרום (מכיל 1 מ"ל FCS + 25 מ מ HEPES) עבור האוסף של תאים ממוינים.
      מדגם
      10. מח עצם: הסכמה מדעת עבור ביופסיה מח עצם מן האגן של החלק האחורי של עצם הירך נדרש בדרך כלל. המדגם מח עצם הוא יותר שמרה במזרקים heparinized ב RT עד מכתים. בשלבים הבאים פרוטוקול מבוצעות בהתאם להנחיות של המוסד ' ועדת האתיקה האנושית מחקר s לרווחת האדם.
   2. ליצור השעיה תא בודד של המדגם מח עצם. להוסיף 3 מ"ל של ג'נרל מוטורס הצינור צנטריפוגה. בזהירות שכבה mL 4 של התליה תא בודד על הפתרון GM. צנטריפוגה-550 גרם במשך 30 דקות ב 20 ° צלסיוס (C) (בלם מבוטלת). צייר של השכבה העליונה המכיל פלזמה ולבנים וטסיות דם באמצעות פיפטה סטרילי, עוזב את שכבת תאי תא ללא הפרעה על הממשק. להעביר את שכבת תאי תאי שפופרת צנטרפוגה סטרילי באמצעות פיפטה סטרילי של.
   3. אחרי כביסה עם 5 מ"ל מכתים מאגר, resuspend את התאים במאגר ההשעיה 2 מ"ל ולקבוע את הריכוז תא. מקום 5 µL תא השעיה במבחנה פקקי בורג. הוסף µL 95 של 0.2% Trypan blue כתם. מערבבים ביסודיות. אפשר לעמוד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מילוי של hemocytometer לגבי ספירת תאים. תחת מיקרוסקופ, להתבונן אם כלכלית מוכתמים ולספור את התאים קיימא.
   4. Centrifuge התאים ב- 250 גרם 10 דקות ב- 20 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, התאים מכתים מאגר-ריכוז של עד 1 x 10 ⁶ לכל 100 µL resuspend.
   5. בלוק ה-FcR על ידי שימוש µg 2.5 בלוק Fc לכל עונה 1 פרק 10 תאים ⁶ על קרח במשך 10-15 דקות
   6. הוסף השילוב המתאים של 10 µg mAb כתם עונה 1 פרק 10 ⁶ תאים ו תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך, ואחריו צעד כביסה עם 3 מ"ל מכתים מאגר. פיצויים הנכון, מוכתמים aliquots קטן של תאים (או רצוי חרוזי פיצוי) יחיד נוגדנים לכל; aliquot אחת שנותרה וללא רבב.
   7. להתאים את הריכוז 20 x 10 ⁶ תאים/מ ל....
   8. סט למעלה ולמטב את סדרן התא. התהליך של הגדרת זרימת cytometer עם תוכנה יתוקנן עם הוראה מפורטת שמספקת החברה וצריך להתבצע על ידי צוות מיומן כראוי.
2. מיון ב סדרן התא
   1. להכין אוסף טורפדו מהשלב 1.1.1.9.
   2. להגדיר תבנית הכולל מגרש bivariate להצגת פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס).
   3. להפעיל את התאים ולהתאים FSC/האס להצבת האוכלוסייה עניין בקנה מידה
   4. להקליט את הצינור שליטה שלילי.
   5. להפעיל את הצינורות בקרה חיובית בודדת; לרשום את הנתונים לכל שפופרת.
   6. לחשב פיצוי באופן ידני או באופן אוטומטי עם הפונקציה המסופקים על ידי רכישת התוכנה-
   7. לרכוש מדגם ניסיוני, שער אותם על bivariate FSC/האס נקודה מגרש ( איור 1 א') כדי לכלול תאים לימפוציטית והן מיאלואידית. אל תכלול doublets ו אגרגטים על-ידי השוואת האותות שונים של FSC (קרי, גובה, רוחב ואזור) ( איור 1B). דמיינו את התאים גופיה על מגרש נקודה bivariate הצגת CD45 ו CD36 ( איור 1C). אירועים חיוביים עבור CD45 הם leucocytes (כולל אבות שלהם), אלה שלילי CD45 חיובי עבור CD36 שבאוכלוסיה erythroid. השתמש המגביל כלים להגדרת CD36 + (אם הרצויה, תאים אלה ניתן לחלק נוספת ב CD36 גבוהה לבטא נמוך תאים) ו- CD45 + תאים. דמיינו CD45 + אירועים בעלילה נקודה נוספת הצגת פרמטרי CD34 והאס. שימוש gating כלים להגדרת CD34 + תאים (ליקוציט אבות) ותאים האס גבוהה (התאים מיאלואידית בשלבים שונים של בידול).
   8. , ברגע שנקבע גייטס, השערים ניתן לבחור לצורך מיון לתוך צינורות איסוף חיצוני.
   9. להמשיך עם מיון ב 4 ° C עד המספר הנדרש של תאים התקבל
   10. לבצע ניתוח שלאחר מיון כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיות תאים ממוינים ( איור 1E, 1F).

2. Clonogenic Assay

1. הכנה של ריאגנטים
   לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריך להיות שנאספו והכין:
   1. מדי סוכר, 100 מ מ צלחות
   2. Trypan blue ו- hemocytometer
   3. לשקם אריתרופויאטין רקומביננטי אנושי (EPO) ב- U/mL 500 ב- PBS סטרילי המכיל לפחות 0.1% אלבומין אנושי. לחלק את הפתרון הזה aliquots קטן ולשמור ב-20 ° C כדי להימנע ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
   4. הכן להשלים Iscove ' s שונה Dulbecco ' s בינוני (IMDM) עם ריכוזים הסופי של 5% FCS, 2 מ מ גלוטמין, 100 יחידות/mL פניצילין/סטרפטומיצין (PS). להוסיף האנושי אריתרופויאטין רקומביננטי (EPO) בריכוזים שונים בבארות נפרד המדיום IMDM מלאה: 3 יחידות EPO/טוב, 6 יחידות EPO/טוב, 12 EPO יחידות/טוב (1 x, 2 x, 4 x EPO בהתאמה).
2. הכנה של תאים במח העצם
   1. 10 מ"ל של המדגם מח עצם מדולל עם 20 מ ל PBS מוצבות לאט מעל 15 מ"ל צפיפות בינונית הדרגתיות צינור חרוטי 50 מ ל, שמירה על ממשק ברור בין את שני השלבים אוי בתנאים סטריליים. ואז centrifuge 15 mL הצינורות חרוט ב 550 גרם x במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם הגדר 9 האצה והאטה בתפאורת 0 (או בלם לבטל).
   2. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הממשק לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף PBS נפח סופי של 50 מ ל.
   3. לאחר צנטריפוגה עם 250 גרם 10 דקות ב 10 ° C להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום IMDM מלאה כ 0.5 x 10 ⁶ תאים למ"ל. לקחת 10 µL של התליה תא microtube, לערבב באותו אמצעי אחסון של פתרון Trypan blue (0.4%), נחשב שימוש hemocytometer.
   4. Optional: תאי CD34 + מועשרים ידי תא מגנטי מיון עם חרוזים Milteny CD34 על פי ההוראות שניתנו על ידי הייצור. היתרון העיקרי של שלב זה העשרה הוא לזהות את האיכות של תאי גזע hematopoietic, אשר גדלים על מטריצה מוצק למחצה נוסף עם 50 ng/mL תאי הגזע מקדם (SCF), 20 ng/mL גרנולוציט-מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF), 20 ng/mL אינטרלוקין-3 (IL-3), ng/mL 20 interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL גרנולוציט המושבה-מגרה פקטור (G-CSF) ו 3 ריכוזים שונים של EPO כמו 1.4.
   5. לדלל את התאים כדי 0.1 - 0.15 x 10 ⁶ תאי תאים למ"ל או 2 x 10 ³ CD34 ⁺ תאים למ"ל על-ידי הוספת בינוני IMDM מלאה בתוספת EPO והעברה µL 300 מ ל 3 Methocult H4434 בינונית. לאחר ודאגה דגירה קצרה עבור 5 דקות צלחת שלוש פעמים 1, 1 mL בצלחת 35 מ מ. שני הכלים האלה תרבות לצד שלישי - מלא במים - מוצבים לוחות 100 מ מ.
   6. תאים מתורבתים ב חממה humidified 37 ° C עם 5% CO ₂ למשך 14 ימים.
3. ניתוח של המושבות
   1. המושבות אתה צובר על פי המורפולוגיה שלהם עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 40 בקערה תרבות המסומנים רשת הבקיע. למטרות שלנו assay, היחידות ויוצרים מושבה (CFU) מסווגים לקטגוריות 4: multipotential ובתאים (CFU-GEMM), ובתאים גרנולוציט-מקרופאג (CFU-GM), פרץ ויוצרים יחידה-erythroid (BFU-E) והמושבה ויוצרים יחידת-erythroid (CFU-E). לראות את יצרן ' s הנחיות נוספות המושבה subclassification.
   2. לצורך ניתוח נוסף, התאים מהצלחת assay CFU התאוששו בנפרד לפי קטגוריות 4 על ידי השעיית הטמפרטורה בחדר 4 מ"ל PBS המכיל 2% FCS/IMDM. לאחר צנטריפוגה-400 גרם 10 דקות ב 4 ° C, התאים resuspended ב- PBS, ספרתי הינם מעובד להפקת DNA-

3. ניתוח של Chimerism

1. בידוד ה-DNA
   1. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה-400 גרם במשך 10 דקות
   2. DNA לבודד באמצעות בדיקת דם ערכת חילוץ דנ א (ערכת חילוץ QIAmp דנ א דם). לחמם את המאגר • תנאי (AE) ב 37 ° C כדי לשפר את התשואה של דנ א eluted.
   3. מודדים את ריכוז הדנ א עם Nanodrop ND-1000 ספקטרה photometer. דוגמאות עם יתר 260/280 בין 1.8-2.0 משמשים לצורך ניתוח נוסף.
   4. DNA לדלל עם DNAase חינם H ₂ O ל- ng/µL 0.1 ב הנפח הכולל של 50 µL-
2. STR-אנליזה
   1. להגדיר את תגובת ה-PCR על ידי ערבוב תערובת התגובה, AmplTaq זהב DNA פולימראז ולקבוע Profiler פלוס תחל עם הדנ א 20 µL (0.1 ng/µL) על פי המדריך (ערכת פריימר מכיל ללא תווית תחל במאגר כדי להגביר את לוקוסים סטראדה D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, amelogenin סמן את המגדר). כוללים מים נטולי נוקלאז כפקד שלילי 9947A כפקד חיובי. לפני השתלת DNA התורם והן לנמען הינם כלולים גם.
   2. התגובה לבצע PCR באמצעות גלאים mastercycler מעבר צבע עם התנאים הבאים: 95 ° C עבור 11 דקות, 28 מחזורים הגברה של 95 ° C עבור 1 דקות, 59 ° C עבור 1 דקות ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, ולאחריו 60 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות
   3. קבע את הרסיס התגובה ניתוח על-ידי הוספת 12 µL Hi-Di Formamid ו- 0.5 µL GeneScan 500 רוקס בגודל סטנדרטי (ביוסיסטמס חלה כל) כדי µL 1 של מוצר ה-PCR. על המיקום הראשון והאחרון הסולם Allelic (כח Genotyper פל סטראדה כחול, ירוק II וצהוב, מתריעות חלה) יש צורך.
   4. להתחיל אלקטרופורזה ורכישה עם המכשיר אלקטרופורזה.
   5. לוקוסים לנתח, אללים, שיא לגבהים של הפקדים עם תוכנה ¹³ ודוגמאות.

תוצאות

הפרדת אבות lymphohematopoietic על-ידי מיון תא FACS

נדגים כאן תוצאות מיון האוכלוסיות תא הדרושים לניתוח סטראדה במורד הזרם. תאים במח העצם היו מוכתמים מצומדת V450 anti-CD45, FITC מצומדת אנטי-CD36, אנטי-CD34 מצומדת-APC. האוכלוסייה של עניין הוא התאים אבות (חבר ה?...

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי היא כדי לספק לקהל שילוב של שתי גישות ניתוח chimerism התורם/נמען בבית אבות erythroid בעקבות HSCT בחולים שטופלו על פתולוגיות של המוגלובין: 1.) תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון של hematopoietic ובתאים דגימות מח עצם שלאחריה יבוא ניתוח של חזרה טנדם קצר ו- 2.) המושבה יוצרי יחידת גידול של תאי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR