JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Electroconvulsive الاستيلاء (ECS) نموذج حيوانات تجريبية للعلاج اليكتروكونفولسيفي للاكتئاب الشديد. ECS عالمياً يحفز النشاط في قرن آمون، مما يؤدي إلى سينابتوجينيسيس واللدونه متشابك. وهنا يصف لنا طرق الاستقراء ECS في الفئران ووجود سوبسيلولار من هيبوكامبي بهم دراسة التغيرات المستحثة بالضبط في البروتينات متشابك.

Abstract

الاستيلاء على اليكتروكونفولسيفي (ECS) نموذج حيوانات تجريبية electroconvulsive العلاج، العلاج الأكثر فعالية للاكتئاب الشديد. ECS يستحث المعمم منشط رمعي المضبوطات مع انخفاض معدلات الوفيات، وموت الخلايا العصبية، وهو نموذج يستخدم على نطاق واسع للعقاقير المضادة للصرع الشاشة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الاستقراء ECS في الذي يتم تسليم الحالي 55-اماه موجزاً عن 0.5 الجرذان s للذكور 200-250 جم في الوزن عن طريق أقطاب مشبك الإذن. هذا التحفيز الثنائية أنتجت المرحلة 4-5 رمعي المضبوطات التي استغرقت حوالي 10 ثانية. بعد وقف ECS الحاد أو المزمن، شام معظم الفئران استعادت منشودا سلوكيا من الفئران "لا مصادرة". لأنه يرفع ECS عالمياً نشاط الدماغ، كما استخدمت لدراسة التعديلات المعتمدة على نشاط البروتينات متشابك وآثارها على قوة متشابك باستخدام أساليب متعددة. على وجه الخصوص، يتيح تجزئة سوبسيلولار بوستسينابتيك كثافة (PSD) في تركيبة مع النشاف الغربية لتحديد كمي لوفرة البروتينات متشابك في هذا الهيكل متشابك المتخصصة. على النقيض من أسلوب تجزئة سابقة التي تتطلب كمية كبيرة من أدمغة القوارض، يصف لنا هنا أسلوب تجزئة صغيرة لعزل مديرية الأمن العام من هيبوكامبي من فأر واحد، دون السكروز التدرج الطرد المركزي. باستخدام هذا الأسلوب، نظهر أن الكسر PSD معزولة تحتوي على بروتينات الغشاء بوستسينابتيك، بما في ذلك PSD95، GluN2B، و GluA2. سينابتوفيسين ماركر presynaptic وقابل للذوبان بروتين هيولى α-tubulin استبعدت من الكسر مديرية الأمن العام، مما يدل على نجاح PSD العزلة. وعلاوة على ذلك، انخفض ECS المزمنة التعبير GluN2B في مديرية الأمن العام، مشيراً إلى أن لدينا أسلوب تجزئة PSD الصغيرة يمكن تطبيقها على الكشف عن التغييرات في البروتينات PSD هيبوكامبال من فأر واحد بعد العلاجات الجينية أو صيدلانية أو الميكانيكية .

Introduction

وقد استخدمت العلاج اليكتروكونفولسيفي لعلاج المرضى الذين يعانون من اضطرابات الاكتئاب الرئيسية، بما في ذلك الاكتئاب المقاوم للعقاقير والاكتئاب الثنائي القطب وأمراض باركنسون ومرض الفصام1،2. في هذا العلاج، وتولد الاستيلاء على التحفيز الكهربائي تسليمها إلى رئيس تخديره من المرضى عن طريق ابيكرانيال أقطاب1،،من23. وقد الإدارة المتكررة من ECS سريرياً مفيدة لاضطرابات الاكتئاب المقاوم للأدوية1،،من23. ومع ذلك، ظل الآلية الدقيقة الأساسية الطويلة الأجل فعالية تأثير الاكتئاب في البشر هدفا بعيد المنال. ECS هو نموذج حيوان للعلاج اليكتروكونفولسيفي، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في آليته العلاجية. في القوارض، ECS الحادة والمزمنة ECS العلاج تعزيز الخلايا الكبار في هيبوكامبي وإعادة تنظيم شبكات عصبونية4،5، التي من المرجح أن تساهم التحسينات في المرونة المعرفية. وعلاوة على ذلك، يغير الارتفاع العالمي لنشاط الدماغ ECS وفرة النصوص، مثل دماغ المستمدة عامل تم6، والبروتينات متعددة، بما في ذلك ميتابوتروبيك غلوتامات مستقبلات 17 و N-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) نوع غلوتامات مستقبلات مفارز7. وتشارك هذه التغييرات في وساطة طويلة الأجل التعديل رقم المشبك وهيكل وقوة في8،،من7الحصين9.

في نماذج ECS، يتم تسليم التحفيز الكهربائي للقوارض عن طريق أقطاب مزروع ستيريوتاكسيكالي أو أقطاب القرنية أقطاب الإذن لاستحضار المضبوطات منشط رمعي المعمم10،11. ستيريوتاكسيك غرس أقطاب ينطوي على جراحة الدماغ، ويتطلب قدرا كبيرا من الوقت لتحسين مهارات المجرب العمليات الجراحية للتقليل من الإصابة. يمكن أن يسبب كشط القرنية وجفاف أقطاب القرنية أقل الغازية وتتطلب التخدير. استخدام أقطاب الإذن-كليب يتجاوز هذه القيود لأنها يمكن استخدامه على القوارض دون الجراحة أو التخدير، وتتسبب في إصابة الحد الأدنى. وفي الواقع، وجدنا أن الفئران تم تسليمها إلى مستيقظا الحالية عن طريق أقطاب الإذن-كليب موثوق الحث على مضبوطات منشط رمعي المرحلة 4-5 ويغير البروتينات متشابك في هذه هيبوكامبي10.

دراسة وفرة المستحثة ECS البروتينات متشابك في مناطق محددة من الدماغ القوارض، من المهم أن تختار الأساليب التجريبية التي الأكثر ملاءمة للكشف والتحديد الكمي. وجود سوبسيلولار في الدماغ يسمح لعزل النفط الخام القابلة للذوبان البروتينات سيتوسوليك؛ بروتينات الغشاء؛ عضية-حدود البروتينات؛ وحتى البروتينات في هياكل سوبسيلولار الخاصة، مثل ال13،،من12مديرية الأمن العام14. مديرية الأمن العام هو مجال سوبسيلولار كثيفة ومنظمة تنظيماً جيدا في الخلايا العصبية التي بروتينات متشابك مركزة للغاية في وبالقرب من غشاء بوستسينابتيك12،،من1315. عزل مديرية الأمن العام مفيدة لدراسة البروتينات متشابك أثري في مديرية الأمن العام، منذ التغيرات الدينامية في وفرة ووظيفة مستقبلات الغلوتامات بوستسينابتيك والسقالات البروتينات والبروتينات في توصيل الإشارات في مديرية الأمن العام12 , 15 , 16 , 17 ترتبط اللدونة متشابك وسينابتوباثي لوحظت في العديد من الاضطرابات العصبية17،18. طريقة تجزئة سوبسيلولار سابقة تستخدم لتنقية مديرية الأمن العام تشارك عزلة الكسر تستعصي على الحل المنظفات من الكسر الخام غشاء المخ بالطرد المركزي التفاضلي السكروز التدرجات14، 19-ويتمثل التحدي الرئيسي بهذا الأسلوب التقليدي فإنه يتطلب كميات كبيرة من القوارض العقول14،19. إعداد القوارض 10-20 لعزل الكسر PSD كل معاملة يتطلب تكلفة كبيرة واستثمار الوقت وليست قابلة للتطبيق عمليا إذا كان هناك العديد من العلاجات.

للتغلب على هذا التحدي، ونحن قد تكيفت أسلوب أبسط مباشرة يعزل الكسر PSD، دون السكروز التدرج الطرد المركزي2120،، وتنقيحه لتكون قابلة للتطبيق لعزل مديرية الأمن العام من هيبوكامبي من فأر واحد الدماغ. لدينا أسلوب تجزئة PSD صغار غلة عن 30-50 ميكروغرام من البروتينات مديرية الأمن العام من هيبوكامبي 2، كافية لاستخدامها في عدة فحوصات الكيمياء الحيوية، بما في ذلك إيمونوبريسيبيتيشن وغرب النشاف. النشاف الغربية يوضح نجاح أسلوبنا لعزل مديرية الأمن العام بالكشف عن إثراء بوستسينابتيك كثافة البروتين 95 (مديرية الأمن العام-95) واستبعاد سينابتوفيسين ماركر presynaptic وقابل للذوبان بروتين هيولى α-توبولين. لدينا ECS التعريفي وطرق تجزئة PSD الصغيرة هي قابلة للتكيف بسهولة إلى مناطق أخرى في الدماغ القوارض وتوفر طريقة بسيطة نسبيا ويمكن الاعتماد عليها لتقييم آثار ECS على التعبير عن البروتينات مديرية الأمن العام.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية بما في ذلك المواد الحيوانية أقرتها لجنة الاستخدام في جامعة إيلينوي في اوربانا-الشمبانيا ورعاية الحيوانات المؤسسية.

1-الحفاظ على مستعمرة الفئران

  1. تتكاثر الفئران سبراغ داولي (انظر الجدول للمواد) والحفاظ عليها في الشروط القياسية بدوره الضوء الظلام 12-ح ومتواصلة للحصول على الغذاء والماء.
  2. فطم الجراء الفئران في يوم ما بعد الولادة (ع) 28 وتضعهم في مجموعات من 2-4 ليتيرماتيس الذكور أو الإناث.
  3. علامة ذيول الفئران الذكور مع علامة سوداء دائمة غير سامة لتحديد الهوية.
  4. تزن ذكور الفئران 3 مرات في الأسبوع، وسجل بها بوديويايتس.

2-إعداد جهاز ECS

  1. الساعة 07:30 ص، تطهير على مقاعد البدلاء في غرفة إعداد الحيوانات ووضع جهاز ECS (مولد نبض) على مقاعد البدلاء.
  2. مكان الفئران ذكور فردية وزنها 200-250 غم في قفص نظيفة وفارغة مع غطاء. كرر ذلك لجميع الفئران الذكور تعامل مع التعريفي ECS. واسمحوا الفئران روض لمدة 30 دقيقة.
  3. بينما هي التعود على الفئران في اقفاصها، تعيين مولد نبض لتحريض ECS بوتيرة النبضات 100/s، عرض نبض 0.5 مللي ثانية، ومدة صدمة 0.5 s، وتيار من 55 mA (الشكل 1أ).
  4. إعداد مولد النبض بالضغط على الزر "إعادة تعيين" وضمان أن يضيء الزر "الاستعداد". تأكد من أن مقاطع الإذن غير مرفقة بمولد نبض وثم اضغط على زر "صدمة" لبضع ثوان.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، مولد النبض استعداد لتحريض ECS.
  5. قم بتوصيل مقاطع الإذن مولد النبض.

3-تحريض ECS الحادة

ملاحظة: انظر الشكل 1ب، أعلى اللوحة.

  1. الرطب مقاطع الإذن مع المحلول الملحي المعقم والتأكد من أن أنها المشبعة.
  2. ويت الأذنين في الفئران مع المحلول الملحي المعقم بالالتفاف عليها في شاش غارقة في المياه المالحة. حالما يتم الرطب، إزالة الشاش.
  3. إرفاق قصاصة واحدة في الإذن، وموقف خارج الفرقة الغضروف الرئيسية.
  4. تأكيد على جهاز ECS قيام حلقة حقيقية؛ إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف تظهر رسالة خطأ أو قراءة "1" على الجهاز.
  5. ارتداء قفاز سميك، وغير المعدنية. أثناء الضغط الفئران برفق في يد القفاز، اضغط على زر "صدمة" لبضع ثوان وبطء الإفراج عن القبضة على الفئران للاحتفال بالاستيلاء على. للشام "لا الاستيلاء على" (NS) السيطرة، والتعامل مع الفئران مطابق تماما ولكن لا يسلم الحالية.
  6. قطع القصاصات الإذن كما يبدأ رمع وتسجيل السلوك ضبطها وفقا لمقياس رأسين المنقحة في22 الذي يتضمن "حركات الفم والوجه" (المرحلة 1)، "رئيس الإيماء" (المرحلة 2)، "رمع فوريليمب" (المرحلة 3)، "تربية مع رمع فوريليمب" (المرحلة 4)، و "تربية والوقوع مع رمع فوريليمب" (المرحلة 5). ينبغي أن تستمر الاستيلاء على ما يقرب من 10 ق؛ سجل مدة الحجز باستخدام جهاز ضبط وقت.
  7. في أعقاب انتهاء الاستيلاء، العودة الفئران إلى قفصة المنزل. مراقبة الفئران لآخر 5 دقائق للتأكد من استرداد الفئران من المضبوطات. يبقيه على مساكن منفردة في القفص والعودة القفص في غرفة الإنعاش.
  8. كرر التعريفي ECS في الفئران القادمة.
  9. مراقبة الفئران طوال الفترة المتبقية من اليوم وعلى الأقل مرة واحدة في الصباح ومرة واحدة في فترة بعد الظهر وفي اليوم التالي حتى أنها هي euthanized للتجارب.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي أسلوب الحث ECS إلى علامات سريرية كتأثير الجانب عرضي، الأمر الذي يتطلب الاهتمام. على سبيل المثال، يمكن أن تحفز البروتوكول التعريفي ECS المضبوطات التي تستمر أكثر من 15 s والسبب لا لزوم لها من الشدة على الفئران. وفي هذه الحالة، إنهاء الاستيلاء على استخدام الديازيبام (10 مغ/كغ، والقائمة) أو بينتوباربيتال (25-30 ملغ/كغ، والقائمة). إذا كان وضع الفئران الضائقة التنفسية أو تشوهات سلوكية خطيرة عقب الاستيلاء على الوقف، euthanize لهم باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بقطع الرأس.

4-تحريض ECS المزمن

ملاحظة: انظر الشكل 1ب، أسفل لوحة.

  1. حمل ECS واحد يوميا في نفس الوقت في الصباح كما هو موضح في الخطوات 1-3 أعلاه، لمدة سبعة أيام متتالية.
  2. مراقبة الفئران مرتين يوميا بعد عودتهم إلى وطنهم الأقفاص.

5. التجانس وتجزئة من الفئران هيبوكامبي

ملاحظة: انظر الشكل 2.

  1. إعداد المخزن مؤقت تجانس طازجة (الحل A) الذي يحتوي على السكروز 320 مم، بيروفوسفات صوديوم 5 مم، 1 مم يدتا، 10 مم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 200 حمض أوكاديك شمال البحر الأبيض المتوسط، ومثبطات البروتياز. عامل التصفية-تعقيم المخزن المؤقت باستخدام عوامل التصفية مع حجم مسام ميكرومتر 0.22 للترشيح فراغ ووضعه على الجليد.
  2. في وقت معين نقطة عقب ECS الحادة أو المزمنة ECS (الشكل 1)، euthanize الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 ل 5-10 دقيقة، متبوعاً بقطع الرأس باستخدام مقصلة.
  3. إزالة الدماغ وتشريح هيبوكامبي على لوحة معدنية توضع على الجليد، كما هو موضح سابقا23،24.
  4. طبق هيبوكامبي مكان اثنين من الفئران واحد على ثقافة الأنسجة عيار 30 ملم وتخطر لهم إلى قطع صغيرة باستخدام مقص.
  5. نقل هيبوكامبي مفروم إلى الخالطون زجاج يدوي استخدام ماصة 1 مل وإضافة 1 مل من تجانس المثلج المخزن المؤقت (الحل A, الخطوة 5، 1). إدراج مدقة جولة الخالطون زجاج. بينما الخالطون الزجاج على الجليد، بلطف وبشكل مطرد السكتة الدماغية صعودا وهبوطاً على مدقة 10-15 ضعفا عن 1 دقيقة، حتى تختفي قطع صغيرة من الأنسجة هيبوكامبال.
  6. نقل هوموجيناتي باستخدام ماصة 1 مل من أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل والطرد المركزي هوموجيناتي في 800 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لفصل المادة طافية بوستنوكلير (S1 الكسر) من بيليه الذي يحتوي على أنسجة غير قابلة للذوبان ونوى (P1 الكسر). نقل 50 ميليلتر وميليلتر 950 الكسر S1 إلى أنبوبين ميكروسينتريفوجي مل 1.7 منفصلة وجديدة باستخدام ماصة 1 مل وتخزين هذه الأنابيب على الجليد. حفظ بيليه الكسر P1 على الجليد.
  7. الطرد المركزي الكسر S1 (950 ميليلتر) لمدة 10 دقيقة في 13,800 س ز و 4 درجة مئوية لفصل المادة طافية (S2 الكسر)، غنية بالبروتينات سيتوسوليك القابلة للذوبان، وبيليه (كسر P2)، غنية بالبروتينات الغشاء زمنياً، بما في ذلك البروتينات سينابتوسومال. نقل الكسر S2 إلى ميكروسينتريفوجي 1.7 مل جديدة استخدام ماصة 1 مل وتخزينه على الجليد.
  8. ريسوسبيند بيليه (P2 الكسر) في 498 ميليلتر من الماء المنقي المثلج استخدام ماصة 1 مل. إضافة 2 ميليلتر من 1 "م حبيس" (درجة الحموضة 7.4) باستخدام ماصة 20 ميليلتر لتحقيق تركيز نهائي من 4 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4). تبني في 4 درجات مئوية مع إثارة لمخزن 30 دقيقة الكسر P2 ريسوسبينديد على الجليد.
  9. تحديد تركيز البروتين الكسور S1 و S2 و P2 مقايسة اتفاق التعاون الأساسي باستخدام. إضافة 50 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4) لكل جزء لتحقيق تركيز 1 ملغ/مل وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام، أو عملية الكسر P2 لعزل مديرية الأمن العام.

6-العزل لمديرية الأمن العام من الكسر البروتين (P2) غشاء النفط الخام

  1. الطرد المركزي الكسر P2 (500 ميليلتر) لمدة 20 دقيقة 25000 × ز و 4 درجات مئوية لفصل المادة طافية ليسيد (LS2 الكسر) وبيليه ليسيد (LP1 الكسر). نقل الكسر LS2 لأنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 جديدة باستخدام ماصة 1 مل وتخزينه على الجليد.
  2. ريسوسبيند بيليه LP1 في 250 ميليلتر من 50 مم هيبيس (درجة الحموضة 7.4) مختلطة مع 250 ميليلتر من المنظفات 1% في 1 × برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت باستخدام ماصة 1 مل. تبني في 4 درجات مئوية مع إثارة لطيف لمدة 15 دقيقة.
  3. الطرد المركزي ريسوسبينديد بيليه LP1 ح 3 25000 × ز و 4 درجة مئوية لفصل المادة طافية (جزء غير PSD) من بيليه (PSD الكسر). إزالة المادة طافية على أنبوب 1.7 مل ميكروسينتريفوجي وريسوسبيند بيليه مديرية الأمن العام في 100 ميليلتر من 50 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4) باستخدام ماصة 200 ميليلتر.
  4. تحديد تركيز البروتين LS2 وغير مديرية الأمن العام، والكسور مديرية الأمن العام استخدام مقايسة اتفاق التعاون الأساسي. إضافة 50 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4) لكل جزء لتحقيق تركيز 1 ملغ/مل وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: ينبغي بذل جميع الحلول المستخدمة في الخطوات من 5-6 (أي بالحل، حبيس المخزن المؤقت، وبرنامج تلفزيوني المخزن المؤقت) مع تنقية المياه خالية من الملوثات العضوية والأيونية والجسيمات.

7-الغربية النشاف

  1. ذوبان الجليد كل جزء من البروتين على الجليد. نقل 12 ميليلتر لكل جزء (S2، P2، ومديرية الأمن العام في 1 ملغ/مل) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 جديدة استخدام ماصة 20-ميليلتر.
  2. إضافة 3 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي x 5 عينة المخزن المؤقت واحتضان عند 75 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي. تبريد العينة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. تحميل 10 ميليلتر من العينة البروتين في كل بئر من 4-20% التدرج 15-جيدا مشط الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide جل التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) جل استخدام ماصة 20 ميليلتر. تشغيل الهلام في جهاز الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والخامس 80-100 في تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس، 190 مم جليكاين، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%؛ الرقم الهيدروجيني 8.3).
    ملاحظة: يجب أن تحتوي على كل جل عينات البروتين من NS الجرذان والفئران ECS في نقاط زمنية مختلفة عقب ECS الحاد أو المزمن.
  4. نقل البروتينات من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة جل لغشاء البولي فينيل ثنائي الفلوريد (PVDF) في جهاز نقل في الخامس 25-30 (60 mA) ح 9-12 في نقل المخزن المؤقت (25 مم تريس و 190 مم جليكاين 20% ميثانول؛ الرقم الهيدروجيني 8.3).
  5. إزالة الغشاء PVDF من جهاز نقل، وغسله في تريس مخزنة المالحة (تبس) لمدة 5 دقائق في دوار متعددة الأغراض في الرايت
  6. كتلة الغشاء في الحليب 5% و 0.1% 20 توين في تبس حاء 1 احتضان أنه في أجسام الأولية (الجدول 1) في المخزن المؤقت للغسيل (الحليب 1% و 0.1% 20 توين في تبس) بين عشية وضحاها في دوار متعددة الأغراض في 4 درجة مئوية (انظر الجدول للمواد اللازمة لتخفيف).
  7. يغسل الغشاء 4 مرات لكل 10 دقيقة في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، واحتضان ثم أنه مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق الأجسام المضادة الثانوية في الغسيل المخزن المؤقت لح 1 على دوار متعددة الأغراض في الرايت
  8. يغسل الغشاء 4 مرات لكل 10 دقيقة في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ومن ثم مع TBS لمدة 5 دقائق.
  9. احتضان الغشاء مع الركيزة تشيميفلوريسسينسي المعززة لمدة 1 دقيقة وتعريضه للأشعة السينية الفيلم. وضع الفيلم مكشوفة مع معالج فيلم.

8-التحديد الكمي للبقع الغربية

  1. مسح الغربية لطخة كملف TIFF، وحفظ هذا الملف إلى جهاز الكمبيوتر.
  2. فتح ملف لطخة غربية في برنامج إيماجيج كصورة رمادية، تحت "ملف"، "فتح الصورة،" سهم لليمين "تدرج الرمادي".
  3. اختر أداة التحديد المستطيل من شريط الأدوات إيماجيج ورسم مستطيل يغطي عصابة لطخة غربية واحدة من بروتين فائدة.
  4. تحت "تحليل،" ضرب "التدبير" للحصول على المنطقة وكثافة يعني النطاق المحدد.
  5. نقل المستطيل إلى منطقة خلفية دون تغيير الحجم والشكل. كرر الخطوة 8، 4 إلى المنطقة وكثافة يعني خلفية.
  6. طرح قيمة الكثافة يعني عصابة خلفية عن عصابة لطخة غربية، إعطاء كثافة طرح خلفية الفرقة من بروتين الفائدة.
  7. كرر الخطوات من 8.2 8.6 في كل لطخة غربية عصابات من الفائدة.
  8. تقسيم كثافة طرح خلفية الفرقة من بروتين اهتمام بكثافة موسيقى خلفية طرح منتج الجين التدبير المنزلي، مثل α-Tubulin؛ هذه الخطوة تعطي القيمة التي تم تسويتها من بروتين الفائدة.

النتائج

استخدام الإجراءات المفصلة المقدمة هنا، صدمة كهربائية واحدة (55 ماجستير، 100 البقول/s ل 0.5 s) تسليمها عن طريق الإذن-كليب أقطاب الناجمة عن مرحلة غير متكرر مضبوطات منشط رمعي 4-5 في الفئران (الشكل 1أ-ب). تلقي الحادة ECS التعريفي 8 مجموع الجرذان وعرض المضبوطات ...

Discussion

هنا، يمكننا وصف أسلوب الاستقراء ECS في الفئران التي يتسبب تحفيز نشاط الخلايا العصبية في هذه هيبوكامبي العالمية. ECS هو نموذج حيوان العلاج اليكتروكونفولسيفي، الذي يستخدم سريرياً لعلاج المخدرات اضطرابات الاكتئاب المقاوم للحرارة في البشر1،،من23...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتور إريك جيم بولتون للسماح لنا باستخدام أجهزة الطرد المركزي له لتجزئة والدكتور غراهام H. ديرينج في مختبر الدكتور ريتشارد لام هوجانير جامعة جون هوبكنز لتزويدنا بالبروتوكول الصغيرة لتجزئة مديرية الأمن العام.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

References

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126 NMDA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved