Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Resumo

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Resumo

A presença de quimerismo incompleta é observada em uma grande proporção de pacientes após transplante de medula óssea para a talassemia major ou doença falciforme. Esta observação tem implicações tremendas, como estratégias de imunomodulação terapêutica subsequente podem melhorar os resultados clínicos. Convencionalmente, a análise baseada em reação em cadeia da polimerase de repetições curtas em tandem é usada para identificar o quimerismo em células de sangue de doadores-derivado. No entanto, esse método é restrito às células nucleadas e não conseguem distinguir entre linhagens de célula única dissociadas. Aplicamos a análise das repetições curtas em tandem para fluxo de células progenitoras hematopoiéticas cytometric-classificados e comparou-o com a análise de repetições curtas em tandem de unidades formadoras de estouro selecionada - eritroide colônias, ambos coletados do osso medula. Com este método... somos capazes de demonstrar as diferente proliferação e diferenciação das células do doador no compartimento eritroide. Esta técnica é elegível para completar o monitoramento atual de quimerismo em definindo o transplante de células estaminais e, portanto, pode ser aplicados estudos clínicos no futuro, investigação em células estaminais e design dos julgamentos de terapia de gene.

Introdução

Transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) é a abordagem curativa disponível apenas para uma variedade de desordens genéticas inatas do sistema hematopoiético, conseguindo taxas de sobrevida livre de doença de mais de 90% para outra forma altamente comprometida e vida útil limitada pacientes¹. A eficácia desta importante ferramenta terapêutica foi otimizada ao limitar a toxicidade de pré- e pós-transplante de regimes², mas também por intervenções destinadas a sustentar a função estável do enxerto, que é quantificada pelo acompanhamento atento da células de doador-derivado de^4,3,5.

Em geral, o quimerismo completo (CC) implica a substituição total do compartimento lymphohematopoietic pelo doador-derivado de células, enquanto o termo misturado quimerismo (MC) é usado quando o doador e receptor derivada de células estão presentes simultaneamente em vários proporções. Quimerismo Split (SC) denota a coexistência de quimerismo misto observada em linhagens de célula única, tal como no compartimento eritroide. Determinação rápida do status de quimerismo após TCTH é fundamental, como pode ajudar a identificar os pacientes suscetíveis para recidiva da doença e estratégias de iniciar immunomodulatory subsequentes, como infusões de linfócitos do doador ou redução de imunossupressores terapias⁶.

Vários métodos foram desenvolvidos para o monitoramento de enxertia após TCTH. Segundo de imunoglobulinas e análise citogenética tem sensibilidade pobre e são limitados em sua capacidade de detectar o polimorfismo^7,8. A introdução de hibridação fluorescente em situ (FISH) pode aumentar a sensibilidade no acompanhamento de quimerismo após TCTH, mas é restrita ao sexo-incompatíveis aloenxertos⁹. Atualmente, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é o mais difundido método usado para detectar quimerismo e baseia-se na electroforese do gel de agarose-acrilamida convencional das repetições em tandem de número variável (alelos) ou repetições de curta em tandem (STRs). Usada rotineiramente o PCR quantitativo é capaz de detectar uma extremamente pequena proporção de células de doador residual após TCTH. A grande limitação dos estudos até agora é que MC deteção é quase exclusivamente limitada a presença de células nucleadas, ao invés de eritrócitos maduros, ou seja, as células que é funcionalmente crucial para os pacientes afetados por hemoglobinopatias. Em pacientes com diferentes grupos de sangue, vale lembrar que a análise cytofluorometric é capaz de identificar quimerismo em glóbulos vermelhos, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos eritrócitos antígenos ABO e C, c, D, E e e^{10 , 11}. um meio diferente, mas muito interessante de avaliar quimerismo na linhagem eritroide é a combinação de fluxo cytometric classificação dos progenitores eritroide e seleção de vários tipos de progenitor eritroide pelo cultivo em ensaios de clonogenic, seguido de análise de STR¹². Esta abordagem é capaz de quantificar as proporções relativas de quimerismo doador-versus-receptor no compartimento eritroide e pode ser utilizada na estratégia para sustentar o enxerto de medula óssea.

Protocolo

1. isolamento de medula óssea células hematopoiéticas classificando multiparâmetro fluorescência-ativado celular

1. amostra de coloração
   1. antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparado:
      1. mídia de gradiente para a preparação de mononucleares células tubos (GM), 50 mL cônica
      2. 12 x 75 mm tubos de fluxo para coloração de células
      3. coloração tampão: tampão fosfato salino (PBS) + 3% de soro de vitela fetal (FCS)
      4. pipetas < / l Eu >
      5. FC bloco e coloração anticorpos (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Com esta combinação de fluorocromo há repercussões insignificantes em outros canais, mas qualquer outra combinação de fluorocromo adequado também é possível.
      6. Contas de compensação (se necessário)
      7. Buffer de suspensão: Hank ' s solução sal equilibrado (HBSS) + 25mm HEPES + FCS 3%
      8. Trypan azul e hemocytometer
      9. Tubos de colheita: qualquer meio rico com tubos de soro elevado (contendo 1 mL FCS + 25mm HEPES) pode ser usado para a coleção de células classificadas.
      Amostra de
      10. da medula óssea: consentimento informado para biópsia de medula óssea da crista ilíaca da parte de trás do osso do quadril é normalmente exigido. A amostra de medula óssea é que manteve em seringas heparinizadas em RT até coloração. As seguintes etapas de protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes da instituição ' Comissão de ética de pesquisa humana de s para o bem-estar humano.
   2. Gerar uma suspensão única célula da amostra da medula óssea. Adicione 3 mL de GM para o tubo de centrifugação. Camada cuidadosamente a 4 mL de suspensão de célula única para a solução da GM. Centrifugar a 550 g por 30 min a 20 ° Celsius (C) (freio está desligado). Desenhar de camada superior contendo plasma e plaquetas usando uma pipeta estéril, deixando a camada de células mononucleares imperturbável na interface. A camada de células mononucleares de transferência para um tubo de centrifuga estéril com uma pipeta estéril.
   3. Após a lavagem com 5 mL de tampão de coloração, Ressuspender as células em 2 mL de tampão de suspensão e determinar a concentração de células. Lugar 5 µ l de suspensão de células em um tubo de ensaio de tampa de rosca. Adicione 95 µ l de mancha azul Trypan de 0,2%. Misture bem. Deixe repousar durante 5 min à temperatura ambiente. Preencha um hemocytometer quanto a contagem de células. Sob um microscópio, observar se não viáveis estão manchadas e contagem de células viáveis.
   4. Centrifugar as células a 250 g por 10 min a 20 ° C, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células de coloração, o buffer em uma concentração de 1 x 10 ⁶ por 100 µ l.
   5. Bloco FcR pelo uso de 2,5 µ g bloco Fc, por 1 x 10 ⁶ células no gelo por 10-15 min.
   6. Add a combinação adequada de 10 µ g mAb para manchar a 1 x 10 ⁶ células e incubar durante 20 min a 4 ° C, no escuro, seguido por uma etapa de lavagem com 3 mL de tampão de coloração. Para a correta compensação, pequenas alíquotas das células (ou de preferência grânulos de compensação) estão manchadas com anticorpos único cada; uma alíquota restante imaculado.
   7. Ajustar a concentração de 20 x 10 ⁶ células/mL.
   8. Conjunto para cima e otimizar o classificador de pilha. O processo de criação de um citômetro de fluxo e software é padronizado com uma instrução detalhada fornecida pela companhia e precisa ser executada por pessoal adequadamente treinado.
2. Sorting no classificador de célula
   1. preparar tubos para colheita de passo 1.1.1.9.
   2. Configurar um modelo que inclui um enredo bivariado para exibir forward scatter (FSC) e dispersão lateral (SSC).
   3. Executar as células e ajustar FSC/SSC para colocar a população de interesse em escala
   4. Gravar o tubo controle negativo.
   5. Executar os tubos simples controle positivo; gravar os dados para cada tubo.
   6. Calcular a compensação manualmente ou automaticamente com a função fornecida pelo software de aquisição.
   7. Adquirir a amostra experimental e portão-los em um bivariada FSC/SSC ponto terreno ( figura 1A) para incluir células linfoide e mieloides. Excluir parelhas e agregados, comparando os diferentes sinais de FSC (i.e., altura, largura e área) ( figura 1B). Visualizar as células singlete em um terreno de ponto bivariada exibindo CD45 e CD36 ( Figura 1). Eventos positivos para CD45 são leucócitos (incluindo seus progenitores), aqueles negativos para CD45 e positivos para CD36 são progenitores eritroide. Use ferramentas associadas para definir CD36 + (se desejado, estas células podem ser divididas em CD36 alta e baixa expressando as células) e células CD45 +. Visualize eventos CD45 + em outra trama do ponto, exibindo parâmetros CD34 e SSC. Uso de gating ferramentas para definir células CD34 + (progenitores de leucócitos) e CCD altas células (células mieloides em vários estágios de diferenciação).
   8. Uma vez que os portões foram determinados, os portões podem ser selecionados para classificação para tubos de coleta externa.
   9. Prosseguir com a classificação em 4 ° C até que tenha sido obtido o número necessário de células
   10. Realizar uma análise pós-tipo para determinar a pureza das populações de célula classificada ( Figura 1E, 1F).

2. Ensaio de Clonogenic

1. preparação dos reagentes
   antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados:
   1. pipetas, placas de 100mm
   2. Trypan azul e hemocytometer
   3. reconstituir humana recombinante eritropoietina (EPO) em 500 U/mL em PBS estéril, contendo pelo menos 0,1% albumina de soro humano. Divida essa solução em pequenas alíquotas e manter a-20 ° C para evitar o congelamento e descongelamento repetido.
   4. Preparar completa Iscove ' s modificado Dulbecco ' s médio (IMDM) com concentrações finais de 5% FCS, 2mm glutamina, 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina (PS). Adicionar humana recombinante eritropoietina (EPO) em diferentes concentrações em poços separados para o meio IMDM completo: 3 unidades EPO/bem, 6 unidades EPO/poço e 12 EPO unidades/poço (1x, 2x, 4 x EPO respectivamente).
2. Preparação de células de medula óssea
   1. 10 mL da amostra diluída com 20 mL de PBS medula óssea lentamente são empilhados em cima de 15 mL de meio gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mL, mantendo uma interface clara entre as duas fases e você nder condições estéreis. Centrifugar os tubos cônico de 15 mL a 550 x g durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com definido como 9 de aceleração e desaceleração definida como 0 (ou freio desligado).
   2. Após a centrifugação, remover a interface para um novo tubo de 50 mL e adicionar PBS até um volume final de 50 mL.
   3. Após a centrifugação com 250 g por 10 min a 10 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio IMDM completo em aproximadamente 0,5 x 10 ⁶ células/mL. Ter 10 µ l de suspensão de células em um microtubo, misturar com o mesmo volume de solução de azul de Trypan (0,4%) e contar usando um hemocytometer.
   4. OGrupo: células CD34 + são enriquecidas por célula magnética classificação com grânulos Milteny CD34 de acordo com as instruções dadas pelo fabricante. A principal vantagem desta etapa de enriquecimento é detectar a qualidade de células-tronco hematopoiéticas, que são cultivadas em uma matriz semi-sólida adicionada com 50 ng/mL stem cell factor (SCF), 20 ng/mL Granulócito-macrófago colônia-estimulando factor (GM-CSF), 20 ng/mL interleucina-3 (IL-3), 20 ng/mL interleucina-6 (IL-6), fator colônia-estimulando do 20 ng/mL granulócitos (G-CSF) e 3 diferentes concentrações de EPO como em 1.4.
   5. Diluir as células de 0,1 - 0,15 x 10 ⁶ mononucleares células/mL ou 2 x 10 ³ CD34 ⁺ células/mL, adicionando-se meio IMDM completo suplementado com EPO e transferência 300 µ l para 3 mL Methocult H4434 médio. Após agitação e uma curta incubação por 5 min placa três vezes 1,1 mL em um prato de 35 mm. Dois desses pratos de cultura juntamente com um terceiro - cheio de água - são colocados em placas de 100 mm.
   6. Células são cultivadas em uma incubadora umidificado 37 ° C com 5% de CO ₂ por 14 dias.
3. Análise das colónias
   1. colónias são marcadas de acordo com sua morfologia com um microscópio invertido na ampliação de X 40 em um prato de cultura marcada com uma grade de pontuação. Para efeitos do nosso ensaio, as unidades formadora de Colônia (UFC) são classificadas em 4 categorias: células progenitoras pluripotentes (CFU-GEMM), as células progenitoras de granulócitos-macrófagos (CFU-GM), estourar formando unidade-eritroide (BFU-E) e formadoras de unidade-eritroide (UFC-E). Consulte o fabricante ' instruções de s para a subclassificação de colônia mais.
   2. Para posterior análise, células da placa de ensaio de UFC são recuperadas separadamente de acordo com as 4 categorias, suspendendo em temperatura ambiente 4 mL PBS contendo 2% FCS/IMDM. Após a centrifugação a 400 g durante 10 minutos a 4 ° C, as células são resuspended em PBS, contadas e processadas para extração de DNA.

3. Análise de quimerismo

1. Isolamento de DNA
   1. as células por centrifugação a 400 g por 10 min. de pelotas
   2. Isolar DNA usando um kit de extração de DNA (sangue de DNA QIAmp kit de extração) de sangue. Pré-aquecer o tampão de eluição (AE) a 37 ° C, para melhorar o rendimento do ADN eluted.
   3. Medir a concentração de DNA com Fotômetro de espectros Nanodrop ND-1000. Amostras com OD 260/280 entre 1.8-2.0 são utilizadas para análises posteriores.
   4. DNA diluir com DNAase livre H ₂ O para 0.1 ng / µ l em um volume total de 50 µ l.
2. STR-análise
   1. Configurar a reação de PCR, misturando o Mix de reação, AmplTaq ouro DNA polimerase e Profiler Plus Primer conjunto com 20 µ l DNA genômico (0.1 ng / µ l) de acordo com o manual (o cartilha kit contém o sem rótulo primers em buffer para amplificar os loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 e D7S820 e a amelogenina marcador de gênero). Incluem água nuclease livre como controle negativo e 9947A como controle positivo. Pré-transplante DNA do dador e do receptor também estão incluídos.
   2. Reação de PCR executar usando Eppendorf mastercycler gradiente com as seguintes condições: 95 ° C por 11 min, 28 ciclos de amplificação de 95 ° C por 1 min, 59 ° C por 1 min e 72 ° C por 1 min, seguido de 60° C, durante 45 min.
   Reação de análise
   3. conjunto acima fragmento adicionando 12 µ l Hi-Di Formamid e 0,5 µ l GeneScan 500 ROX tamanho padrão (todas Applied Biosystems) a 1 µ l de produto do PCR. A primeira e a última posição é necessário uma escada alélica (Amp Genotyper Fl STR azul, II verde e amarelo, Applied Biosystems).
   4. Começar a electroforese e aquisição com o instrumento de eletroforese.
   5. Analisar Loci, alelos e alturas de amostras e controles com o software ¹³.

Resultados

Separação dos progenitores lymphohematopoietic classificando FACS celular

Demonstramos aqui os resultados da classificação as populações de células necessárias para a análise de STR a jusante. Células da medula óssea foram coradas com V450-conjugado anti-CD45, anti-CD36 conjugado FITC e APC-conjugado anti-CD34. A população de interesse é as megacariócito eritroide progenitores (MEP), nucleated as ...

Discussão

O objetivo do estudo atual é fornecer ao público uma combinação das duas abordagens para analisar quimerismo doador/beneficiário em eritroide progenitores após TCTH em pacientes tratados para hemoglobinopatias: 1.) classificação de fluorescência-ativado da pilha de células progenitoras hematopoiéticas em amostras de medula óssea, seguidas de análise de repetições curtas em tandem e 2.) unidade formadoras de cultivo de células de medula óssea, a classificação das colônias em vários tipos de progenitor...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Remove RBC
50 mL conical tubes	Falcon	14-432-22	Sample preparation
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS sorting
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023	PBS
Fetal calf serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (heat-inactivated)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypan blue	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspension buffer in FACS analysis
HEPES	Gibco	15630080	Component of suspension buffer
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Component of Culture Medium
CD34+ magnetic beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ purification
Recombinant  human G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  human SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  human GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  human IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  human IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extraction kit	Qiagen	51306	DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 spectra photometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Quantification
DNAase free H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR