Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

Résumé

Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.

Résumé

La présence de chimérisme incomplète est notée dans une grande proportion de patients après greffe de moelle osseuse pour la thalassémie ou la drépanocytose. Cette observation a des implications énormes, comme stratégies d’immunomodulation thérapeutique ultérieure peuvent améliorer les résultats cliniques. Conventionnellement, analyse axée sur la réaction en chaîne de la polymérase de séquences répétées en tandem courtes sert à identifier chimérisme dans les cellules de sang provenant de donneurs. Toutefois, cette méthode est limitée aux cellules nucléées et ne peut pas distinguer entre deux lignées unicellulaires dissociées. Nous avons appliqué l’analyse de séquences répétées en tandem courtes à l’écoulement des cellules progénitrices hématopoïétiques triée par cytométrie en flux et comparé cela avec l’analyse de séquences répétées en tandem courte provenant d’unité formant des rafale sélectionnée - colonies érythroïdes, tous deux prélevés dans l’OS moelle osseuse. Avec cette méthode, nous sommes en mesure de démontrer les différente prolifération et la différenciation des cellules du donneur dans le compartiment érythroïde. Cette technique a le droit de compléter la surveillance actuelle de chimérisme dans la greffe de cellules souches définissant et ainsi peut être appliquée à l’avenir les études, de recherche sur les cellules souches et de conception des essais de thérapie génique.

Introduction

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est l’approche curative disponible uniquement pour une variété de désordres génétiques innées du système hématopoïétique, atteindre des taux de survie sans maladie de plus de 90 % d’ailleurs fortement compromise et durée de vie limitée patients¹. L’efficacité de cet outil thérapeutique important a été optimisée en limitant la toxicité de pré- et post transplantation schémas², mais aussi par des interventions vise à soutenir la fonction du greffon stable, qui est quantifié par un suivi étroit des cellules dérivées donneur^3,4,5.

En général, chimérisme complet (CC) implique le remplacement total du compartiment lymphohématopoïétiques de cellules dérivées de donateurs, alors que les expressions diverses de chimérisme (MC) sont utilisée lorsque le donneur et receveur-cellules sont présents simultanément dans divers proportions. Chimérisme Split (SC) désigne la coexistence de chimérisme mixte observée dans des lignées de cellules individuelles, comme dans le compartiment érythroïde. Détermination rapide du statut de chimérisme suite tcsh est critique, car elle peut aider à identifier les patients susceptibles de rechute de la maladie et les stratégies d’initier immunomodulatrices ultérieures, comme donneur lymphocytaire infusions ou réduction des immunosuppresseurs ⁶de thérapies.

Plusieurs méthodes ont été développées pour le suivi de greffe après tcsh. Isotyping des immunoglobulines et des analyses de cytogénétique ont une sensibilité médiocre et sont limités dans leur capacité à détecter le polymorphisme^7,8. L’introduction d’hybridation fluorescente in situ (FISH) peut augmenter la sensibilité à la surveillance de chimérisme après tcsh, mais se limite aux allogreffes sexe-incompatibles,⁹. Actuellement, réaction en chaîne par polymérase (PCR) est la méthode la plus répandue, utilisée pour détecter le chimérisme et repose classiques d’agarose-acrylamide par électrophorèse sur gel de séquences répétées en tandem nombre variable (SRTNV) ou en tandem courte répétitions (DoD). Régulièrement utilisée PCR quantitative est capable de détecter une proportion très faible de cellules de donneur résiduelle après tcsh. La limitation majeure des études jusqu'à présent est que MC détection est presque exclusivement limitée à la présence de cellules nucléées, plutôt que d’érythrocytes matures, à savoir les cellules qu’est fonctionnellement crucial pour les patients affecté par des hémoglobinopathies. Chez les patients avec différents groupes sanguins, il faut se rappeler que l’analyse donnée est capable d’identifier chimérisme dans les globules rouges en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés vers les antigènes érythrocytaires ABO et C, c, D, E et e^{10 , 11}. un moyen différent, mais très intéressant d’évaluer chimérisme dans la lignée érythroïde est la combinaison de flux par cytométrie en flux, tri des progéniteurs érythroïdes et sélection des divers types de progéniteurs érythroïdes en cultivant dans des essais clonogéniques, suivi par analyse de STR¹². Cette approche est en mesure de quantifier les proportions relatives des donateurs-versus-bénéficiaires chimérisme dans le compartiment érythroïde et peut-être être utilisée dans la stratégie pour préserver la greffe de moelle osseuse.

Protocole

1. isolement des cellules de moelle osseuse hématopoïétique en triant les cellule activée par Fluorescence multiparamétrique

1. échantillon coloration
   1. avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être collectées et préparé :
      1. médias de Gradient pour la préparation de mononucléaires cellules tubes (GM), 50 mL conique
      2. 12 x 75 mm tubes de flux pour la coloration des cellules
      3. coloration tampon : tampon phosphate salin (PBS) + 3 % de sérum de veau foetal (FCS)
      4. Pipettes < / l J’ai >
      5. FC bloc et coloration des anticorps (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Avec cette combinaison de fluorochrome il y a empiétement négligeable dans d’autres chaines, mais toute autre combinaison de fluorochrome adapté est également possible.
      6. Perles de compensation (le cas échéant)
      7. Tampon de suspension : Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3 % FCS
      8. Le bleu trypan et hémocytomètre
      9. Tubes de prélèvement : n’importe quel milieu riche avec des tubes de sérique élevé (contenant 1 mL de FCS + 25 mM HEPES) peut être utilisé pour la collecte des cellules triées.
      Échantillon
      10. de la moelle osseuse : consentement éclairé pour la biopsie de moelle osseuse de la crête iliaque de l’arrière de l’os de la hanche est habituellement requis. L’échantillon de moelle osseuse est conservé dans des seringues héparinées à ta jusqu'à coloration. Les étapes suivantes du protocole sont effectués conformément aux directives de l’institution ' Comité d’éthique de la recherche humaine s pour le bien-être humain.
   2. Génèrent une suspension monocellulaire de l’échantillon de moelle osseuse. Ajouter 3 mL de GM dans le tube à centrifuger. La couche soigneusement le 4 mL de la suspension monocellulaire sur la solution de GM. Centrifuger à 550 g pour 30 min à 20 ° Celsius (C) (frein est éteint). Tirage au sort de la couche supérieure contenant du plasma et plaquettes à l’aide d’une pipette stérile, en laissant la couche de cellules mononucléaires non perturbé à l’interface. Dans un tube à centrifuger stérile à l’aide d’une pipette stérile de transfert la couche de cellules mononucléées.
   3. Après un lavage avec 5 mL de tampon de coloration, remettre en suspension les cellules dans 2 mL de tampon de suspension et déterminer la concentration en cellules. Déposer 5 µL de la suspension de cellules dans une éprouvette à bouchon à vis. Ajouter 95 µL de tache bleu Trypan 0,2 %. Mélanger soigneusement. Laisser pour reposer pendant 5 min à température ambiante. Remplir un hémocytomètre en ce qui concerne la cellule de comptage. Sous un microscope, observer si non viables sont colorées et de compter les cellules viables.
   4. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 20 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules en souillant la mémoire tampon à une concentration de 1 x 10 ⁶ par 100 µL.
   5. Bloc de FcR par l’utilisation de 2,5 µg Fc bloc par 1 x 10 ⁶ cellules sur la glace pendant 10-15 min.
   6. Ajouter un ensemble approprié de 10 µg mAb pour souiller 1 x 10 ⁶ cellules et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité, suivie d’une étape de lavage avec 3 mL de tampon de coloration. D’indemnisation correcte, petites parties aliquotes de cellules (ou préférence de perles de compensation) sont colorées avec des anticorps unique chacun ; une aliquote restant non-colorées.
   7. Ajuster la concentration de 20 x 10 ⁶ cellules/mL.
   8. Set up et optimiser la trieuse. Le processus de mise en place d’un cytomètre en flux et le logiciel est normalisé avec une instruction détaillée fournie par l’entreprise et doit être effectuée par un personnel convenablement formé.
2. Tri dans le trieur de cellules
   1. préparer les tubes de prélèvement de l’étape 1.1.1.9.
   2. Mis en place un modèle qui comprend un terrain de deux variables pour afficher forward scatter (FSC) et la diffusion latérale (SSC).
   3. Exécutent les cellules et ajuster les FSC/SSC pour placer la population d’intérêt à l’échelle
   4. Enregistrer le tube témoin négatif.
   5. Exécuter les tubes de contrôle positif unique ; enregistrement les données pour chaque tube.
   6. Calculer les compensations manuellement ou automatiquement avec la fonction fournie par le logiciel d’acquisition.
   7. Acquérir l’échantillon expérimental et les porte sur un bivariée FSC/SSC dot terrain ( Figure 1 a) pour inclure les cellules fois lymphoïde et myéloïdes. Exclure les doublets et agrégats en comparant les différents signaux de FSC (c.-à-d., hauteur, largeur et superficie) ( Figure 1 b). Visualiser les cellules singulet sur un terrain de deux variables dot affichage CD45 et CD36 ( Figure 1). Événements positifs pour CD45 sont des leucocytes (y compris leurs progéniteurs), ceux négatifs pour CD45 et positives pour CD36 sont progéniteurs érythroïdes. Utiliser des outils blocage pour définir CD36 + (si vous le souhaitez, ces cellules peuvent être encore divisés en CD36 haute et faible exprimant des cellules) et cellules CD45 +. Visualiser les événements CD45 + dans une autre parcelle de dot affichage paramètres CD34 et SSC. Utilisation porte outils pour définir des cellules CD34 + (progéniteurs de leucocytes) et SSC haute (cellules myéloïdes à différents stades de différenciation).
   8. Une fois qu’ont a déterminé les portes, les portes peuvent être sélectionnés pour trier dans des tubes pour prélèvements externes.
   9. Procédez au tri à 4 ° C jusqu'à ce que le nombre requis de cellules a été obtenu
   10. Faire une analyse post-tri pour déterminer la pureté des populations de cellules triées ( Figure 1E, 1F).

2. Clonogéniques dosage

1. préparation des réactifs
   avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être recueillis et préparé :
   1. Pipettes, plaques de 100 mm
   2. bleu Trypan et hémocytomètre
   3. reconstituer l’érythropoïétine recombinante humaine (OEB) à 500 U/mL dans du PBS stérile contenant moins de 0,1 % l’albumine sérique humaine. Diviser cette solution en petites parties aliquotes et conserver à-20 ° C pour éviter le gel-dégel répété.
   Toutes les
   4. Prepare Iscove ' s mise à jour le Dulbecco ' s moyen (IMDM) avec la concentration finale de 5 % FCS, 2 mM de Glutamine, 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine (PS). Ajouter l’érythropoïétine recombinante humaine (OEB) à différentes concentrations en puits séparés pour le milieu IMDM complet : 3 unités EPO/puits, 6 unités EPO/puits et 12 OEB unités/puits (1 x, x 2, 4 x EPO respectivement).
2. Préparation des cellules de la moelle osseuse
   1. 10 mL de l’échantillon de moelle diluée avec 20 mL de PBS sont lentement en couches sur le dessus de milieu de gradient de densité 15 mL dans un tube conique de 50 mL, maintenir une interface claire entre les deux phases et vous en vertu des conditions stériles. Centrifuger les tubes coniques 15 mL à 550 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) avec comme 9 l’accélération et de décélération la valeur 0 (ou frein OFF).
   2. Après centrifugation, enlever l’interface dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter des PBS pour un volume final de 50 mL.
   3. Après centrifugation avec 250 g pendant 10 min à 10 ° C, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu IMDM complet à environ 0,5 x 10 ⁶ cellules/mL. Prendre 10 µL de la suspension cellulaire dans un microtube, de mélanger avec le même volume de solution de bleu de Trypan (0,4 %) et de compter à l’aide d’un hémocytomètre.
   4. Oacultatif : cellules CD34 + sont enrichis par cellule magnétique tri avec perles Milteny CD34 conformément aux instructions fournies par le fabricant. Le principal avantage de cette étape de l’enrichissement est de détecter la qualité des cellules souches hématopoïétiques, qui sont cultivés sur une matrice semi solide additionnée de 50 ng/mL cellules souches le facteur (SCF), 20 ng/mL granulocyte-macrophage colony-stimulating (GM-CSF), 20 ng/mL interleukine-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukine-6 (IL-6), facteur de stimulation des colonies de granulocytes 20 ng/mL (G-CSF) et 3 concentrations différentes d’EPO comme 1.4.
   5. Diluer les cellules à 0,1 - 0,15 x 10 ⁶ cellules mononucléaires/mL ou 2 x 10 ³ CD34 ⁺ cellules/mL en ajoutant le milieu IMDM complet additionné d’EPO et transfert de 300 µL à 3 mL Methocult H4434 moyen. Après agitation et une incubation courte pour plaque 5 min trois fois 1,1 mL sur un plat de 35 mm. Deux de ces récipients de culture ainsi que d’un tiers - rempli d’eau - sont placés dans des plats de 100 mm.
   6. Cellules sont cultivées dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5 % de CO ₂ pendant 14 jours.
3. Analyse des colonies
   1. Colonies sont notés selon leur morphologie avec un microscope inversé à un grossissement de X 40 dans une boîte de Petri marquée avec une grille de notation. Aux fins de notre analyse, les unités formant colonies (UFC) sont classées en 4 catégories : des cellules progénitrices multipotentielle (CFU-GEMM), cellules progénitrices de granulocyte-macrophage (CFU-GM), éclatent formant unité-érythroïdes (BFU-E) et formant des colonies unité-érythroïdes (CFU-E). Voir le fabricant ' s directives pour plus amples subclassification de colonie.
   2. Pour une analyse ultérieure, les cellules de la plaque de test UFC sont récupérés séparément selon les 4 catégories en suspendant à température de la pièce 4 mL PBS contenant 2 % FCS/IMDM. Après centrifugation à 400 g pendant 10 min à 4 ° C, les cellules sont remises en suspension dans du PBS, comptés et traitées pour l’extraction de l’ADN.

3. Analyse de chimérisme

1. Isolement d’ADN
   1. les cellules par centrifugation à 400 g pendant 10 min. de granule
   2. Isoler l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN (kit d’extraction avez ADN sang) du sang. Préchauffer le tampon d’élution (AE) à 37 ° C afin d’améliorer le rendement de l’ADN éluée.
   3. Mesurer la concentration d’ADN avec photomètre de spectres Nanodrop ND-1000. Échantillons avec OD 260/280 entre 1,8 et 2,0 sont utilisées pour une analyse ultérieure.
   4. ADN diluer avec DNAase gratuit H ₂ O à 0,1 ng/µL dans un volume total de 50 µL.
2. STR-analyse
   1. mis en place la réaction PCR en mélangeant mélange réactionnel, AmplTaq or ADN polymérase et Profiler Plus Primer sertie de 20 µL ADN génomique (0,1 ng/µL) selon le manuel (l’ensemble d’amorçage contient les amorces non étiquetées dans un tampon pour amplifier les loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 et D7S820 et l’amélogénine de marqueur de genre). Inclure une eau exempte de nucléase comme contrôle négatif et 9947A comme témoin positif. Pré-transplantatoire ADN du donneur et du receveur sont également inclus.
   2. Réaction PCR à effectuer à l’aide de Eppendorf mastercycler dégradé dans les conditions suivantes : 95 ° C pendant 11 min, 28 cycles d’amplification de 95 ° C pendant 1 min, 59 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 1 min, suivie de 60° C pendant 45 min.
   Réaction de
   3. set up fragment analyse en ajoutant 12 µL Hi-Di formamide et 0,5 µL GeneScan 500 ROX taille Standard (tous Applied Biosystems) à 1 µL du produit PCR. À la première et la dernière position il faut une échelle allélique (Amp Genotyper Fl STR bleu, II vert et jaune, Applied Biosystems).
   4. Commencer à l’électrophorèse et l’acquisition avec l’appareil d’électrophorèse.
   5. Analyser Loci, les allèles et les hauteurs des pics des échantillons et des contrôles avec le logiciel ¹³.

Résultats

Séparation des progéniteurs lymphohématopoïétiques en triant les cellules FACS

Nous démontrons ici résultats du tri des populations de cellules nécessaires pour l’analyse en aval de STR. Les cellules de la moelle osseuse ont été colorées avec V450 conjugué anti-CD45, conjugué FITC anti-CD36 et APC conjugué anti-CD34. La population visée est les mégacaryocyte progéniteurs (MEP), nucléées les ...

Discussion

L’objectif de la présente étude est de fournir au public une combinaison des deux approches pour analyser chimérisme donneur/receveur en progéniteurs érythroïdes suite tcsh chez les patients traités pour hémoglobinopathies : 1.) activés par fluorescence cellulaire tri des cellules souches hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse suivies d’analyse de séquences répétées en tandem courtes et 2.) unité formant colonie de plus en plus de cellules de moelle osseuse, classification des col...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR