赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

要約

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。

要約

不完全なキメリズムの存在は、鎌状赤血球症やサラセミア メジャーの骨髄移植後の患者の大きい割合で示されます。この観測は、以降治療免疫戦略は、臨床結果を改善することができます大きな影響です。従来、短いタンデム繰り返しのポリメラーゼ連鎖反応に基づく解析を使用して、ドナー血液細胞のキメリズムを識別します。ただし、このメソッドは、有核細胞に制限されて、解離の単一セル血統を区別できません。フローサイトメトリーによるソートの造血前駆細胞を流れる短いタンデム繰り返しの解析を適用し、骨採集両方選択したバースト形成ユニット - 赤芽球コロニーから得られた短いタンデム繰り返しの分析とこれを比較して骨髄。この方法で我々 は異なる増殖と赤芽球のコンパートメントのドナー細胞の分化を実証することが。この技術は現在設定幹細胞移植におけるキメリズムの監視を完了する資格が、将来的に臨床応用の研究、幹細胞研究と遺伝子治療臨床試験のデザインになる可能性があります。

概要

同種造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) はさまざまな高い危害の無病生存率 90% 以上を達成するため、造血系の先天性の遺伝疾患でのみ利用可能な治癒アプローチと人生限られた患者¹。この重要な治療ツールの有効性は、制限前の毒性によって最適化されている-レジメン²、移植後、閉じるモニタリングによる定量化は、安定した機能を維持を目的とした介入によってもドナー由来細胞の^3,の^4,5。

一般に、完全キメリズム (CC) ドナー由来細胞によるリンパ ・血液新生コンパートメントの総入れ替えを意味混合キメリズム (MC) という用語は、ドナーと受信者由来細胞が様々 な同時に存在する場合に使用されます。プロポーション。分割キメリズム (SC) は、赤芽球のコンパートメントで単一細胞系統の観察混合キメリズムの共存を示します。造血幹細胞移植後キメリズム ステータスの迅速定量は病気再発と開始以降免疫調節戦略、ドナーのリンパ球輸注や免疫抑制の減少などの影響を受けやすい患者を識別することがありますので、重要です。治療⁶。

いくつかの方法は、造血幹細胞移植後の生着を監視するために開発されています。免疫グロブリンのアイソタイプ識別と細胞遺伝学の分析感度が悪いとポリモーフィズム^7、8を検出する機能が制限されます。蛍光その場で交配 (魚) の導入は、造血幹細胞移植後キメリズムのモニタリングで感度を向上させることができますが、セックスの不一致移植⁹に制限されています。現在、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のキメリズムの検出に使われる最も普及している方法で、変数数タンデム繰り返し (繰り返し) の従来の agarose アクリルアミド電気泳動に基づくまたは短いタンデム繰り返し (Str)。日常的に使用される量的な PCR は造血幹細胞移植に続く残留ドナー細胞の非常に小さい割合を検出することができます。研究の主な制限は、これまでのところは、MC 検出が成熟した赤血球は有核の細胞の存在にほとんど専ら制限されて、すなわち細胞が患者の機能的に重要な発生する赤血球の溶血です。顕解析は c、D、E、および e¹⁰赤血球抗原 ABO と C に向けモノクローナル抗体を用いた赤色の血液細胞のキメリズムを識別することを思い出して価値がある別の血液型と患者の^,11. 赤芽球系列のキメリズムの評価の異なる、しかし、非常に興味深い手段は流れフローサイトメトリーは、クローンのアッセイでの培養赤芽球系前駆細胞と赤芽球前駆細胞の様々 な種類の選択の並べ替えの組み合わせSTR¹²の分析が続きます。このアプローチは、赤芽球コンパートメントでドナーと受信者のキメリズムの相対的な割合を計測することは、骨髄移植を維持するために戦略に活用することがあります。

プロトコル

1 です複数パラメーター蛍光活性化細胞選別による造血骨髄細胞の分離

プロセスを開始する前に サンプル染色
2. 、次の項目は、収集する必要が。準備:
3. 12 × 75 mm フロー チューブの汚損のための細胞
の
4. 核の準備のためグラデーション メディア細胞 (GM)、50 mL コニカル チューブ
1. 染色バッファー: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 3% 牛胎児血清 (FCS)
2. ピペット
3. FC ブロックと染色抗体 (CD34 APC、CD36 FITC、CD45 V450 BD バイオ サイエンス)。この螢光色素の組み合わせで他のチャンネルにごくわずかの波及があるが、その他の適切な螢光色素の組み合わせも可能です
。
4. 補償ビーズ (必要に応じて)
5. 懸濁液バッファー: ハンク ' s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% の FCS
6. トリパン ブルーと検定
7. コレクション チューブ: 細胞のコレクションの高い血清チューブ (1 mL FCS + 25 mM HEPES を含む) と、豊富な媒体を使用できます
。
8. 骨髄サンプル: 腰の骨の背面の腸骨から骨髄生検のためのインフォームド コンセントが一般的に必要です。骨髄サンプルがより染色まで RT でヘパリン注射器で保管です。次のプロトコル手順を実行機関のガイドラインに準拠して ' s 人間福祉人間研究倫理委員会
。
5. 骨髄のサンプルの単一細胞懸濁液を生成します。GM の 3 mL を遠心管に追加します。慎重に GM ソリューションに単一細胞懸濁液 4 mL をレイヤーします。550 g で 20 ° 摂氏 (C) で 30 分間遠心 (ブレーキをオフ)。プラズマと界面単核細胞層を妨げられていない残して、滅菌ピペットを使用して血小板を含む上側のレイヤーの描画します。滅菌ピペットを使用して滅菌遠心管に単核細胞の層を転送します
。
6. 染色バッファー 5 mL で洗浄した後、2 mL の懸濁液のバッファーに細胞を再懸濁します、細胞濃度を決定します。スクリュー キャップ テスト チューブに細胞懸濁液の場所 5 μ L。0.2% トリパン ブルー染色の 95 μ L を追加します。ミックス徹底的。室温で 5 分間立つことを割り当てください。細胞数については検定をご記入ください。顕微鏡で観察非実行可能な場合は、染色および実行可能なセルを数える
。
7. で 20 ° C で 10 分間 250 g 細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、100 μ L あたり最大 1 x 10 ⁶ の濃度のバッファーを染色の細胞を再懸濁します
。
8. 2.5 μ g で 10-15 分間氷の上 1 x 10 の ⁶ セルごとに Fc ブロックの使用によってブロック FcR
3 ml のバッファーを染色洗浄工程に続いて
9. 追加 10 μ g mAb の適切な組み合わせを 1 x 10 の ⁶ セルを汚し、暗闇の中の 4 ° C で 20 分間インキュベートします。正しい補償のため細胞 (またはできれば補償ビーズ) の小さい因数がそれぞれの単一の抗体で染色します。無染色の残り 1 つの因数
。
10. 20 × 10 ⁶ セル/mL の濃度を調整します
。
11. セットとセルソーターを最適化します。流れの cytometer とソフトウェアの設定のプロセスは会社によって提供される詳細な命令で標準化されて、適切に訓練を受けた専門家によって実行される必要があります
。
1. セルソーターの並べ替え
   1. ステップ 1.1.1.9 からコレクション チューブを用意します
   。
   2. (FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) を表示する 2 変量プロットを含むテンプレートを設定します
   。
   3. セルを実行し、FSC/SSC には規模で興味の人口の場所を調整します
   4. ネガティブ コントロール チューブを記録します
   。
   5. 1 つの肯定的な制御管を実行; 各チューブのデータを記録します
   。
   6. 集録ソフトウェアによって提供される機能を手動でまたは自動的に賠償額を計算します
   。
   7. 実験的サンプルを取得し、2 変量 FSC/SSC ドット プロット ( 図 1 a) リンパ性と骨髄性のセルを含めるためにゲートのそれら。FSC (すなわち 高さ、幅、および地域) の異なる信号を比較することによってダブレットと集計を除外する ( 図 1 b)。CD45 と CD36 表示変量ドット プロットに一重項細胞を可視化する ( 図 1)。イベント CD45 陽性、白血球 (その祖先を含む)、それらは負の CD45 の CD36 の正は赤芽球系前駆細胞。CD36 + (もし、必要に応じてこれらの細胞分類できます CD36 高で、低を表現する細胞) を定義するゲーティング ツールと CD45 陽性細胞を使用します。CD45 + CD34 と SSC のパラメーターを表示する別のドット プロットでイベントを可視化します。CD34 陽性細胞 (白血球前駆細胞) と SSC 高細胞 (骨髄性細胞分化の各段階で) 定義するツールをゲーティング使用します
   。
   8. 外部コレクション チューブに並べ替えゲート ゲートを確認すると、選択できます
   。
   9. 必要なセル数を取得するまで 4 ° C で並べ替えを続行
   10. ソートされた細胞集団 ( 図 1E、1 f) の純度を決定する並べ替え後の分析を実行します
   。

2。クローン形成法

1. 試薬の調製
   プロセスを開始する前に、次の項目を収集し、準備必要があります:
   1. トリパン ブルー色素と検定
   2. ピペット、100 mm の版
   3. を再構成少なくとも 0.1% を含む滅菌 PBS で 500 U/mL で人間の遺伝子組換えエリスロポエチン (EPO) ひと血清アルブミン。小さい因数にこのソリューションを分割し、凍結融解の繰り返しを避けるために-20 ° C で維持します
   。
   4. 準備完了 Iscove ' s 修正ダルベッコ ' s を最終濃度 5% の FCS、2 mM グルタミン、100 単位/ml ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) の培地 (IMDM)。完全の IMDM 培地に独立した井戸で異なる濃度でヒト組換型エリスロポエチン (EPO) を追加: 3 台 EPO/まあ、6 ユニットと EPO 12/EPO ユニット/ウェル (1 x, 2 x, 4 x EPO それぞれ).
2. 骨髄細胞の準備
   1. 10 mL を 20 mL の PBS で希釈した骨髄サンプルにゆっくりと 15 mL 密度勾配媒体 2 つのフェーズと明確なインターフェイスを維持する 50 mL の円錐管に重ねるnder 無菌状態。9 として設定加速度と減速 0 (ブレーキを) として設定室温 (RT) で 30 分間 550 x g で 15 mL の円錐管を遠心します
   。
   2. 遠心分離の後新しい 50 mL のチューブにインターフェイスを削除し、50 mL の最終巻に PBS を追加します
   。
   3. 250 g 10 ° C で 10 分間遠心分離後、上清を除去し、約 0.5 × 10 ⁶ セル/mL で完全 IMDM 培地で細胞を再懸濁します。マイクロ チューブに細胞懸濁液の 10 μ L を取る、トリパン ブルー溶液 (0.4%) の同じ量混ぜて、診断を数える
   。
   4. Optional: Milteny CD34 ビーズ製造によって与えられた指示に従って並べ替え磁気細胞 CD34 陽性細胞が濃縮します。この濃縮のステップの主な利点は 50 ng/mL 幹細胞因子 (SCF) 20 ng/mL 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) 20 ng/mL で追加した半固体マトリックスで栽培されている造血幹細胞の品質を検出するには1.4 のように EPO の 3 濃度 20 ng/mL 顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、20 ng/mL インターロイキン 6 (IL-6) 3-インターロイキン (IL-3).
   5. 希釈 0.1 - セル 0.15 x 10 の ⁶ 単核細胞/mL または 2 x 10 ³ CD34 ⁺ Methocult H4434 培地 3 mL に EPO と転送 300 μ L を添加した細胞/ml 完全 IMDM 培地を追加することによって。撹拌し 5 分板 3 の短い潜伏時間 1, 1 後 35 mm ディッシュの mL。第三 - 水 - でいっぱいの文化料理、これらの 2 つは、100 mm の版に配置されます
   。
   6. 14 日間 5% CO ₂ と加湿の 37 ° C のインキュベーターで培養されるセルです
   。
3. 植民地の解析
   1. その形態によると得点グリッド付け培養皿で 40 倍の倍率で倒立顕微鏡と植民地を獲得しています。4 つのカテゴリーに分類されます我々 の分析のために、コロニー形成単位 (CFU): 多分化能幹細胞 (CFU ジェム)、顆粒球・ マクロファージ系前駆細胞 (CFU-GM)、バースト形成ユニット-赤芽球 (BFU E) とコロニー形成単位赤血球 (CFU-E)。製造元を参照してください ' s についてさらにコロニー下位分類します
   。
   2. の詳細な分析、CFU アッセイ プレートから細胞により回収されて別に 4 つのカテゴリーによると 4 mL 室温 2% を含む PBS で中断する FCS/IMDM。4 ° C で 10 分間 400 g で遠心分離後、セルの PBS で再停止される、カウント、および DNA の抽出のための処理です
   。

3。キメリズム解析

1. 1. ペレットで 400 g で 10 分間の遠心分離によって細胞
   の DNA の隔離
   2. 血 DNA 抽出キット (QIAmp DNA 血液抽出キット) を使用して特定の DNA。あらかじめ溶離された DNA の収量を高めるために 37 ° C で溶出バッファー (AE) をウォームします
   。
   3. は、ND Nanodrop 1000 スペクトル光度計と DNA 濃度を測定します。さらに分析用サンプルと OD 260/280 1.8 2.0 間
   。
   4. DNAase 無料 H ₂ O 50 μ L の総ボリュームで 0.1 ng/μ L の DNA を希釈します
   。
2. STR 分析
   1. 反応混合物、AmplTaq 金 DNA ポリメラーゼとプロファイラー プラス プライマー セット 20 μ L の DNA とを混合することによって PCR の反作用を設定 (0.1 ng/μ L)、マニュアルによると (プライマー キットが含まれています、STR 遺伝子座 D3S1358、女性組合、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、および D7S820、および性別マーカー アメロゲニンを増幅するバッファーでラベル付けされていないプライマー)。ヌクレアーゼ フリー水をネガティブ コントロールとして、肯定的な制御として 9947A が含まれます。中古移植ドナーとレシピエントの両方から DNA が含まれています
   。
   2. エッペン mastercycler グラデーションを使用して以下の条件で行う PCR の反作用: 11 分、95 ° C 1 分、59 ° C 1 分、72 ° C 1 分、95 ° C の 28 の増幅サイクルに続いて 45 分の 60 ° C
   12 μ L を追加することによってフラグメントを
   3. セット分析反応やあ・ ディ ・ Formamid と 0.5 μ L GeneScan 500 ROX サイズ標準 (すべてアプライドバイオシステムズジャパン) 1 μ L の PCR の製品を。最初と最後の位置で (Genotyper アンプ Fl STR 青、グリーン II、黄色、アプライドバイオシステムズジャパン) Allelic 梯子が必要です
   。
   4. 電気泳動装置、電気泳動および集録を開始します
   。
   5. 分析遺伝子、対立遺伝子、サンプルおよびコントロール ソフトウェア ¹³ とのピーク高さ
   。

結果

FACS セルを並べ替えることでリンパ ・血液新生前駆細胞の分離

ここから下流の STR 分析のための必要な細胞集団を並べ替え結果を示す.骨髄細胞は、V450 標識抗 CD45、FITC 結合抗 CD36 APC 共役抗 CD34 と染色された.興味の人口は巨核球赤芽球系前駆細胞 (MEP)、核細胞赤血球の開発を担当です。これらの細胞は CD36、?...

ディスカッション

現在の研究の目的は、赤血球の溶血の治療を受けた次の造血幹細胞移植患者における赤芽球前駆細胞のドナー/受信者キメリズムの分析のための 2 つの方法を組み合わせて観客を提供するためにある: 1.) 蛍光活性化細胞ソーティング造血前駆細胞の骨髄サンプル短いタンデム繰り返しの 2 分析続く。)コロニー形成単位の成長, 骨髄細胞の前駆細胞各種におけるコロニーの分類は続く短いタンデ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR