Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

Riepilogo

È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.

Abstract

La presenza di chimerismo incompleto è notata in una grande percentuale di pazienti dopo trapianto di midollo osseo per talassemia major o malattia di cellule di falce. Questa osservazione ha implicazioni tremende, come strategie di immunomodulazione terapeutica successiva possono migliorare il risultato clinico. Convenzionalmente, analisi reazione-basata catena della polimerasi di brevi ripetizioni in tandem è utilizzato per identificare il chimerismo in cellule di sangue donatore-derivate. Tuttavia, questo metodo si limita alle cellule nucleate e non può distinguere tra dissociate unicellulare lignaggi. Abbiamo applicato l'analisi di brevi ripetizioni in tandem di cellule progenitrici ematopoietiche ordinato cytometric di flusso e confrontato questo con l'analisi di brevi ripetizioni in tandem ottenuti da unità selezionata burst-forming - colonie eritroidi, entrambi raccolti dall'osso midollo osseo. Con questo metodo siamo in grado di dimostrare la diversa proliferazione e differenziazione delle cellule donatrici nel vano degli eritrociti. Questa tecnica è idonea per la realizzazione di monitoraggio della corrente di chimerismo nel trapianto di cellule staminali impostazione e quindi può essere applicato in futuro studi, ricerca sulle cellule staminali e progettazione di prove di terapia genica.

Introduzione

Trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche (HSCT) è l'approccio curativo solo disponibile per una varietà di disordini genetici innati del sistema ematopoietico, realizzando i tassi di sopravvivenza libera da malattia superiore al 90% per altrimenti altamente compromessa e vita limitata pazienti¹. L'efficacia di questo importante strumento terapeutico è stato ottimizzato limitando la tossicità di pre- e post-trapianto i regimi², ma anche di interventi volti a sostenere la funzione dell'innesto stabile, che è quantificato da attento monitoraggio dei donatore-derivate cellule^3,4,5.

In generale, chimerismo completo (CC) comporta la sostituzione totale del vano linfoematopoietico dalle cellule donatore-derivati, considerando che il termine mixed chimerism (MC) è usato quando le cellule derivate dal donatore e destinatario sono contemporaneamente presenti in vari proporzioni. Chimerismo Split (SC) denota la coesistenza del chimerism misto osservata in lignaggi unicellulare, come ad esempio nel comparto degli eritrociti. Rapida determinazione dello status di chimerismo dopo HSCT è critica, come può aiutare a identificare i pazienti suscettibili per ricaduta di malattia e immunomodulatori successive avviare strategie, come infusioni erogarici del linfocita o riduzione di immunosoppressori terapie⁶.

Diversi metodi sono stati sviluppati per il monitoraggio attecchimento dopo HSCT. Isotyping delle immunoglobuline e l'analisi di citogenetica hanno scarsa sensibilità e sono limitati nella loro capacità di rilevare il polimorfismo^7,8. L'introduzione di ibridazione fluorescente in situ (FISH) può migliorare la sensibilità nel chimerismo monitoraggio dopo HSCT, ma è limitata al sesso-mal adattato allotrapianti⁹. Attualmente, reazione a catena della polimerasi (PCR) è il metodo più diffuso utilizzato per rilevare chimerismo e si basa su elettroforesi su gel di agarosio-acrilammide convenzionale di ripetizioni in tandem di numero variabile (VNTR) o ripetizioni in breve tandem (STRs). Abitualmente utilizzati PCR quantitativa è in grado di rilevare un'estremamente piccola proporzione delle cellule erogarici residua dopo HSCT. La limitazione principale degli studi finora è che MC rilevamento è limitata quasi esclusivamente alla presenza di cellule nucleate, piuttosto che sugli eritrociti maturi, vale a dire le cellule che sono funzionalmente cruciale per i pazienti affetti da emoglobinopatie. In pazienti con gruppi sanguigni diversi, vale la pena ricordare che l'analisi cytofluorometric è in grado di identificare il chimerismo nei globuli rossi utilizzando anticorpi monoclonali diretti verso antigeni eritrocitari di ABO e C, c, D, E ed e^{10 , 11}. un mezzo diverso, ma molto interessante valutare chimerismo nella stirpe degli eritrociti è la combinazione di flusso cytometric l'ordinamento dei progenitori eritroidi e selezione di vari tipi di cellule progenitrici eritroidi coltivando in saggi clonogenici, seguita dall'analisi di STR¹². Questo approccio è in grado di quantificare le proporzioni relative di chimerismo donatore-versus-destinatario nel vano degli eritrociti e può essere utilizzato nella strategia per sostenere il trapianto di midollo osseo.

Protocollo

1. isolamento di cellule del midollo osseo ematopoietico di multi-parametro fluorescenza-attivato ordinamento delle cellule

1. campione colorazione
   1. prima di iniziare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolti e pronti:
      1. media pendenza per la preparazione di mononucleari cellule tubi (GM), 50 mL conica
      2. 12x75 mm tubi di flusso per la macchiatura delle cellule
      3. buffer di colorazione: tampone fosfato salino (PBS) + 3% siero fetale di vitello (FCS)
      4. pipette < / l Ho >
      5. FC blocco e macchiatura anticorpi (CD34 APC, CD36 FITC, V450 CD45, BD Biosciences). Con questa combinazione di fluorocromo c'è trascurabile spillover in altri canali, ma può anche qualsiasi altra combinazione di fluorocromo adatto.
      6. Perline di compensazione (se necessario)
      7. Buffer di sospensione: Hank ' s soluzione salina bilanciata (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. Blu di trypan ed emocitometro
      9. Tubi di raccolta: qualsiasi mezzo ricco con tubi di elevata del siero (contenente 1 mL di FCS + 25mm HEPES) può essere utilizzato per la raccolta delle cellule ordinate.
      Campione di
      10. del midollo osseo: è in genere richiesto il consenso informato per biopsia del midollo osseo dalla cresta iliaca della parte posteriore dell'osso dell'anca. Il campione di midollo osseo è che tenuti in siringhe eparinizzate presso RT fino a colorazione. Vengono eseguiti i seguenti passaggi di protocollo in conformità con le linee guida dell'istituzione ' Comitato di etica umana ricerca di s per il benessere umano.
   2. Generare una sospensione singola cella del campione del midollo osseo. Aggiungere 3 mL di GM per la provetta da centrifuga. Strato con attenzione i 4 mL della sospensione unicellulare sulla soluzione di GM. Centrifugare a 550 g per 30 min a 20 ° Celsius (C) (freno è spento). Disegnare dello strato superiore contenente plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile, lasciando lo strato delle cellule mononucleari indisturbati all'interfaccia. Trasferire lo strato delle cellule mononucleari in una provetta sterile utilizzando una pipetta sterile.
   3. Dopo il lavaggio con 5 mL di tampone di colorazione, risospendere le cellule in 2 mL di tampone di sospensione e determinare la concentrazione delle cellule. Posto 5 µ l di sospensione cellulare in una provetta tappo a vite. 95 µ l di 0,2% Trypan blu macchia. Mescolare accuratamente. Lasciare per riposare per 5 min a temperatura ambiente. Riempire un emocitometro per quanto riguarda la conta cellulare. Sotto un microscopio, osservare se non vitali sono macchiati e contare le cellule vitali.
   4. Centrifugare le cellule a 250 g per 10 min a 20 ° C, scartare il surnatante e risospendere le cellule in colorazione buffer ad una concentrazione di fino a 1 x 10 ⁶ a 100 µ l.
   5. FcR blocco mediante l'uso di 2,5 µ g blocco Fc per 1 x 10 ⁶ cellule in ghiaccio per 10-15 min.
   6. Aggiungi la combinazione appropriata di 10 µ g mAb per macchiare 1 x 10 ⁶ cellule ed incubare per 20 min a 4 ° C al buio, seguita da una fase di lavaggio con 3 mL di tampone di colorazione. Per la corretta compensazione, piccole aliquote delle celle (o preferibilmente perle di compensazione) sono macchiate con singoli anticorpi ciascuno; un'aliquota rimanenti non macchiate.
   7. Regolare la concentrazione di 20 x 10 ⁶ cellule/mL.
   8. Set up e ottimizzare il classificatore celle. Il processo di impostazione di un citometro a flusso e software è standardizzato con un'istruzione dettagliata fornita dall'azienda e deve essere eseguita da personale opportunamente addestrato.
2. Ordinamento ordinatore delle cellule
   1. Preparare provette per il prelievo dal passaggio 1.1.1.9.
   2. Impostare un modello che include un complotto bivariato per visualizzare forward scatter (FSC) e side scatter (SSC).
   3. Eseguire le cellule e regolare FSC/SSC per posizionare la popolazione di interesse su scala
   4. Registrare la provetta di controllo negativo.
   5. Eseguire i tubi di singolo controllo positivo; registrare i dati per ogni tubo.
   6. Calcolare la compensazione manualmente o automaticamente con la funzione fornita dal software acquisizione.
   7. Acquisire il campione sperimentale e li cancello su un bivariata/dot plot FSC SSC ( Figura 1A) per includere sia cellule mieloidi di linfocitaria. Escludere i doppietti e aggregati confrontando i diversi segnali di FSC (vale a dire, altezza, larghezza e zona) ( Figura 1B). Visualizzare le celle di singoletto su un terreno di dot bivariata visualizzazione CD45 e CD36 ( Figura 1). Eventi positivi per CD45 sono leucociti (comprese le loro cellule progenitrici), quelli negativo per CD45 e positivi per CD36 sono progenitori eritroidi. Utilizzare strumenti di gating per definire CD36 + (se desiderato, queste cellule possono essere ulteriormente divisi in CD36 alto e basso che esprimono le cellule) e cellule CD45 +. Visualizzare gli eventi di CD45 + in un altro appezzamento di dot visualizzazione parametri di CD34 e SSC. Uso di gating strumenti per definire le cellule CD34 + (progenitori del leucocita) e SSC alte cellule (cellule mieloidi nelle varie fasi di differenziazione).
   8. Una volta cancelli sono stati determinati, le porte possono essere selezionate per l'ordinamento nelle provette di raccolta esterno.
   9. Procedi con l'ordinamento a 4 ° C fino a quando il numero delle cellule è stato ottenuto
   10. Eseguire un'analisi post-ordinamento per determinare la purezza delle popolazioni cellulari ordinati ( Figura 1E, 1F).

2. Analisi clonogenic

1. preparazione dei reagenti
   prima di iniziare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolti e preparati:
   1. pipette, piastre 100 mm
   2. blu di Trypan ed emocitometro
   3. ricostituire eritropoietina umana ricombinante (EPO) a 500 U/mL in PBS sterile contenente almeno 0,1% albumina sierica umana. Dividere questa soluzione in piccole aliquote e conservare a-20 ° C per evitare ripetuti di congelamento-scongelamento.
   4. Preparare completare Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium (IMDM) con concentrazioni finali di 5% FCS, 2mm glutammina, 100 unità/mL penicillina/streptomicina (PS). Aggiungere eritropoietina umana ricombinante (EPO) a differenti concentrazioni in pozzetti separati per la sostanza IMDM completa: 3 unità EPO/pozzetto, 6 unità EPO/pozzetto e 12 EPO unità/pozzetto (1x, 2x, 4 x EPO rispettivamente).
2. Preparazione di cellule del midollo osseo
   1. 10 mL di campione di midollo osseo diluito con 20 mL di PBS sono lentamente sovrapposto a 15 mL di terreno gradiente di densità in una provetta conica 50 mL, mantenendo chiara interfaccia tra le due fasi e si nder condizioni sterili. Poi Centrifugare le provette coniche da 15 mL a 550 x g per 30 min a temperatura ambiente (TA) impostato come 9 di accelerazione e decelerazione impostato come 0 (o freno fuori).
   2. Dopo la centrifugazione, rimuovere l'interfaccia in una nuova provetta da 50 mL e aggiungere PBS ad un volume finale di 50 mL.
   3. Dopo la centrifugazione con 250 g per 10 min a 10 ° C rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in terreno IMDM completo a circa 0,5 x 10 ⁶ cellule/mL. Prendere 10 µ l di sospensione cellulare in una microprovetta, mescolare con lo stesso volume di soluzione di blu di Trypan (0,4%) e contare utilizzando un emocitometro.
   4. Oopzionale: cellule CD34 + sono arricchite da magnetico cella ordinamento con perline Milteny CD34 secondo le istruzioni fornite dal produttore. Il vantaggio principale di questa fase di arricchimento è quello di rilevare la qualità delle cellule staminali emopoietiche, che sono cresciute su una matrice semi-solida aggiunta con fattore di cellula formativa 50 ng/mL (SCF), fattore 20 ng/mL distimolazione del granulocyte-macrofago (GM-CSF), 20 ng/mL interleuchina-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), fattore distimolazione del granulocyte di 20 ng/mL (G-CSF) e 3 diverse concentrazioni di EPO come 1.4.
   5. Diluire le cellule a 0,1 - 0,15 x 10 ⁶ cellule mononucleari/mL o 2 x 10 ³ CD34 ⁺ cellule/mL aggiungendo terreno IMDM completo integrato con EPO e trasferimento 300 µ l a 3 mL Methocult H4434 medio. Dopo agitazione e una breve incubazione per 5 min piatto tre volte 1,1 mL su un piatto di 35 mm. Due di questi piatti di cultura insieme a un terzo - riempita d'acqua - sono collocati nelle piastre di 100 mm.
   6. Le cellule sono coltivate in un incubatore umidificato 37 ° C con 5% CO ₂ per 14 giorni.
3. Analisi delle colonie
   1. colonie sono segnati secondo la loro morfologia con un microscopio invertito a 40 ingrandimenti in una piastra di coltura contrassegnato da una griglia di punteggio. Ai fini della nostra analisi, l'unità formanti colonie (CFU) sono classificate in 4 categorie: cellule progenitrici multipotenti (CFU-GEMM), cellule progenitrici del granulocyte-macrofago (CFU-GM), burst formanti unità-eritroidi (BFU-E) e formazione di colonie unità-degli eritrociti (CFU-E). Vedere produttore ' s istruzioni per ulteriore sottoclassificazione di Colonia.
   2. Per ulteriori analisi, cellule dalla piastra di dosaggio di CFU sono recuperate separatamente secondo 4 categorie sospendendo a temperatura ambiente 4 mL PBS contenente il 2% FCS/IMDM. Dopo centrifugazione a 400 g per 10 min a 4 ° C, le cellule sono risospese in PBS, contati e trattate per estrazione del DNA.

3. Analisi di Chimerism

1. Isolamento del DNA
   1. agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 400 g per 10 min.
   2. Isolare DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA (kit di estrazione QIAmp DNA sangue) di sangue. Pre-riscaldare il tampone di eluizione (AE) a 37 ° C per migliorare il rendimento del DNA eluito.
   3. Misurare la concentrazione di DNA con fotometro spettri Nanodrop ND-1000. Campioni con OD 260/280 tra 1.8-2.0 sono utilizzati per ulteriori analisi.
   4. DNA diluire con dnaasi libero H ₂ O a 0,1 ng / µ l in un volume totale di 50 µ l.
2. STR-analisi
   1. impostare la reazione di PCR mescolando Mix di reazione, AmplTaq Gold DNA polimerasi e Profiler Plus Set di Primer con 20 µ l DNA genomico (0,1 ng / µ l) secondo il manuale (il kit di primer contiene il iniettori senza etichetta nel buffer per amplificare i loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 e D7S820 e l'amelogenina marcatore di genere). Includono acqua priva di nucleasi come controllo negativo e 9947A come controllo positivo. Sono inclusi anche DNA pre-trapianto da donatore e del ricevente.
   2. Reazione di eseguire PCR usando il gradiente mastercycler Eppendorf con le seguenti condizioni: 95 ° C per 11 min, 28 cicli di amplificazione di 95 ° C per 1 min, 59 ° C per 1 min e 72 ° C per 1 min, seguita da 60° C per 45 min.
   Reazione di analisi
   3. set up frammento aggiungendo 12 µ l Hi-Di Formamid e 0,5 µ l GeneScan 500 ROX dimensione Standard (tutti Applied Biosystems) a 1 µ l di prodotto di PCR. In prima e l'ultima posizione è necessaria una scala allelica (Genotyper Amp Fl STR blu, II verde e giallo, Applied Biosystems).
   4. Iniziare l'elettroforesi e acquisizione con lo strumento di elettroforesi.
   5. Analizzare Loci, alleli e altezze dei picchi dei campioni e dei controlli con il software ¹³.

Risultati

Separazione dei progenitori linfoematopoietico ordinando delle cellule di FACS

Dimostriamo qui risultati da ordinamento le popolazioni delle cellule necessarie per analisi STR a valle. Cellule del midollo osseo sono state macchiate con V450-coniugato anti-CD45, FITC Coniugato anti-CD36 e APC-coniugato anti-CD34. La popolazione di interesse è il responsabile dello sviluppo degli eritrociti cellule progenitori (M...

Discussione

L'obiettivo di questo studio è quello di fornire al pubblico una combinazione dei due approcci per l'analisi di chimerismo donatore/ricevente nei progenitori eritroidi dopo HSCT nei pazienti trattati per emoglobinopatie: 1.) l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule di cellule progenitrici ematopoietiche nei campioni di midollo osseo, seguiti dall'analisi di brevi ripetizioni in tandem e 2.) unità formanti colonie di crescita delle cellule del midollo osseo, classificazione delle colonie in vari tipi di cellule...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR