Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

Özet

Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.

Özet

Eksik chimerism varlığı kemik iliği nakli için büyük talasemi veya orak hücre hastalığı hastaların büyük bir kısmı belirtilmektedir. Sonraki terapötik immunomodulation stratejileri-ebilmek geliştirmek klinik sonuç olarak bu gözlem çok büyük etkileri vardır. Geleneksel, Polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analizini kısa tandem tekrarlar donör kaynaklı kan hücrelerinde chimerism tanımlamak için kullanılır. Ancak, bu yöntem çekirdekli hücrelere sınırlıdır ve Disosiye tek hücreli soy arasında ayrım yapamaz. Biz kısa tandem tekrarlar akış sitometrik sıralanmış hematopoetik progenitör hücre analizi uygulanmış ve bu seçili veri bloğu oluşturan biriminden - erythroid koloniler, elde edilen kısa tandem tekrarlar hem kemik toplanan analizi ile karşılaştırıldığında kemik iliği. Bu yöntem ile farklı yayılması ve donör hücreleri erythroid yerde farklılaşma göstermek edebiliyoruz. Bu teknik chimerism ayarlama kök hücre nakli yapılan geçerli izleme tamamlamak uygundur ve böylece uygulanan gelecekte klinik çalışmalar, kök hücre araştırma ve tasarım gen terapisi denemelerin olabilir.

Giriş

Allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) olduğunu aksi takdirde son derece tehlikeye için hastalıksız sağkalım oranları daha--dan %90 ulaşmak, hematopoetik sistem doğuştan genetik bozukluklar çeşitli için yalnızca kullanılabilir şifalı yaklaşım ve hayat-sınırlı hastalar¹. Bu önemli tedavi aracı etkinliği öncesi toksisite sınırlayarak optimize edilmiştir- ve sonrası rejimleri²nakli, ama aynı zamanda kararlı greft işlevi sürdürülmesi hedef alan müdahaleler tarafından hangi sayısal yakın izleme tarafından donör kaynaklı hücreler^3,4,5.

Zaman donör ve alıcı türetilmiş hücre çeşitli bir de aynı anda mevcut chimerism (MC) karışık terimi kullanılır, ancak genel olarak, tam chimerism (CC) lymphohematopoietic bölme donör kaynaklı hücreler tarafından toplam yedek anlamına gelir Oranlar. Split chimerism (SC) karışık chimerism erythroid bölümünde gibi tek hücreli soy gözlenen birlikteliği ifade eder. Hastaların hastalık nüks ve donör lenfosit infüzyon veya immünsüpresif azaltılması gibi başlatmak sonraki immunomodulatory stratejileri için duyarlı belirlemek yardımcı gibi chimerism durum HKHT aşağıdaki komut istemi belirlenmesi önemlidir terapiler⁶.

Engraftment HKHT sonra izlemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Isotyping immünglobulin ve sitogenetik analiz zavallı hassasiyet var ve çok biçimlilik^7,8algılamak için onların yetenek sınırlıdır. Floresan situ hibridizasyon (balık) giriş hassasiyeti chimerism HKHT sonra izleme geliştirebilirsiniz ama seks uyumsuz allogrefler⁹' a sınırlı. Şu anda, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) chimerism algılamak için kullanılan en yaygın yöntemdir ve değişken sayı tandem yineler (VNTRs) geleneksel özel-Akrilamid Jel Elektroforez üzerinde dayanır veya kısa tandem (STRs) tekrarlar. Rutin olarak kullanılan kantitatif PCR HKHT takip kalan donör hücreleri son derece küçük bir oranda tespit edebilmektedir. Önemli çalışmalar defa kısıtlamasıdır MC algılama olgun eritrositler yerine çekirdekli hücrelerin varlığı neredeyse sadece sınırlı, yani işlevsel olarak hastalar için önemli Hemoglobinopati tarafından etkilenir hücreleri. Farklı kan grupları bulunan hastalarda, cytofluorometric analiz chimerism kırmızı kan hücrelerinde monoklonal antikorlar eritrosit antijenleri doğru ABO ve C, c, D, E ve e¹⁰ yönetmen kullanarak tespit edebilmek olduğunu hatırlamaya değer olduğunu ^{, 11}. chimerism erythroid Silsilesi içinde değerlendirilmesi farklı, ama çok ilginç bir araç akış sitometrik erythroid ataları ve erythroid yaratıcı çeşitli yelpazesi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri kültür tarafından boylama kombinasyonudur STR¹²analizi ile izledi. Bu yaklaşım donör ve alıcı chimerism erythroid yerde göreli oranları ölçmek yapabiliyor ve kemik iliği nakli sürdürebilmek için strateji kullanılmaktadır.

Protokol

1. yalıtım, hematopoetik kemik iliği hücreleri çok parametreli Floresans aktif hücre sıralama tarafından

işlemi başlamadan önce
1. 1. örnek boyama, aşağıdaki öğeler gerekir tahsil edilecek ve hazır:
      1. (GM), 50 mL konik tüpler degrade medya mononükleer hazırlanması için hücreleri
      2. boyama için 12 x 75 mm akış tüpler hücreleri
      3. Staining arabellek: fosfat tamponlu tuz (PBS) + % 3 fetal buzağı serum (FCS)
      4. Pipetler < / l Ben >
      5. FC blok ve antikor (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences) boyama. Bu fluorochrome birlikte diğer kanallar içine ihmal edilebilir yayılma yoktur ancak diğer uygun fluorochrome kombinasyon mümkündür.
      6. Tazminat boncuk (gerekirse)
      7. Süspansiyon arabellek: Hank ' s dengeli tuz çözüm (HBSS) + 25 mM HEPES + % 3 FCS
      8. Trypan mavi ve hemasitometre
      9. Koleksiyonu tüpler: zengin herhangi bir ortamda yüksek serum tüpler (içeren 1 mL FCS + 25 mM HEPES)-ebilmek var olmak kullanılmış için sıralanmış hücreler topluluğu.
      10. Kemik iliği örnek: kalça kemiği arkasında iliyak kret gelen kemik iliği biyopsisi için onay genellikle gereklidir. Kemik iliği heparinized şırınga RT, boyama kadar muhafaza daha örneğidir. Protokolü aşağıdakileri kurum kurallarına uygun olarak gerçekleştirilen ' s insan araştırma Etik Komitesi insan refahı için.
   2. Bir tek hücre süspansiyon kemik iliği örneği oluşturur. GM 3 mL santrifüj tüpü ekleyin. Dikkatle tek hücre süspansiyon GM çözüm üzerine 4 mL katman. 20 ° c (C), 30 dk için 550 g, santrifüj (fren devre dışı). Plazma ve mononükleer hücre katmanı arayüzü bozulmamış terk steril bir pipet kullanarak trombosit içeren üst tabakasının çizin. Mononükleer hücre tabakası steril bir pipet kullanarak bir steril santrifüj tüpü transfer.
   3. 5 mL ile tampon boyama yıkama sonra 2 mL süspansiyon arabellek hücrelerde resuspend ve hücre konsantrasyonu belirlemek. Hücre süspansiyon bir vidalı kapak test tüpü içinde yer 5 µL. 95 µL % 0,2 Trypan mavi leke ekleyin. İyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 min için durmak için izin verir. Hücre sayımı gelince bir hemasitometre doldurun. Mikroskop altında gözlemlemek Eğer uygun olmayan lekeli ve canlı hücreleri saymak.
   4. 250 g 20 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve tampon 1 x 10 100 µL ⁶ bir konsantrasyon, boyama hücreler resuspend.
   5. Blok FcR 2,5 µg Fc blok başına 1 x 10 ⁶ hücreler buz 10-15 dakika süreyle kullanılması
   6. Ekle 10 µg mAb uygun kombinasyonu 1 x 10 ⁶ hücre leke ve karanlıkta, 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya takip yıkama adım 3 mL ile tampon boyama. Doğru tazminat için hücrelerin (veya tercihen tazminat boncuklar) küçük aliquots her biri tek antikorlar ile lekeli; günahı kalan bir aliquot.
   7. 20 x 10 ⁶ hücre/ml konsantrasyonu ayarlayın.
   8. Set up ve hücre sıralayıcısı optimize. Bir Akış Sitometresi ve yazılım kurma işlemi şirket tarafından sağlanan ayrıntılı bir talimat ile standart ve uygun eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmesi gerekiyor.
2. Sıralama hücre sıralayıcısı on
   1. Adım 1.1.1.9 koleksiyonu tüpleri hazırlayın.
   2. İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) görüntülemek için bivariate bir komplo içeren bir şablon ayarlama.
   3. Hücreleri çalıştırın ve faiz ölçekte nüfusu yerleştirmek için FSC/SSC ayarlamak
   4. Negatif kontrol tüp kaydetmek.
   5. Tek pozitif kontrol tüpleri çalıştırın; her tüp için verileri kaydetmek.
   6. Tazminat alma yazılım tarafından sağlanan fonksiyonu ile el ile veya otomatik olarak hesaplamak.
   7. Deneysel örnek alacak ve onları lenfositik ve myeloid hücreleri içerecek şekilde bir bivariate FSC/SSC nokta arsa üzerinde ( şekil 1A) kapı. FSC (Yani, yükseklik, genişlik ve alanı) farklı sinyaller karşılaştırarak birini ve toplamları dahil değildir ( şekil 1B). Singlet hücreleri CD45 ve CD36 görüntüleme bivariate nokta arsa üzerinde görselleştirmek ( şekil 1 c). CD45 için olumlu olaylar leucocytes (kendi ataları dahil), bu CD45 için negatif ve erythroid ataları CD36 için olumludur. CD36 + (istenirse, bu hücreler daha da CD36 yüksek ayrılabilir ve düşük ifade hücreleri) tanımlamak için gating araçları ve CD45 + hücreler kullanın. CD45 + başka bir nokta arsa CD34 ve SSC parametrelerini görüntüleme olaylarda görselleştirin. CD34 + hücre (lökosit ataları) ve SSC yüksek hücre (farklılaşma çeşitli aşamalarında myeloid hücrelerin) tanımlamak için Araçlar perdeleme kullanın.
   8. Kapıları belirledikten sonra kapıları dış koleksiyonu tüpler içine sıralama için seçilebilir.
   9. Hücreler gerekli sayıda elde kadar 4 ° C de sıralama ile devam et
   10. ( şekil 1E, 1F) sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığı belirlemek için bir sonrası sıralama analizi gerçekleştirmek.

2. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil

1. reaktifler hazırlanması
   işlemine başlamadan önce aşağıdaki öğeleri toplanan hazırlanan ve olmak zorunda:
   1. Pipetler, 100 mm plakalar
   2. Trypan mavi ve hemasitometre
   3. yeniden oluşturma insan rekombinant Eritropoietin (EPO) 500 U/mL steril PBS en az %0,1 içeren, insan serum albümin. Bu çözüm küçük aliquots bölmek ve tekrarlanan donma-çözülme önlemek için-20 ° C'de devam.
   4. Hazırlama tamamlamak Iscove ' modifiye Dulbecco s ' s orta (IMDM) son %5 FCS, 2 mM Glutamine, 100 adet/mL penisilin/streptomisin (PS) konsantrasyonları ile. Tam IMDM Orta olarak ayrı Wells farklı konsantrasyonlarda insan rekombinant Eritropoietin (EPO) ekleme: 3 adet EPO/iyi, 6 adet EPO/iyi ve 12 EPO birimleri/iyi (1 x, 2 x, 4 x EPO sırasıyla).
2. Hazırlık kemik iliği hücrelerinin
   1. 20 mL PBS ile seyreltilmiş kemik iliği örneği 10 mL yavaş yavaş 15 mL yoğunluk gradient orta iki aşamadan ile sizin aranızdaki açık arayüz bakımı bir 50 mL konik tüp üzerine katmanlı nder steril koşullar. O zaman 9 olarak ayarla hızlanma ve yavaşlama 0 (veya fren KAPALÕ) ile 550 x g (RT) oda sıcaklığında 30 dk de 15 mL konik tüpler santrifüj kapasitesi.
   2. Santrifüjü sonra yeni bir 50 mL tüp içine arayüzü kaldırın ve PBS 50 mL nihai bir birime ekleyin.
   3. İle 250 g 10 ° C'de 10 dakika aralıklarla sonra süpernatant kaldırmak ve tam IMDM orta yaklaşık 0.5 x 10 ⁶ hücre/mL, hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 10 µL bir microtube almak, mix Trypan mavi çözüm (% 0,4) aynı birimle ve bir hemasitometre kullanarak saymak.
   4. Optional: manyetik hücre üretimi tarafından verilen talimatlara göre Milteny CD34 boncuk ile sıralama tarafından zenginleştirilmiş CD34 + hücre. En büyük avantajı bu zenginleştirme adım 50 ng/mL kök hücre faktörü ile (SCF), 20 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), 20 ng/mL eklendi yarı katı matris üzerinde yetiştirilen hematopoetik kök hücre kalitesini tespit etmektir İnterlökin-3 (IL-3), 20 ng/mL İnterlökin-6 (Il-6), 20 ng/mL granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) ve EPO 3 farklı konsantrasyonda olduğu gibi 1.4.
   5. 0.1 - hücrelere seyreltik 0,15 ⁺ x 10 ⁶ mononükleer hücre/mL veya 2 x 10 ³ CD34 tam IMDM orta ekleyerek hücre/mL Methocult H4434 orta EPO ve transfer 300 µL 3 ml ile desteklenmiştir. Sonra 1,1 ajitasyon ve kısa kuluçka için 5 dk plaka üç kez mL 35 mm çanak üzerinde. İki kültür tabakları ile birlikte su - üçüncü - 100 mm levha yerleştirilir.
   6. Hücreleri kültürlü bir oksijen 37 ° C kuluçka %5 CO ₂ için 14 gün.
3. Analiz kolonileri
   1. koloniler, 40 X büyütme puanlama bir kılavuz ile işaretlenmiş bir kültür tabağına ters bir mikroskop ile onların morfolojisi göre attı. Bizim tahlil amacı gereği, koloni oluşturan birimler (CFU) 4 kategoride sınıflandırılır: multipotential progenitör hücre (CFU-et), granülosit-makrofaj progenitör hücre (CFU-GM), veri bloğu oluşturan birim-erythroid (BFU-E) ve oluşturan colony birim-erythroid (CFU-E). Üretici görmek ' s yönergeler için daha fazla koloni subclassification.
   2. Daha fazla çözümleme için CFU tahlil plaka hücrelerden ayrı ayrı 4 kategorilerine göre 4 mL oda sıcaklığında %2 içeren PBS askıya tarafından kurtarıldı FCS/IMDM. 4 ° C'de 10 dakika için 400 g de aralıklarla sonra hücreleri PBS içinde resuspended, sayılır ve DNA ekstraksiyon için işlenen.

3. Analizi Chimerism

1. DNA izolasyon
   1. hücreleri tarafından Santrifüjü 400 g 10 dakika süreyle de cips
   2. Bir kan DNA ekstraksiyon Kiti (QIAmp DNA kan ekstraksiyon kiti) kullanarak DNA izole. Elüsyon arabellek (AE) 37 ° C de eluted DNA verimini artırmak için önceden ısıtmak.
   3. DNA toplama Nanodrop ND-1000 spectra Fotometre ile ölçmek. Örnekleri OD 260/280 ile 1.8-2.0 arasında daha fazla çözümleme için kullanılır.
   4. Seyreltik DNA'sı DNAase ücretsiz H ₂ O için toplam hacmi 50 µL 0.1 ng/µL.
2. STR-analiz
   1. tepki karışımı, AmplTaq altın DNA polimeraz ve Profiler artı astar ayarla 20 µL genomik DNA ile karıştırılarak PCR reaksiyonu ayarla (0.1 ng/µL) kılavuzuna göre (astar kiti içerir etiketlenmemiş astar STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 ve D7S820 ve cinsiyet marker amolgenin yükseltmek için arabelleği). Nükleaz ücretsiz su olarak negatif kontrol ve 9947A pozitif kontrol olarak içerir. Öncesi nakli DNA donör ve alıcı da dahil.
   2. Eppendorf mastercycler gradyan ile aşağıdaki koşullar kullanarak gerçekleştirmek PCR reaksiyon: 11 dk için 95 ° C 28 amplifikasyon döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 59 ° C için 1 dakika ve 72 ° C için 1 dakika, 45 dk. 60° C tarafından takip
   3. Kümesi parçası kadar analiz tepki 12 µL ekleyerek Hi-Di Formamid ve 0.5 µL GeneScan 500 ROX boyutu standart (tüm uygulamalı Biyosistem) 1 µL PCR ürünü için. İlk ve son pozisyon Allelic bir merdiven (Genotyper Amp Fl STR mavi, yeşil II ve sarı, uygulamalı Biyosistem) gereklidir.
   4. Başlangıç Elektroforez ve edinme Elektroforez aletle.
   5. Analiz Loci, gen ve tepe yükseklikleri örnekleri ve yazılım ¹³ denetimleriyle.

Sonuçlar

Hücre FACS sıralama tarafından lymphohematopoietic ataları ayrılması

Burada aşağı akım STR analiz için gerekli hücre popülasyonlarının sıralama sonuçlar gösterilmektedir. Kemik iliği hücreleri V450 Birleşik anti-CD45 FITC Birleşik anti-CD36 ve APC Birleşik anti-CD34 ile lekeli. Faiz nüfusu megakaryocyte erythroid parçalanmayabilir ataları (MEP), hücreleri eritrositler gelişimi için s...

Tartışmalar

Çalışmada amacı HKHT hastalarda takip erythroid ataları donör/alıcı chimerism analiz Hemoglobinopati için tedavi için seyirci iki yaklaşımın bir arada sunmaktır: 1.) floresan aktif hücre sıralama hematopoetik progenitör hücrelerin kemik iliği örneklerinde kısa tandem tekrarlar ve 2 analizi tarafından takip.) Koloni oluşturan birim büyüyen kemik iliği hücrelerinin atası çeşitli kolonilerde sınıflandırılması takip kısa tandem tekrar analiz tarafından. Bu yaklaşım yenilik donör/alıc?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR