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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l'attività nell'ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Abstract

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello animale sperimentale di terapia elettroconvulsiva, il trattamento più efficace per la depressione grave. ECS induce i grippaggi tonico-clonic generalizzati con bassa mortalità e morte neuronale ed è un modello ampiamente usato ai farmaci antiepilettici schermo. Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS nel quale viene erogata una corrente di 55-mA breve per 0,5 s per uomo ratto 200-250 g di peso tramite elettrodi clip orecchio. Tale stimolazione bilaterale prodotto fase cloniche 4-5 che è durato circa 10 s. Dopo la cessazione dell'ECS acuta o cronica, maggior parte dei ratti ha recuperati per essere relativamente al comportamento indistinguibile da sham ratti "nessuna crisi". Perché ECS eleva a livello globale l'attività cerebrale, è stato utilizzato anche per esaminare le alterazioni di attività-dipendente di proteine sinaptiche e loro effetti sulla forza sinaptica utilizzando più metodi. In particolare, frazionamento subcellulare della densità post-sinaptica (PSD) in combinazione con Western blotting consente la determinazione quantitativa dell'abbondanza di proteine sinaptiche presso questa struttura sinaptica specializzata. In contrasto con un precedente metodo di frazionamento che richiede grandi quantità di cervello del roditore, descriviamo qui un metodo di frazionamento su piccola scala per isolare il PSD da ippocampi di un singolo ratto, senza centrifugazione in gradiente di saccarosio. Utilizzando questo metodo, mostriamo che le frazioni isolate di PSD contiene proteine di membrana postsinaptica, tra cui PSD95, GluN2B e GluA2. Presinaptici marcatore synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina sono stati esclusi dalla frazione PSD, dimostrando il successo isolamento PSD. Inoltre, ECS cronica diminuita espressione di GluN2B in PSD, che indica che il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala può essere applicata per rilevare i cambiamenti nelle proteine PSD hippocampal da una singolo ratto dopo trattamenti genetici, farmacologici o meccanici .

Introduzione

Terapia di Electroconvulsive è stata utilizzata per trattare pazienti con disturbi depressivi maggiori, tra cui grave depressione farmaco-resistenti, depressione bipolare, malattie di Parkinson e schizofrenia1,2. In questa terapia, il sequestro viene generato da stimolo elettrico consegnato alla testa dei pazienti anestetizzati via epicranica elettrodi1,2,3. Ripetitivo di ECS è stato clinicamente utile per i disturbi depressivi resistenti alla droga1,2,3. Tuttavia, l'esatto meccanismo alla base dell'efficacia a lungo termine dell'effetto antidepressivo in esseri umani è rimanere evasivo. ECS è un modello animale della terapia electroconvulsive ed è ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo terapeutico. Nei roditori, ECS acuta sia cronico trattamento ECS promuovere neurogenesi adulta negli ippocampi e riorganizzare la rete neurale4,5, che rischia di contribuire al miglioramento della flessibilità cognitiva. Inoltre, global elevazione dell'attività cerebrale di ECS altera l'abbondanza delle trascrizioni, come un cervello derivato fattore neurotropo6e più proteine, tra cui metabotropici del glutammato recettore 17 e la N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutammato recettore subunità7. Questi cambiamenti sono coinvolte nel mediare la modifica a lungo termine del numero di sinapsi, la struttura e la forza in ippocampo7,8,9.

Nei modelli ECS, stimolazione elettrica viene consegnata ai roditori tramite elettrodi impiantati stereotassicamente, elettrodi corneali o elettrodi auricolari per evocare i grippaggi tonico-clonic generalizzati10,11. Stereotassica impianto di elettrodi comporta un'operazione al cervello e richiede tempi significativi per migliorare le abilità chirurgica dello sperimentatore per minimizzare il danno. Meno invasivi elettrodi corneali potrebbero causare secchezza e abrasione corneale e richiede anestesia. L'uso di elettrodi clip orecchio ignora queste limitazioni perché può essere utilizzati su roditori senza chirurgia o anestesia e causare lesioni minime. Infatti, abbiamo trovato che corrente consegnati a sveglio ratti tramite clip orecchio elettrodi attendibilmente induce grippaggi tonico-clonic fase 4-5 e altera le proteine sinaptiche nel loro ippocampi10.

Per esaminare l'ECS indotte abbondanza di proteine sinaptiche nelle regioni specifiche del cervello dei roditori, è importante scegliere i metodi sperimentali che sono più adatti per la loro rilevazione e quantificazione. Frazionamento subcellulare del cervello consente l'isolamento grezza delle proteine citosoliche solubili; proteine di membrana; proteine dell'organello-limiti; e anche proteine in speciali strutture subcellulari, come ad esempio le PSD12,13,14. Il PSD è un dominio subcellulare denso e ben organizzato in neuroni in cui proteine sinaptiche sono altamente concentrati e vicino la membrana postsinaptica12,13,15. L'isolamento del PSD è utile per lo studio di proteine sinaptiche, arricchito il PSD, dal cambiamenti dinamici nell'abbondanza e nella funzione dei recettori postsinaptici del glutammato, ponteggi proteine e proteine di transduction del segnale nel PSD12 , 15 , 16 , 17 sono correlati con plasticità sinaptica e la synaptopathy osservata in diversi disturbi neurologici17,18. Un precedente metodo di frazionamento subcellulare utilizzato per purificare il PSD ha coinvolto l'isolamento della frazione detersivo-insolubili dalla frazione grezza della membrana del cervello tramite la centrifugazione differenziale di saccarosio gradienti14, 19. la grande sfida con questo metodo tradizionale è che richiede grandi quantità di roditore cervelli14,19. Preparazione dei roditori di 10-20 per isolare la frazione PSD per ogni trattamento richiede costi vasto e investimento di tempo e non è praticamente fattibile se ci sono molti trattamenti.

Per superare questa sfida, abbiamo adattato un metodo più semplice che direttamente consente di isolare la frazione PSD, senza saccarosio mediante centrifugazione in gradiente20,21e rivisto per essere applicabile all'isolamento PSD da ippocampi di un singolo ratto cervello. Il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala produce circa 30-50 µ g di proteine PSD da 2 ippocampi, sufficiente per l'impiego in diversi saggi biochimici, tra cui immunoprecipitazione e Western blotting. Macchiarsi occidentale dimostra il successo del nostro metodo per isolare il PSD rivelando l'arricchimento della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e l'esclusione di marcatore presinaptici synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina. Nostra induzione ECS e metodi di frazionamento PSD su piccola scala sono facilmente adattabili ad altre regioni del cervello del roditore e consentono di valutare gli effetti di ECS sull'espressione di proteine PSD in modo relativamente semplice e affidabile.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato di utilizzo presso la University of Illinois a Urbana-Champaign e istituzionali animali cura.

1. mantenere una colonia di ratto

  1. Allevare ratti Sprague-Dawley (Vedi la Tabella materiali) e mantenerli in condizioni standard con un ciclo luce-buio 12 h e ad libitum accesso a cibo e acqua.
  2. Svezzare i cuccioli di ratto al giorno postnatale (P) 28 e ospitarli in gruppi di 2-4 littermates maschio o femmina.
  3. Contrassegnare le code dei ratti maschii con un pennarello nero permanente non tossico per l'identificazione.
  4. Pesare i ratti maschii 3 volte a settimana e registrare il loro bodyweights.

2. preparazione di una macchina ECS

  1. Alle 7:30, disinfettare la panchina nella stanza di preparazione degli animali e posizionare una macchina ECS (Generatore di impulsi) sul banco.
  2. Posto un ratto maschio singolo peso di 200-250 g in una gabbia pulita, vuota con un coperchio. Ripetere l'operazione per tutti i ratti maschii di essere trattati con induzione ECS. Lasciate che i ratti habituate per 30 min.
  3. Mentre i ratti sono habituating nelle loro gabbie, impostare un generatore di impulsi per induzione ECS alla frequenza di 100 impulsi/s, una larghezza di impulso di 0,5 ms, una durata di scossa di 0,5 s e una corrente di 55 mA (Figura 1A).
  4. Preparare il generatore di impulsi spingendo il pulsante di "RESET" e assicurando che il pulsante "Pronto" è acceso. Assicurarsi che le clip orecchio non sono collegate ad un generatore di impulsi e quindi premere il pulsante di "SHOCK" per pochi secondi.
    Nota: A questo punto, il generatore di impulsi è pronto / a per induzione ECS.
  5. Collegare la clip orecchio il generatore di impulsi.

3. induzione di ECS acuta

Nota: Vedere Figura 1B, pannello superiore.

  1. Bagnare le clip orecchio con soluzione salina sterile e garantire che sono saturi.
  2. Bagnare le orecchie di un topo con soluzione salina sterile inserendole in una garza imbevuta di soluzione fisiologica. Una volta che sono bagnati, rimuovere la garza.
  3. Allegare una clip per orecchio, posizione oltre la band principale della cartilagine.
  4. Confermare sulla macchina ECS che è stabilito un vero ciclo; in caso contrario, verrà visualizzato un messaggio di errore o una lettura di "1" sulla macchina.
  5. Indossare un guanto di spesso, non-metallo. Mentre si tiene il ratto delicatamente in una mano guantata, premere il pulsante "SHOCK" per pochi secondi e rilasciare lentamente la presa sul ratto per osservare il sequestro. Per la farsa "nessuna crisi" (NS) controllare, gestire in modo identico il ratto ma non fornire la corrente.
  6. Scollegare le clip orecchio come clono comincia e registrare il comportamento di sequestro secondo una rivista di Racine scala22 che include "movimenti della bocca e del viso" (fase 1), "testa annuendo" (fase 2), "clono forelimb" (fase 3), "allevamento con il clonus arto anteriore" (fase 4) e "allevamento e cade con il clonus forelimb" (fase 5). Il sequestro dovrebbe durare circa 10 s; registrare la durata di sequestro utilizzando un timer.
  7. A seguito del termine grippaggio, tornare ratto alla sua gabbia a casa. Monitorare il ratto per un altro 5 minuti per assicurarsi che il recupero del ratto dai grippaggi. Keep it singolarmente ospitato nella gabbia e restituire la gabbia nella stanza di recupero.
  8. Ripetere l'induzione ECS su ratto successivo.
  9. Monitorare i ratti per tutto il resto della giornata e almeno una volta al mattino e una volta nel pomeriggio il giorno seguente fino a quando essi sono euthanized per esperimenti.
    Nota: Il metodo di induzione ECS potrebbe portare a segni clinici come effetto secondario incidentale, che richiede attenzione. Ad esempio, il protocollo di induzione ECS potrebbe indurre i grippaggi che durano più a lungo 15 s e causa inutili sofferenze ai ratti. In questo caso, terminare il sequestro usando diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se i topi sviluppano afflizione respiratoria o gravi anomalie comportamentali dopo la cessazione del sequestro, li eutanasia per inalazione di anidride carbonica seguita dalla decapitazione.

4. induzione di ECS cronica

Nota: Vedere la Figura 1B, pannello inferiore.

  1. Indurre un ECS al giorno allo stesso tempo la mattina come descritto nei passaggi 1-3, in precedenza, per sette giorni consecutivi.
  2. Monitor i ratti due volte al giorno dopo sono rientrato a casa loro gabbie.

5. omogeneizzazione e frazionamento di ratto ippocampi

Nota: Vedere la Figura 2.

  1. Preparare un tampone fresco omogeneizzazione (soluzione A) che contiene saccarosio di 320 mM, pirofosfato di sodio di 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 acido okadaico nM e inibitori della proteasi. Filtro-sterilizzare il buffer utilizzando filtri con un diametro dei pori 0,22 µm per filtrazione sotto vuoto e posizionarlo sul ghiaccio.
  2. In un dato momento punto seguito ECS acuta o cronica ECS (Figura 1), eutanasia ratto per CO2 inalazione per 5-10 min, seguita dalla decapitazione usando una ghigliottina.
  3. Rimuovere il cervello e sezionare ippocampi sulla placca di metallo posizionato su ghiaccio, come descritto in precedenza23,24.
  4. Posizionare due ippocampi da un ratto su una cultura di tessuto 30 mm piatto e tritateli in piccoli pezzi con le forbici.
  5. Trasferimento ippocampi macinati a un omogeneizzatore manuale vetro utilizzando una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciata (soluzione A, punto 5.1). Inserire un pestello rotondo in un omogeneizzatore di vetro. Mentre l'omogeneizzatore di vetro è il ghiaccio, delicatamente e costantemente corsa su e giù il pestello 10 - 15 volte per 1 min, in fino a piccoli pezzi di tessuto ippocampale scompaiono.
  6. Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 1 mL e centrifugare l'omogeneizzato a 800 x g per 10 min a 4 ° C per separare il surnatante postnuclear (frazione di S1) dal pellet contenente tessuto insolubile e nuclei (frazione di P1). Trasferire 50 µ l e 950 µ l della frazione S1 a due per microcentrifuga separata, nuovo 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzare questi tubi su ghiaccio. Salvare il pellet di frazione P1 sul ghiaccio.
  7. Centrifugare la frazione di S1 (950 µ l) per 10 min a 13.800 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (S2 frazione), arricchito con proteine citosoliche solubili, e il pellet (frazione di P2), arricchita con proteine di membrana-limita, tra cui proteine sinaptosomiali. Trasferire la frazione S2 a una nuova 1,7 mL microcentrifuga utilizzando una pipetta 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.
  8. Risospendere il pellet (frazione di P2) in 498 µ l di acqua purificata ghiacciata usando una pipetta 1 mL. Aggiungere 2 µ l di 1 M HEPES (pH 7.4) usando una pipetta di 20 µ l per ottenere una concentrazione finale di 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubare a 4 ° C con agitazione per 30 min. Store la frazione di P2 sedimento sul ghiaccio.
  9. Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni S1, S2 e P2 usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo, o la frazione di P2 per isolare il PSD di processo.

6. isolamento del PSD da frazione di proteina (P2) della membrana grezzo

  1. Centrifugare la frazione di P2 (500 µ l) per 20 min a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante lisato (frazione di LS2) e il pellet lisato (LP1 frazione). La frazione di LS2 di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.
  2. Risospendere il pellet LP1 in 250 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) mescolato con 250 µ l di 1% detergente in 1x tampone PBS utilizzando una pipetta da 1 mL. Incubare a 4 ° C con agitazione delicata per 15 min.
  3. Centrifugare il sedimento risospeso LP1 per 3 h a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (frazione non-PSD) dal pellet (frazione di PSD). Rimuovere il surnatante di un tubo del microcentrifuge 1,7 mL e risospendere il pellet PSD in 100 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) usando una pipetta 200 µ l.
  4. Determinare la concentrazione nella proteina della LS2, non-PSD e frazioni PSD usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Tutte le soluzioni utilizzate nei passaggi 5-6 (cioè, soluzione A, tampone HEPES e tampone PBS) dovrebbero essere fatta con acqua purificata privo di particelle e contaminanti ionici e organici.

7. Western Blotting

  1. Sciolga ogni frazione proteica su ghiaccio. Trasferire 12 µ l di ogni frazione (S2, P2 e PSD a 1 mg/mL) ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 20-µ l.
  2. 3 µ l di tampone di campione 5 x SDS e incubare a 75 ° C per 30 min in un bagno d'acqua. Raffreddare il campione a temperatura ambiente (RT).
  3. Caricare 10 µ l del campione della proteina in ciascun pozzetto della sfumatura 15-pozzo pettine di 4-20% gel di SDS-poliacrilammide gel di elettroforesi (SDS-PAGE) usando una pipetta di 20 µ l. Esegua il gel nell'apparato di SDS-PAGE e a 80-100 V in tampone di corsa (25 mM Tris, glicina 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3).
    Nota: Ogni gel dovrebbe contenere campioni proteici da ECS ratti in diversi momenti dopo ECS acuta o cronica e NS.
  4. Trasferimento delle proteine da SDS-PAGE gel in una membrana difluoruro di polivinile (PVDF) nell'apparato di trasferimento a 25-30 V (60 mA) per 9-12 h in tampone di trasferimento (25 mM Tris, glicina 190 mM e 20% metanolo; pH 8.3).
  5. Rimuovere la membrana PVDF dall'apparato di trasferimento e lavarlo in soluzione fisiologica tamponata (TBS) per 5 min in un rotatore multiuso a TA.
  6. Bloccare la membrana nel latte del 5% e 0.1% Tween-20 in TBS per 1 h. Incubare in anticorpi primari (tabella 1) in tampone di lavaggio (latte 1% e 0.1% Tween-20 in TBS) sull'agitatore multiuso a 4 ° C durante la notte (Vedi la Tabella materiali per diluizioni).
  7. Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e quindi viene quindi incubato con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari in buffer per 1h di lavaggio in un rotatore multiuso a TA.
  8. Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e poi con TBS per 5 min.
  9. Incubare la membrana con substrato di chemifluorescence avanzata per 1 min ed esporlo alla pellicola di raggi x. Sviluppare la pellicola esposta con un processore di pellicola.

8. quantificazione dei Western blot

  1. Scansione il Western blot come file TIFF e salvare questo file sul computer.
  2. Aprire il file di Western blot nel programma ImageJ come un'immagine in scala di grigi, sotto "File", "Apri immagine" freccia destra "scala di grigi".
  3. Scegliere lo strumento di selezione rettangolare dalla barra ImageJ e disegnare un rettangolo che copre una banda singola macchia occidentale di una proteina di interesse.
  4. Sotto "Analizza," colpire "Misura" per ottenere la zona e la densità media di una banda selezionata.
  5. Spostare il rettangolo in un'area di sfondo senza cambiare la sua forma e dimensione. Ripetere il passaggio 8,4 per la zona e la densità media di uno sfondo.
  6. Sottrarre il valore di densità media di una banda di sfondo da quello di una banda di Western blot, dà la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse.
  7. Ripetere i passaggi 8.2-8.6 per tutte le bande di Western blot di interesse.
  8. Dividere la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse per la densità di banda sottratto a sfondo di un prodotto del gene le pulizie, come α-tubulina; Questo passaggio produce il valore normalizzato della proteina di interesse.

Risultati

Utilizzando la procedura dettagliata presentato qui, una scossa elettrica (55 mA, 100 impulsi/s per 0,5 s) consegnati tramite clip orecchio elettrodi indotti non ricorrenti fase 4-5 grippaggi tonico-clonic in ratti (Figura 1A-B). Un totale 8 di ratti ha ricevuto induzione ECS acuta e visualizzato grippaggi tonico-clonic fase 4-5. I grippaggi è durato circa 10 s e tutti i ratti hanno recuperati entro 1-2 min di cessazione di sequestro. Ratti ...

Discussione

Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS in ratti che suscita la stimolazione globale dell'attività neuronale in loro ippocampi. ECS è un modello animale di elettroshockterapia, che è clinicamente utilizzato per trattare disturbi depressivi refrattario droga in esseri umani1,2,3. Nonostante l'uso della terapia di electroconvulsive per trattare la depressione severa, il preciso meccanismo di fondo rimane poco chiaro. Perch?...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il Dr. Eric C. Bolton per averci permesso di utilizzare la centrifuga per frazionamento e Dr. Graham H. Diering nel laboratorio del Dr. Richard L. Huganir di John Hopkins University per averci fornito il protocollo su piccola scala per il frazionamento di PSD.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Riferimenti

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