Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías

Resumen

Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.

Resumen

La presencia de quimerismo incompleto se observa en una gran proporción de pacientes después de trasplante de médula ósea para la talasemia mayor o enfermedad de células falciformes. Esta observación tiene enormes consecuencias, como estrategias de inmunomodulación terapéutica posterior pueden mejorar el resultado clínico. Convencionalmente, análisis reacción-basado cadena de la polimerasa de repeticiones en tándem cortas se utiliza para identificar el quimerismo en las células sanguíneas derivadas de donantes. Sin embargo, este método está restringido a las células nucleadas y no puede distinguir entre linajes unicelular disociados. Aplicamos el análisis de repeticiones en tándem cortas de células progenitoras hematopoyéticas ordenados por citometría de flujo y esto comparado con el análisis de repeticiones en tándem cortas de ráfaga-formación seleccionada - colonias eritroides, ambos recogidos del hueso médula ósea. Con este método que son capaces de demostrar los diferentes proliferación y diferenciación de células del donante en el compartimiento eritroide. Esta técnica es elegible para completar el seguimiento actual de quimerismo en el trasplante de células madre que se ajuste y por lo tanto puede ser aplicados estudios clínicos en el futuro, la célula de vástago investigación y diseño de ensayos de terapia genética.

Introducción

Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el enfoque curativo sólo está disponible para una variedad de trastornos genéticos innatos del sistema hematopoyético, lograr tasas de supervivencia libre de enfermedad de más del 90% de lo contrario altamente comprometida y vida útil limitada de pacientes¹. La eficacia de esta importante herramienta terapéutica ha sido optimizada por limitar la toxicidad de pre- y post-trasplante regímenes², pero también por las intervenciones encaminadas a mantener la función estable del injerto, que se cuantifica por la vigilancia estrecha de células procedentes de donantes^3,4,5.

En general, quimerismo completo (CC) implica la sustitución total del compartimiento del lymphohematopoietic por células derivadas del donante, mientras que el término mezclado chimerism (MC) se utiliza cuando las células derivadas del donante y del receptor están simultáneamente presentes en varios proporciones. Quimerismo dividido (SC) denota la coexistencia del chimerism mezclado observado en linajes unicelular, como en el compartimento eritroide. Determinación rápida del estado de quimerismo después de HSCT es crítica, como puede ayudar a identificar a los pacientes susceptibles de recaída de la enfermedad y estrategias de iniciar posteriores inmunomoduladores, como infusiones de linfocitos de donante o la reducción de inmunosupresores terapias⁶.

Varios métodos han sido desarrollados para supervisar el engraftment después de HSCT. Isotyping de las inmunoglobulinas y el análisis de citogenética tienen pobre sensibilidad y están limitados en su capacidad para detectar polimorfismo^7,8. La introducción de fluorescente en situ del hibridación (pescado) puede mejorar la sensibilidad en el seguimiento de quimerismo después de HSCT, pero se limita a aloinjertos no coinciden el sexo⁹. Actualmente, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es el método más generalizado para detectar chimerism y está basada en electroforesis del gel de agarosa-acrilamida convencional de repeticiones en tándem número variable (VNTRs) o repeticiones de corto tándem (STRs). Rutinariamente utilizado PCR cuantitativa es capaz de detectar una proporción muy pequeña de células de donantes residual después de HSCT. La limitación principal de los estudios hasta ahora es que MC detección se limita casi exclusivamente a la presencia de células nucleadas, en lugar de eritrocitos maduros, es decir, las células funcionalmente crucial para los pacientes afectado por hemoglobinopatías. En pacientes con grupos sanguíneos diferentes, cabe recordar que el análisis de cytofluorometric es capaz de identificar el quimerismo de células de sangre rojas mediante la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los antígenos de eritrocitos ABO y C, c, D, E y e^{10 , 11}. un medio diferente, pero muy interesante de evaluación de quimerismo en el linaje eritroide es la combinación de flujo cytometric selección de progenitores eritroides y selección de diversos tipos de progenitoras eritroides por cultivo en análisis clonogenic, seguido por el análisis de STR¹². Este enfoque es capaz de cuantificar las proporciones relativas de quimerismo de donante y receptor en el compartimiento eritroide y puede ser utilizado en la estrategia para sostener el injerto de médula ósea.

Protocolo

1. aislamiento de células hematopoyéticas de la médula ósea por clasificación de células activado por fluorescencia multiparámetro

1. muestra tinción
   1. antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
      1. medios de gradiente para la preparación de mononucleares células tubos (GM), cónico 50 mL
      2. tubos de flujo de 12 x 75 mm para la tinción de las células
      3. tampón de tinción: tampón de fosfato salino (PBS) + 3% de suero de ternero fetal (FCS)
      4. pipetas < / l i >
      5. FC bloque y tinción de anticuerpos (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Con esta combinación de fluorocromo hay derrame insignificante en otros canales, pero cualquier otra combinación de fluorocromo adecuado también es posible.
      6. Cuentas de compensación (si es necesario)
      7. Tampón de suspensión: Hank ' s solución sal balanceada (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. Azul de tripán y hemocitómetro
      9. Tubos de colección: cualquier medio rico con tubos de alto del suero (que contiene 1 mL FCS + 25 mM HEPES) puede ser utilizado para la colección de células ordenadas.
      10. Médula ósea muestra: consentimiento informado para la biopsia de médula ósea de la cresta ilíaca de la parte posterior del hueso es normalmente necesario. La muestra de médula ósea es que mantuvo en jeringa heparinizada en RT hasta manchas. Los pasos del Protocolo se realizan cumpliendo con las directrices de la institución ' Comité de ética de investigación de s para el bienestar humano.
   2. Generar una suspensión unicelular de la muestra de médula ósea. Añadir 3 mL de GM para el tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa 4 mL de la suspensión de células individuales en la solución de GM. Centrifugar a 550 g por 30 min a 20 ° Celsius (C) (freno está desactivado). Drenaje de la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas con una pipeta estéril, dejando la capa de células mononucleares sin perturbaciones en la interfase. Transferir la capa de células mononucleares a un tubo de centrífuga estéril utilizando una pipeta estéril.
   3. Después del lavado con 5 mL de tampón de tinción, resuspender las células en 2 mL de tampón de suspensión y determinar la concentración de la célula. Lugar 5 μl de la suspensión celular en un tubo de ensayo de tapón de rosca. Agregar 95 μl de tinción Trypan azul de 0.2%. Mezclar bien. Deje para reposar por 5 min a temperatura ambiente. Llenar un hemocitómetro para recuento celular. Bajo el microscopio, observar si no viables se tiñen y contar las células viables.
   4. Centrifugar las células a 250 g por 10 min a 20 ° C, desechar el sobrenadante y resuspender las células en tinción buffer a una concentración de 1 x 10 ⁶ por 100 μl.
   5. Bloque de FcR por el uso de 2,5 μg bloque Fc por 1 x 10 ⁶ células en hielo durante 10-15 minutos
   6. Agregar la combinación adecuada de 10 μg mAb mancha 1 x 10 ⁶ células e incubar por 20 min a 4 ° C en la oscuridad, seguido por un paso de lavado con 3 mL de tampón de tinción. Correcta compensación, pequeñas alícuotas de células (o preferentemente cuentas de compensación) se tiñen con anticuerpos individuales cada uno; una alícuota restante sin mancha.
   7. Ajustar la concentración a 20 x 10 ⁶ células/mL.
   8. Set arriba y optimiza el clasificador de células. El proceso de creación de un citómetro de flujo y software estandarizado con una instrucción detallada de la compañía y debe ser realizado por personal adecuadamente capacitado.
2. Clasificación en el clasificador de células
   1. preparar los tubos para recogida de paso 1.1.1.9.
   2. Configurar una plantilla que incluye un diagrama bivariante forward scatter (FSC) y de dispersión lateral (SSC).
   3. Funcionamiento de las células y ajustar FSC/SSC para la población de interés a escala
   4. Grabar el tubo de control negativo.
   5. Ejecutar los tubos solo control positivo; registro de datos para cada tubo.
   6. Calcular la compensación manual o automáticamente con la función proporcionada por el software de adquisición de.
   7. Adquirir la muestra experimental y puerta en bivariado FSC/SSC punto parcela ( figura 1A) para incluir células linfocíticas y mieloides. Excluir dobletes y agregados a comparando las diferentes señales del FSC (es decir, altura, anchura y área) ( figura 1B). Visualizar las células de la camiseta en una parcela de punto bivariado con CD45 y CD36 ( figura 1). Son positivas para CD45 leucocitos (incluyendo sus progenitores), ésos negativo para CD45 y progenitores eritroides son positivas para el CD36. Utilizar herramientas bloquea definir CD36 + (si se desea, estas células se pueden dividir más lejos en CD36 alta y baja expresando las células) y células CD45 +. Visualizar eventos de CD45 + en otra parcela de punto Mostrar parámetros de CD34 y SSC. Uso herramientas para definir las células CD34 + (progenitores del leucocito) y SSC alta (células mieloides en distintas etapas de diferenciación) que bloquean.
   8. Una vez se han determinado puertas, las puertas pueden seleccionarse para clasificar en externos tubos.
   9. Proceda con la clasificación a 4 ° C hasta obtener el número de células
   10. Realizar un análisis de la clase para determinar la pureza de las poblaciones de células ordenadas ( Figura 1E, 1F).

2. Análisis clonogenic

1. preparación de los reactivos
   antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
   1. pipetas, placas de 100 mm
   2. azul tripán y hemocitómetro
   3. reconstituir eritropoyetina humana recombinante (EPO) a 500 U/mL en PBS estéril que contiene menos de 0.1% de albúmina sérica humana. Esta solución se dividen en pequeñas partes alícuotas y mantener a-20 ° C para evitar la congelación y descongelación repetida.
   4. Prepare completa Iscove ' s Modified Dulbecco ' s medio (IMDM) con concentraciones finales de 5% FCS, 2 mM glutamina, 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina (PS). Añadir eritropoyetina humana recombinante (EPO) a diferentes concentraciones en pocillos distintos al medio IMDM completado: 3 unidades EPO/pozo, 6 unidades EPO/pozo y 12 EPO unidades/bien (1 x, x 2, 4 x EPO respectivamente).
2. Preparación de células de médula ósea
   1. 10 mL de la muestra de médula ósea diluir con 20 mL de PBS lentamente capas en la parte superior medio gradiente de densidad de 15 mL en un tubo cónico de 50 mL, mantener la interfaz clara entre las dos fases y nder las condiciones de esterilidad. Luego centrifugar los tubos cónicos de 15 mL 550 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) como 9 aceleración y desaceleración como 0 (o freno de).
   2. Después de la centrifugación, retirar la interfaz en un nuevo tubo de 50 mL y añadir PBS hasta un volumen final de 50 mL.
   3. Después de la centrifugación con 250 g por 10 min a 10 º C, retirar el sobrenadante y resuspender las células en el medio IMDM completo en aproximadamente 0,5 x 10 ⁶ células/mL. Tomar 10 μl de la suspensión de células en un microtubo, mezclar con el mismo volumen de solución de azul de tripán (0.4%) y cuenta con un hemocitómetro.
   4. OFacultativo: las células de CD34 + se enriquecen con magnético celular clasificación con Milteny CD34 granos según las instrucciones dadas por el fabricante. La principal ventaja de esta etapa de enriquecimiento es detectar la calidad de las células madre hematopoyéticas, que se cultivan en una matriz semisólida con 50 factor ng/mL de células madre (SCF), 20 ng/mL del granulocyte-macrófago colonia-factor estimulante (GM-CSF), 20 ng/mL Interleucina-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), factor estimulante de colonias 20 ng/mL del granulocyte (G-CSF) y 3 diferentes concentraciones de EPO en 1.4.
   5. Diluir las células de 0.1 - 0.15 x 10 ⁶ células/mL mononucleares o 2 x 10 ³ CD34 ⁺ células/mL mediante la adición de medio IMDM completo suplementado con EPO y la transferencia de 300 μl a 3 mL de medio Methocult H4434. Después de agitación y una incubación corto de 5 minutos la placa tres veces 1, 1 mL en un plato de 35 mm. Dos de estos platos de cultura junto a un tercero - con agua - se colocan en placas de 100 mm.
   6. Las células se cultivan en una incubadora humidificada 37 ° C con 5% CO ₂ para 14 días.
3. Análisis de colonias
   1. colonias se calificó según su morfología con un microscopio invertido con 40 aumentos en un plato de cultura marcado con una cuadrícula de puntuación. Para los efectos de nuestro análisis, las unidades formadoras de colonias (UFC) se clasifican en 4 categorías: células multipotential del progenitor (UFC-GEMM), las células progenitoras del granulocyte-macrófago (UFC-GM), estallan formando unidad-eritroides (BFU-E) y formadoras unidad-eritroides (CFU-E). Ver fabricante ' instrucciones para la subclasificación de Colonia más.
   2. Para su posterior análisis, las células de la placa de ensayo de UFC se recuperan por separado según las 4 categorías suspensión a temperatura de 4 mL PBS con un 2% FCS/IMDM. Después de la centrifugación a 400 g durante 10 min a 4 ° C, las células se resuspendió en PBS, contadas y procesadas para la extracción de ADN.

3. Análisis de quimerismo

1. De ADN
   que
   1. sedimenten las células por centrifugación a 400 g durante 10 min.
   2. Aislar ADN utilizando un kit de extracción de ADN (QIAmp DNA sangre kit de extracción) de la sangre. Precalentar el buffer de elución (AE) a 37 ° C para mejorar el rendimiento de ADN eluída.
   3. Medir la concentración de ADN con Nanodrop ND-1000 espectro fotómetro. Se utilizan muestras con OD 260/280 entre 1.8-2.0 para su posterior análisis.
   4. ADN diluir con ADNasa libre H ₂ O a 0.1 ng/μl de un volumen total de 50 μl.
2. STR-análisis
   1. configurar la reacción de PCR mezclando la mezcla de reacción, AmplTaq Gold ADN polimerasa y Profiler Plus Primer Set con 20 μl de ADN genómico (0.1 ng/μL) según el manual (el primer kit contiene la sin etiqueta cartillas en tampón de amplificación de los loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 y D7S820 y el género marcador amelogenina). Incluyen agua libre de nucleasa como control negativo y 9947A como control positivo. ADN antes del trasplante de donante y receptor son también incluido.
   2. Reacción de realizar PCR utilizando gradiente de mastercycler Eppendorf con las siguientes condiciones: 95 ° C durante 11 minutos, 28 ciclos de amplificación de 95 ° C por 1 min, 59 ° C por 1 min y 72 ° C por 1 min, seguido de 60° C durante 45 min
   3. Set up fragmento reacción de análisis mediante la adición de 12 μl Hi-Di Formamid y 0,5 μl GeneScan 500 ROX tamaño estándar (todas Applied Biosystems) 1 μl del producto de PCR. A la primera y la última posición se necesita una escalera alélica (Genotyper Amp Fl STR azul, II verde y amarillo, Applied Biosystems).
   4. Comenzar la electroforesis y adquisición con el instrumento de electroforesis.
   5. Analizar los Loci, alelos y alturas del pico de las muestras y los controles con el software ¹³.

Resultados

Separación de progenitores lymphohematopoietic por clasificación de celular FACS

Aquí demostramos resultados de clasificación de las poblaciones celulares necesarios para posteriores análisis de STR. Células de médula ósea fueron manchadas con V450 conjugado anti-CD45 FITC conjugado anti-CD36 y conjugado con APC anti-CD34. La población de interés es de las megacariocitos progenitores (MEP), nucleadas l...

Discusión

El objetivo del actual estudio es proporcionar al público una combinación de dos enfoques para el análisis de quimerismo donante/receptor en progenitores eritroides después de HSCT en pacientes trataron por Hemoglobinopatías: 1.) clasificación celular activado por fluorescencia de células progenitoras hematopoyéticas en muestras de médula ósea seguidas de análisis de repeticiones en tándem cortas y 2.) Unidad Formadora de colonias de crecimiento de las células de la médula ósea, clasificación de las colon...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR