Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Zusammenfassung

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von unvollständigen Chimerism ist in einem Großteil der Patienten nach Knochenmarktransplantation für große Thalassämie oder Sichelzellenanämie vermerkt. Diese Beobachtung hat enorme Auswirkungen, da spätere therapeutische Immunmodulation Strategien klinische Outcome verbessern können. Konventionell, dient Polymerase Kettenreaktion-basierte Analyse der kurze Tandemwiederholungen Chimärismus in Spender stammenden Blutkörperchen zu identifizieren. Allerdings ist diese Methode beschränkt sich auf kernhaltigen Zellen und kann nicht unterscheiden zwischen dissoziierten einzellige Abstammungen. Wir die Analyse der kurze Tandemwiederholungen durchflusszytometrischen sortiert hämatopoetischen Vorläuferzellen zu fließen und verglichen mit der Analyse der kurze Tandemwiederholungen aus ausgewählten Burst-bildende Einheit - erythroiden Kolonien gewonnen, beide aus dem Knochen gesammelt Knochenmark. Mit dieser Methode können wir die verschiedenen Proliferation und Differenzierung der Spenderzellen in erythroiden Fach unter Beweis stellen. Diese Technik ist berechtigt, Stromüberwachung von Chimärismus in der Stammzell-Transplantation Einstellung abzuschließen und somit möglicherweise angewandte künftig klinische Studien, Stammzellforschung und Gestaltung der Gen-Therapie-Studien.

Einleitung

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist der einzige verfügbare kurative Ansatz für eine Vielzahl von angeborenen genetischen Erkrankungen des blutbildenden Systems, krankheitsfreien Überlebensraten von über 90 % zu erreichen, denn sonst stark beeinträchtigt und lebensdauerbegrenzten Patienten¹. Die Wirksamkeit dieses wichtige therapeutische Werkzeug optimiert durch die Begrenzung der Toxizität von Pre- und nach der Transplantation Therapien², aber auch durch Interventionen auf die Aufrechterhaltung stabiler Organfunktion, quantifiziert die durch genaue Beobachtung der Spender-abgeleitete Zellen^3,4,5.

Im Allgemeinen bedeutet vollständige Chimärismus (CC) Totalersatz des Fachs Lymphohematopoietic von Spender-abgeleitete Zellen, während der Begriff gemischten Chimärismus (MC) verwendet wird, wenn Spender und Empfänger-abgeleitete Zellen gleichzeitig in verschiedenen vorhanden sind Proportionen. Split-Chimärismus (SC) bezeichnet das Zusammenleben von gemischten Chimärismus in einzellige Linien, wie z. B. in der erythroiden Fach beobachtet. Schnelle Bestimmung der Chimerism Status nach HSCT ist kritisch, da es dazu beitragen kann, anfällig für Krankheiten Rückfall und initiieren nachfolgende immunmodulatorische Strategien, wie Spender-Lymphozyten Infusionen oder Reduktion der immunsuppressiven Patienten identifizieren Therapien-⁶.

Verschiedene Methoden wurden entwickelt für die Überwachung der Engraftment nach HSCT. Isotyping von Immunglobulinen und Analyse der Zytogenetik haben schlechte Empfindlichkeit und sind in ihrer Fähigkeit zu erkennen, Polymorphismus^7,8begrenzt. Die Einführung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Empfindlichkeit in Chimerism Überwachung nach HSCT verbessern kann, sondern beschränkt sich auf Sex nicht übereinstimmende Allografts⁹. Derzeit, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die am weitesten verbreitete Methode zur Chimerism eingesetzt und basiert auf herkömmlichen Agarose-Acrylamid Gelelektrophorese der Variable Zahl Tandemwiederholungen (VNTRs) oder kurze Tandem wiederholt (STRs). Routinemäßig verwendet ist quantitative PCR einen extrem kleinen Teil der verbleibenden Spenderzellen nach HSCT zu erkennen. Die größte Beschränkung der Studien so weit ist, dass MC-Erkennung beschränkt sich fast ausschließlich auf das Vorhandensein von kernhaltigen Zellen, anstatt Reifen Erythrozyten, nämlich Zellen, dass Hämoglobinopathien funktionell entscheidend für Patienten betroffen sind. Bei Patienten mit verschiedenen Blutgruppen sei daran erinnert, dass Cytofluorometric Analyse Chimärismus in roten Blutkörperchen identifizieren durch den Einsatz von monoklonalen Antikörpern auf die Erythrozyten Antigene ABO und C, c, D, E und e¹⁰ gerichtet ist ^{, 11}. ein anders, aber sehr interessantes Mittel zur Bewertung der Chimärismus in der erythroiden Abstammung ist die Kombination von Flow durchflusszytometrischen Sortierung von erythroiden Vorläuferzellen und Auswahl verschiedener erythroiden Vorläuferzellen durch Kultivierung in klonogenen Assays Analyse von STR¹²gefolgt. Dieser Ansatz ist in der Lage, die relativen Anteile der Spender-gegen-Empfänger-Chimärismus erythroiden Fach zu quantifizieren und kann genutzt werden, in der Strategie, die Knochenmark-Transplantation zu erhalten.

Protokoll

1. Isolation des blutbildenden Knochenmarkzellen durch Multi-Parameter-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

1. 1. Probe zu beflecken, bevor Sie den Prozess, die folgenden Punkte müssen abgeholt werden und zubereitet:
      1. Gradient-Medien für die Zubereitung von mononukleären Zellen (GM), 50 mL konische Rohre
      2. 12 x 75 mm Messrohre für das Beflecken Zellen
      3. Retikuläres Puffer: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 3 % fetalen Kälberserum (FCS)
      4. Pipetten < / l ich >
      5. FC Block und Färbung Antikörper (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences). Mit dieser Kombination Fluorochrom ist vernachlässigbar Spillover in andere Kanäle, aber auch andere geeignete Fluorochrom-Kombination ist möglich.
      6. Ersatz-Perlen (falls erforderlich)
      7. Suspension Puffer: Hank ' s ausgewogen Salz-Lösung (HBSS) + 25 mM HEPES + 3 % FCS
      8. Trypan blau und hemocytometer
      9. Röhrchen: jedes Reich Medium mit hoher Serum-Röhrchen (mit 1 mL FCS + 25 mM HEPES) kann für die Auflistung der sortierten Zellen verwendet werden.
      10. Knochenmark Probe: Einverständniserklärung für Knochenmarkbiopsie aus dem Beckenkamm des Rückens an den Hüftknochen ist in der Regel erforderlich. Der Knochenmarkprobe ist als in heparinisierten Spritzen bei RT bis Färbung gehalten. Protokoll folgendermaßen erfolgen in Übereinstimmung mit den Leitlinien des Instituts ' s Humanforschung Ethikkommission für menschliches Wohlergehen.
   2. Erzeugen eine Einzelzelle Aussetzung der Knochenmarkprobe. Die Zentrifugenröhrchen 3 mL GM hinzufügen. Sorgfältig Schicht 4 mL der Einzelzelle Suspension auf die GM-Lösung. Zentrifuge bei 550 g für 30 min bei 20 ° Celsius (C) (Bremse ausgeschaltet). Ziehen der obersten Hautschicht, Plasma und Plättchen mit einer sterilen Pipette, verlassen die mononukleären Zellschicht ungestört an der Schnittstelle enthalten. Die Schicht der mononukleären Zellen zu übertragen, um einem sterilen Zentrifugenröhrchen mit einer sterilen Pipette.
   3. Nach dem Waschen mit 5 mL Puffer Färbung, die Zellen in 2 mL Suspension Puffer Aufschwemmen und bestimmen die Zellkonzentration. Platz 5 µL Zellsuspension in einem Reagenzglas Schraubverschluss. Fügen Sie 95 µL 0,2 % Trypan blau Fleck. Mischen Sie gründlich. Für 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen. Füllen Sie ein Hemocytometer für die Zellzählung. Unter dem Mikroskop beobachten wenn nicht lebensfähig sind gefärbt und zählen der lebensfähigen Zellen.
   4. Der Zellen bei 250 g für 10 min bei 20 ° C Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in der Färbung Puffer in einer Konzentration von bis zu 1 x 10 ⁶ pro 100 µL.
   5. Block-FcR durch den Einsatz von 2,5 µg Fc-Block pro 1 x 10 ⁶ Zellen auf Eis für 10-15 min.
   6. Add die geeignete Kombination von 10 µg mAb zu 1 x 10 ⁶ Zellen färben und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln, gefolgt von einem Waschschritt mit 3 mL Puffer Färbung. Für korrekte Vergütung sind kleine Aliquote der Zellen (oder vorzugsweise Entschädigung Perlen) mit einzelnen Antikörpern gefärbt; eine aliquote verbleibenden ungefärbten.
   7. Stellen Sie die Konzentration bis 20 x 10 ⁶ Zellen/mL.
   8. Set up und optimieren den Zelle Sorter. Der Prozess der Einrichtung eines Durchflusszytometer und Software ist mit eine detaillierte Anleitung zur Verfügung gestellt von der Firma standardisiert und muss von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.
2. Sortierung auf der Zelle Sorter
   1. bereiten Primärgefäßen aus Schritt 1.1.1.9.
   2. Richten Sie eine Vorlage, die enthält einen bivariaten Plot anzuzeigenden forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC).
   3. Führen Sie die Zellen und stellen Sie FSC/SSC um die Bevölkerung von Interesse im Maßstab zu platzieren
   4. Erfassen der Negativkontrolle Tube.
   5. Laufen die einzelnen Positivkontrolle Rohre, notieren Sie die Daten für jedes Rohr.
   6. Entschädigung entweder manuell oder automatisch mit der Funktion zur Verfügung gestellt von der Datenerfassungs-Software zu berechnen.
   7. Die experimentelle Probe zu erwerben und sie auf eine bivariate FSC/SSC Dot Grundstück ( Abbildung 1A), lymphatische und myeloische Zellen aufzunehmen Tor. Dubletten und Aggregate durch Vergleich der verschiedenen Signale des FSC (d.h., Höhe, Breite und Fläche) ausschließen ( Abb. 1 b). Visualisieren die Singulett-Zellen auf eine bivariate Dot-Plot CD45 und CD36 anzeigen ( Abbildung 1). Veranstaltungen für CD45 positiv sind Leukozyten (einschließlich ihrer Vorfahren), die negativ für CD45 und positiv für CD36 sind erythroiden Vorläuferzellen. Verwenden Sie gating Tools CD36 + definieren (wenn gewünscht, diese Zellen können weiter unterteilt werden in CD36 hoch und niedrig mit dem Ausdruck Zellen) und CD45 +-Zellen. Visualisieren Sie CD45 + Ereignisse in einem anderen Punkt Handlung CD34 und SSC Parameter anzeigen. Verwendung Anspritzung Werkzeuge definieren CD34 + Zellen (Leukozyten Stammväter) und SSC hohe Zellen (myeloische Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung).
   8. Sobald Tore bestimmt worden sind, können die Tore zum Sortieren in externen Primärgefäßen ausgewählt werden.
   9. Gehen Sie mit der Sortierung bei 4 ° C, bis die erforderliche Anzahl von Zellen vorliegt
   10. Führen Sie eine Post-Art-Analyse zur Ermittlung der Reinheit der sortierten Zellpopulationen ( Abb. 1E, 1F).

2. Klonogenen Assay

1. Vorbereitung der Reagenzien
   bevor Sie beginnen, müssen folgende Punkte gesammelt und vorbereitet werden:
   ,
   1. Pipetten, 100 mm Platten
   2. Trypan blau und Hemocytometer
   3. rekonstruieren menschliche recombinant Erythropoietin (EPO) bei 500 U/mL in sterilen PBS mit mindestens 0,1 % menschliches Serumalbumin. Teilen Sie diese Lösung in kleinen Aliquote und halten bei-20 ° C zur Vermeidung wiederholter Frost-Tau-wechseln.
   4. Bereiten Sie komplette Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium (IMDM) mit Endkonzentrationen von 5 % FCS, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin/Streptomycin (PS). Das komplette IMDM Medium menschlichen rekombinantes Erythropoetin (EPO) in verschiedenen Konzentrationen in separaten Brunnen hinzufügen: 3 Einheiten EPO/Brunnen, 6 Einheiten EPO/gut und 12 EPO-Einheiten/gut (1 X, 2 X, 4 X EPO bzw.).
2. Vorbereitung der Knochenmarkzellen
   1. 10 mL Knochenmark-Probe mit 20 mL PBS verdünnt werden langsam auf 15 mL Dichte Gradienten Medium in einem 50 mL konische Rohr, Aufrechterhaltung klare Schnittstelle zwischen den beiden Phasen und Sie geschichtet Nder sterilen Bedingungen. Zentrifugieren Sie die 15 mL konische Röhrchen bei 550 X g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) als 9 Beschleunigung und Verlangsamung als 0 (oder Bremse ausgeschaltet).
   2. Nach Zentrifugation, entfernen Sie die Schnittstelle in eine neue 50 mL Tube und fügen PBS zu einem Endvolumen von 50 mL.
   3. Nach Zentrifugation mit 250 g für 10 min. bei 10 ° C den Überstand zu entfernen und Aufschwemmen der Zellen im kompletten IMDM Medium bei ca. 0,5 x 10 ⁶ Zellen/mL. Ein Reaktionscup 10 µL Zellsuspension berücksichtigen, mischen mit dem gleichen Volumen Trypan blau-Lösung (0,4 %) und rechnen mit einem Hemocytometer.
   4. OOptional: CD34 + Zellen werden durch magnetische Zelle Sortierung mit Milteny CD34-Perlen gemäß den Anweisungen der Herstellung bereichert. Der Hauptvorteil dieser Anreicherungsschritt soll die Qualität der hämatopoetischen Stammzellen, zu erkennen, die auf eine halbfeste Matrix hinzugefügt mit 50 ng/mL Stammzell-Faktor (SCF), 20 ng/mL Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF), 20 ng/mL angebaut werden Interleukin-3 (IL-3), 20 ng/mL Interleukin-6 (IL-6), 20 ng/mL Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) und 3 verschiedenen Konzentrationen der EPA in 1.4.
   5. Verdünnen die Zellen auf 0,1 - 0,15 x 10 ⁶ mononukleären Zellen/mL oder 2 x 10 ³ CD34 ⁺ Zellen/mL durch Zugabe von kompletten IMDM Medium ergänzt mit EPO und Transfer 300 µL bis 3 mL Methocult H4434 Medium. Nach Erregung und einer kurzen Inkubation für 5 min Platte drei Mal 1,1 mL auf einer 35-mm-Schale. Zwei dieser Kultur Gerichte zusammen mit einem dritten - gefüllt mit Wasser - befinden sich in 100 mm Platten.
   6. Zellen sind in einem Inkubator befeuchtete 37 ° C mit 5 % CO ₂ für 14 Tage kultiviert.
3. Analyse der Kolonien
   1. Kolonien sind entsprechend ihrer Morphologie erzielte mit einem inversen Mikroskop bei 40 X Vergrößerung in der Kulturschale mit einem scoring Raster markiert. Für die Zwecke unserer Assay, der Kolonie bildende Einheiten (KBE) sind in 4 Kategorien eingeteilt: multipotenzielle Vorläuferzellen (KBE-GEMM), Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen (CFU-GM), platzen bildende Einheit-erythroiden (BFU-E) und koloniebildenden Einheit-erythroiden (CFU-E). Hersteller sehen ' s Anweisungen für weitere Kolonie Unterklassifizierungen.
   2. Für die weitere Analyse, Zellen von der KBE-Assay-Platte sind separat erholt nach den 4 Kategorien durch die Aussetzung in Raumtemperatur 4 mL PBS mit 2 % FCS/IMDM. Nach Zentrifugation bei 400 g für 10 min bei 4 ° C, die Zellen sind Nukleinsäuretablette mit PBS-Puffer, gezählt und verarbeitet für DNA-Extraktion.

3. Analyse der Chimärismus

1. DNA-Isolierung
   1. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400 g für 10 min.
   2. Isolieren DNA mit Hilfe einer Blutes DNA-Extraktion Kit (QIAmp DNA Blut Extraktion Kit). Vorwärmen der Elution Buffer (AE) bei 37 ° C zu erhöhen den Ertrag der eluierten DNA.
   3. Messen die DNA-Konzentration mit Nanodrop ND-1000 Spektren Photometer. Proben mit OD 260/280 zwischen 1,8-2,0 dienen zur weiteren Analyse.
   4. Verdünnen DNA mit DNAase frei H ₂ O, 0,1 ng/µL in einem Gesamtvolumen von 50 µL.
2. STR-Analyse
   1. Einrichten der PCR-Reaktion durch mischen Reaktion Mischung, AmplTaq Gold DNA Polymerase und Profiler Plus Primer-Set mit 20 µL genomischer DNA (0,1 ng/µL) entsprechend der Bedienungsanleitung (die Grundierung-Kit enthält die unbeschriftete Primer im Puffer, der STR-Loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, und D7S820 und Geschlecht Marker Amelogenin zu verstärken). Gehören Sie Nuklease-freies Wasser als Negativkontrolle und 9947A als Positivkontrolle. Vor Transplantation DNA von Spender und Empfänger sind ebenfalls enthalten.
   2. Führen Sie PCR-Reaktion mit Eppendorf Mastercycler Farbverlauf mit den folgenden Bedingungen: 95 ° C 11 Min 28 Verstärkung Zyklen von 95 ° C für 1 min, 59 ° C für 1 min und 72 ° C für 1 min, gefolgt von 60° C für 45 min.
   3. Set up Fragment Analyse Reaktion durch Zugabe von 12 µL Hi-Di Formamid und 0,5 µL GeneScan 500 ROX Größe Standard (alle Applied Biosystems) 1 µL des PCR-Produktes. Am ersten und letzten Position braucht man eine Allelic Strichleiter (Genotyper Amp Fl STR blau, II grün und gelb, Applied Biosystems).
   4. Elektrophorese und Übernahme mit der Elektrophorese Instrument beginnen.
   5. Analysieren Loci, Allele und Peak-Höhen von Proben und Kontrollen mit der Software ¹³.

Ergebnisse

Trennung von Lymphohematopoietic Vorfahren von FACS Zellsortierung

Hier zeigen wir die Ergebnisse von der Sortierung der notwendigen Zellpopulationen für nachgeschaltete STR Analyse. Knochenmark-Zellen wurden mit V450-konjugierten Anti-CD45, FITC-konjugierten Anti-CD36 und APC-konjugierten Anti-CD34 gebeizt. Die Bevölkerung von Interesse ist die Megakaryocyte erythroiden Vorläuferzellen (MEP), kernhaltigen Ze...

Diskussion

Das Ziel der aktuellen Studie ist es, dem Publikum eine Kombination aus beiden Ansätzen geben für Spender/Empfänger Chimärismus in erythroiden Vorläuferzellen nach HSCT bei Patienten analysieren für Hämoglobinopathien behandelt: 1.) Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmarkproben gefolgt von Analyse der kurze Tandemwiederholungen und 2.) koloniebildenden Einheit wächst der Knochenmarkzellen, Klassifizierung von Kolonien in verschiedenen Vorläuferzellen gefolgt von An...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR