JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Özet

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi, şiddetli depresyon için en etkili tedavi deneysel hayvan bir modeldir. ECS düşük mortalite ve nöronal ölüm ile jeneralize Tonik klonik nöbetler neden olmaktadır ve ekran anti-epileptik ilaçlar için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada, bir ECS indüksiyon yöntemi açıklamak hangi kısa bir 55-mA akım 0,5 için teslim edilir içinde s erkek için 200-250 g ağırlığında kulak-küçük elektrotlar aracılığıyla sıçanlar. Üretilen bu tür ikili stimülasyon sahne yaklaşık 10 süren 4-5 klonik nöbetler s. Akut veya kronik ECS bırakma sonra en rats davranışsal ayırt olmak kurtarıldı "nöbet" fareler sham. ECS genel olarak beyin aktivitesini yükseltir çünkü da faaliyet bağlı değişiklikler sinaptik proteinlerin ve sinaptik gücü birden çok yöntem kullanarak üzerindeki etkileri incelemek için kullanılmıştır. Özellikle, bu özel sinaptik yapısı, sinaptik proteinlerin bereket kantitatif tayin postsinaptik yoğunluğu (PSD), Western Blot birlikte hücre altı ayırma sağlar. Kemirgen beyin büyük miktarda gerektiren bir önceki ayırma yöntemi aksine, biz burada Sükroz degrade Santrifüjü olmadan tek bir sıçan hippocampi dan PSD yalıtmak için küçük ölçekli ayırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, biz izole PSD kesir postsinaptik membran proteinlerinin, PSD95, GluN2B ve GluA2 de dahil olmak üzere içerir gösterir. Presynaptic işaretçisi synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin başarılı PSD yalıtım gösteren PSD kesir dışlandı. Ayrıca, kronik ECS GluN2B ifade bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi genetik, farmakolojik veya mekanik tedaviler sonra Hipokampal PSD proteinler tek bir sıçan gelen değişiklikleri algılamak için uygulanabilir olduğunu belirten PSD olarak azalmıştır .

Giriş

Elektrokonvulsif terapi ağır ilaca dirençli depresyon, bipolar depresyon, Parkinson hastalıkları ve şizofreni1,2de dahil olmak üzere büyük depresif bozuklukların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır. Bu terapi, nöbet elektrik uyarıcı epicranial elektrotlar1,2,3üzerinden imzalat hastalar başkanı teslim tarafından oluşturulur. ECS tekrarlayan yönetimini ilaca dirençli depresif bozukluklar1,2,3' e klinik olarak yararlı olmuştur. Ancak, uzun vadede etkinlik insanlarda antidepresan etkisi altında yatan kesin mekanizması zor kalmıştır. ECS Elektrokonvulsif terapi hayvan bir modeldir ve tedavi onun mekanizma araştırmak için yaygın olarak kullanılır. Rodents, akut ECS ve kronik ECS tedavi hippocampi yetişkin neurogenesis teşvik ve hangi bilişsel esneklik ilerleme-e doğru katkıda bulunmak olasıdır neural ağ4,5, yeniden düzenleyebilirsiniz. Ayrıca, beyin aktivitesi ECS tarafından küresel yükselmesine Tutanaklar, bolluk değiştirir gibi bir beyin neurotropic faktörü6ve metabotropic Glutamat reseptör 17 ve N-metil-D-aspartat dahil olmak üzere birden fazla protein elde (NMDA) tipi Glutamat reseptör alt birimleri7. Bu değişiklikler synapse numarası, yapısı ve Hipokampus7,8,9gücü uzun vadeli modifikasyonu arabuluculuk katılmaktadırlar.

ECS modellerinde, elektriksel stimülasyon jeneralize Tonik klonik nöbetler10,11uyandırmak için Stereotaxic implante elektrotlar, kornea elektrotlar veya kulak elektrotlar yoluyla kemirgenler teslim edilir. Elektrot stereotaksik implantasyon beyin ameliyatı içerir ve deneyci'nın yaralanma en aza indirmek için cerrahi becerilerini geliştirmek için önemli ölçüde zaman gerektirir. Daha az invaziv kornea elektrotlar kornea aşınma ve kuruluk neden olabilir ve anestezi gerektirir. Çünkü onlar kemirgen cerrahi ve anestezi olmadan kullanılabilir ve en az yaralanmalara neden kulak-küçük elektrotlar kullanımı bu sınırlamalar atlar. Gerçekten de, geçerli uyanık teslim fareler ile kulak-küçük elektrotlar güvenilir sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler neden olmaktadır ve onların hippocampi10sinaptik proteinler değiştirir bulduk.

Kemirgenler belirli beyin bölgelerinde sinaptik proteinlerin ECS kaynaklı bereket incelemek için kendi algılama ve miktar için en uygun deneysel yöntemleri seçmek önemlidir. Beyin hücre altı ayırma çözünür sitozolik protein ham yalıtımı için sağlar; zar proteinleri; Organel sınırları proteinler; ve proteinler PSD12,13,14gibi özel hücre altı yapıları arasında bile. PSD bir yoğun ve iyi organize edilmiş hücre altı sinaptik proteinler ve postsinaptik membran12,13,15yakınındaki yüksek konsantrasyonlu nöronlar malıdır. Yalıtım PSD PSD bereket ve postsinaptik Glutamat reseptörlerinin, iskele proteinler ve sinyal iletim proteinler PSD12 fonksiyon dinamik değişiklikleri beri zenginleştirilmiş sinaptik proteinlerin çalışma için yararlıdır , 15 , 16 , 17 sinaptik plastisite ve çeşitli nörolojik bozukluklar17,18içinde gözlenen synaptopathy ile ilişkili mısınız. Önceki hücre altı ayırma yöntemi PSD arındırmak için kullanılır beyin ham membran kısmını dan deterjan çözünmez kesir yalıtım tarafından Sükroz degradeler14, aralıklarla fark dahil. 19. o kemirgen büyük miktarlarda beyin14,19istemek bu geleneksel yöntemle büyük sorun olduğunu. PSD kesir tedavi başına izole etmek için 10-20 kemirgenler hazırlanması geniş maliyet ve zaman yatırım gerektirir ve birçok tedavi ise pratik olarak mümkün değildir.

Bu zorluğu aşmak için biz doğrudan olmadan Sükroz degrade Santrifüjü20,21, PSD kesir yalıtır ve PSD yalıtım için uygun tek bir sıçan hippocampi revize daha basit bir yöntem adapte olması beyin. Bizim küçük ölçekli PSD ayırma yöntemi hakkında verimleri 30-50 µg 2 hippocampi, immunoprecipitation ve Western Blot de dahil olmak üzere çeşitli biyokimyasal testleri kullanmak için yeterli dan PSD proteinlerin. Western Blot PSD zenginleştirme (PSD-95) postsinaptik yoğunluğu protein 95 ve presynaptic işaret synaptophysin ve çözünür sitoplazmik protein α-tübülin dışlanması ifşa tarafından izole için bizim yöntem başarısını gösterir. Bizim ECS indüksiyon ve küçük ölçekli PSD ayırma yöntemleri diğer kemirgen beyin bölgelerine kolayca uyarlanabilir ve PSD proteinlerin ifade ECS etkilerini değerlendirmek için nispeten basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Protokol

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm deneysel prosedürler kurumsal hayvanlar bakım ve kullanım komite toplantısında Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. bir sıçan koloni Bakımı

  1. (Bkz. Tablo reçetesi) Sprague-Dawley Rat doğurmak ve 12-h koyu döngüsü ve gıda ve su ad libitum erişim ile standart koşullarda proje.
  2. Fare pups postnatal gününde (P) 28 vazgeçirmek ve 2-4 erkek veya kadın littermates gruplar halinde onları evi.
  3. Erkek rats kuyruk toksik olmayan kalıcı bir siyah kalem tanımlama için WITH mark.
  4. Haftada 3 kez erkek rats tartmak ve onların bodyweights kaydedin.

2. bir ECS makine hazırlanması

  1. 07:30 at hayvan Hazırlık odasında tezgah dezenfekte ve bankta bir ECS makine (pulse jeneratörü) yerleştirin.
  2. Bir kapak ile temiz, boş bir kafeste 200-250 g ağırlığında bir bireysel erkek fare yerleştirin. ECS indüksiyon ile tedavi olmak tüm erkek rats için bu işlemi yineleyin. İzin vermek için 30 dk alıştırmak rats.
  3. Fareler onların kafeslerde habituating iken, bir darbe jeneratör ECS indüksiyon için 100 bakliyat/s, bir darbe genişliği 0.5 MS, bir şok süresi 0,5 frekansı ayarla s ve 55 mevcut mA (şekil 1A).
  4. Darbe üreteci hazır olun "RESET" düğmesine basıyorum ve "Hazır" düğmenin ışığı yanar sağlanması. Kulak klipleri bir darbe jeneratör bağlı değil ve sonra bir kaç saniye için "Şok" düğmesine emin olun.
    Not: Bu noktada, nabız jeneratör ECS indüksiyon için hazırdır.
  5. Kulak klipleri darbe jeneratör takın.

3. akut ECS indüksiyon

Not: Bkz. Resim 1B, üst panel.

  1. Kulak klipler steril serum fizyolojik ile ıslak ve onlar doygun emin olun.
  2. Ne dedikleri kulakları ile steril serum fizyolojik serum batırılmış gazlı bez içinde sarma tarafından ıslak. Sonra onları ıslak gazlı bez çıkarın.
  3. Kulak, ana kıkırdak grubun ötesinde pozisyon başına bir küçük resim ekleyin.
  4. ECS makinede doğru bir döngü kurulur onaylamak; Eğer değilse, bir hata iletisi veya bir okuma "1"-ecek gözükmek üstünde belgili tanımlık makine.
  5. Kalın, metal olmayan bir eldiven giymek. Fareyi yavaşça eldivenli elinde tutarken, bir kaç saniye için "Şok" düğmesine ve yavaş yavaş nöbet gözlemlemek için fare üzerinde kavrama bırakın. Sham "nöbet" için (NS) kontrol fare aynı şekilde başa ama geçerli teslim etme.
  6. Clonus başlar gibi kulak klipleri çıkarın ve "ağız ve yüz hareketleri" içerir "başını sallayarak (Aşama 1), kafa" (Aşama 2), "forelimb clonus" gözden geçirilmiş bir Racine'in ölçek22 göre nöbet davranış kayıt (evre 3), "yetiştirme forelimb clonus ile" (4 kademe) ve "yetiştirme ve forelimb clonus ile düşen" (sahne 5). Nöbet yaklaşık 10 sürmelidir s; kayıt zamanlayıcı kullanarak nöbet süresi.
  7. Nöbet fesih, fare için ev onun kafes dönmek. Fareyi fare kurtarma nöbetler en emin olmak başka bir 5 min için izleyin. Onu kafeste tek başına yer tutmak ve kafes kurtarma odasına dönün.
  8. Sonraki fare üzerinde ECS indüksiyon yineleyin.
  9. Fareler kalan gün ve sabahları en az bir kez ve bir kez onlar are euthanized için deneyler kadar ertesi gün öğleden sonra boyunca izlemek.
    Not: ECS indüksiyon yöntemi bir olası yan dikkat gerektiren etki olarak, klinik belirtiler için neden olabilir. Örneğin, ECS indüksiyon Protokolü 15 s ve neden gereksiz sıkıntı fareler için daha uzun ömürlü nöbetlere neden. Bu durumda, diazepam (10 mg/kg, IP) veya Fentobarbital (25-30 mg/kg, IP) kullanarak alma işlemini sonlandırın. Fareler solunum güçlüğü veya şiddetli davranış anormallikleri nöbet bırakma takip geliştirirseniz, onları işten çıkarma tarafından takip karbon dioksit Solunduğunda ötenazi.

4. kronik ECS indüksiyon

Not: Resim 1B, alt paneli bakın.

  1. Günlük sabah yedi gün üst üste adımlarda 1-3, yukarıda açıklandığı gibi aynı zamanda bir ECS neden.
  2. Fareler iki kez bir gün sonra evlerine iade kafesleri monitör.

5. homojenizasyon ve sıçan Hippocampi ayırma

Not: Şekil 2bakın.

  1. 320 mM Sükroz, 5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, içeren bir taze homojenizasyon arabelleği (a çözüm) hazırlamak 200 nM okadaic asit ve proteaz inhibitörleri. Filtreleri bir 0,22 µm gözenek boyutu ile vakum filtrasyonu için kullanarak arabellek filtre sterilize et ve buz üzerinde yerleştirin.
  2. Belirli bir zamanda ECS akut veya kronik ECS (şekil 1) aşağıdaki noktası, 5-10 dk, bir Giyotin kullanarak işten çıkarma tarafından takip için CO2 Solunduğunda sıçan ötenazi.
  3. Beyin kaldırmak ve hippocampi buzda,23,24daha önce açıklandığı gibi yerleştirilen metal plaka üzerinde incelemek.
  4. 30 mm doku kültürü üzerine bir sıçan gelen yer iki hippocampi çanağı ve onları küçük parçalara makas kullanarak kıyma.
  5. Kıyılmış hippocampi 1 mL pipet kullanarak bir Manuel cam homogenizer aktarmak ve buz gibi homojenizasyon arabellek (çözüm A, adım 5.1) 1 mL ekleyin. Yuvarlak bir havaneli ile cam homogenizer yerleştirin. Cam homogenizer buz üzerinde olmakla birlikte, kadar küçük parçalar halinde Hipokampal doku ortadan yavaşça ve sürekli yukarı ve aşağı 1 dk. için 10 - 15 kez havaneli üzerinde inme.
  6. 1-mL pipet kullanarak 1.7 mL microcentrifuge tüp homogenate aktarmak ve çözünmez doku ve hücre çekirdeği (P1 kesir) içeren Pelet homogenate vasıl 800 x g 4 ° C'de postnuclear süpernatant (S1 kesir) ayırmak için 10 dk santrifüj kapasitesi. 1 mL pipet kullanarak iki ayrı, yeni 1.7 mL microcentrifuge tüpler 50 µL ve S1 fraksiyonunun 950 µL aktarın ve bu tüpler buza depolayın. P1 kesir Pelet buza kaydedin.
  7. S1 kesir (950 µL) 13,800 x g ve çözünür sitozolik protein ile zenginleştirilmiş süpernatant (S2 kesir), ayırmak için 4 ° C de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet (P2 kesir), synaptosomal proteinler de dahil olmak üzere membran bağlı proteinler ile zenginleştirilmiş. 1-mL pipet kullanarak yeni bir 1,7 mL microcentrifuge S2 kesir aktarın ve buza depolayın.
  8. Pelet (P2 kesir) 1-mL pipet kullanarak buz gibi arıtılmış su 498 µL içinde resuspend. 1 M HEPES (pH 7,4) 2 µL eklemek 4 mM HEPES (pH 7,4) son bir konsantrasyon ulaşmak için 20 µL pipet kullanarak. 30 dk. deposu için ajitasyon ile 4 ° C'de resuspended P2 kesir buz üzerinde kuluçkaya.
  9. BCA tahlil kullanarak S1, S2 ve P2 kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin veya PSD yalıtmak için P2 kesir işlemek.

6. yalıtım PSD gelen ham membran proteini (P2) kesir

  1. 25.000 x g ve 4 ° C 20 dk P2 kesir (500 µL) santrifüj kapasitesi lysed süpernatant (LS2 kesir) ve lysed Pelet (LP1 kesir) ayırmak için. LS2 kesir 1 mL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için aktarın ve buza depolayın.
  2. LP1 Pelet 250 µL % 1 deterjan 1 x 1 mL pipet kullanarak PBS arabellek ile karışık 250 µL 50 mm HEPES (pH 7,4) resuspend. 15 dakika nazik ajitasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya.
  3. Resuspended LP1 Pelet 25.000 x g ve süpernatant (PSD kesir) Pelet (PSD kesir) ayırmak için 4 ° C'de 3 h için santrifüj kapasitesi. 1.7-mL microcentrifuge Tube süpernatant kaldırmak ve PSD Pelet 50 mM HEPES (pH 7,4) 100 µL içinde resuspend 200 µL pipet kullanarak.
  4. LS2, Sigara-PSD ve BCA tahlil kullanarak PSD kesirler protein konsantrasyonu belirlemek. 50 mM HEPES (pH 7,4) 1 mg/mL konsantrasyonu elde etmek ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak için her kesir ekleyin.
    Not: tüm çözümler adım 5-6 (Yani, çözüm A, HEPES tampon ve PBS arabellek) kullanılan arıtılmış su iyonik ve organik kirleticiler ve parçacıklar ücretsiz ile yapılmalıdır.

7. Batı kurutma

  1. Her protein fraksiyonu buz çözme. Her kesir (S2, P2 ve PSD 1 mg/ml) 12 µL 20 µL pipet kullanarak bir yeni 1.7 mL microcentrifuge tüp için transfer.
  2. 5 x SDS örnek arabelleği 3 µL ekleyin ve 75 ° c 30 dk içinde bir su banyosu için kuluçkaya. Örnek oda sıcaklığında (RT) aşağı ne yapıyorsun?
  3. Protein örneği 10 µL % 4-20 degrade 15-iyi tarak SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) jel 20 µL pipet kullanarak her kuyunun içine yükleyin. SDS-sayfa aparatı ve arabellek çalışan 80-100 V jel çalıştırmak (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 0.1 SDS; pH 8.3).
    Not: Her jel protein örnekleri NS fareler ve ECS rats akut veya kronik ECS takip farklı zaman noktalarda içermelidir.
  4. Proteinler SDS sayfasından jel transfer polivinil difluoride (PVDF) membran içinde 25-30 V, aktarım cihazları (60 mA) için 9-12 h aktarma arabelleği (25 mM Tris, 190 mM glisin ve % 20 metanol; pH 8.3).
  5. PVDF membran aktarım cihazları kaldır ve RT. çok amaçlı rotator üzerinde 5 min için Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) yıkayın
  6. Membran % 5 süt engellemek ve % 0.1 ara-20 TBS 1 h. için kuluçkaya bu birincil antikor (Tablo 1) çamaşır arabellek içinde (% 1 süt ve % 0.1 ara-20 TBS) gecede 4 ° C çok amaçlı rotator üzerinde (dilutions için Malzemeler tablo bakınız).
  7. Membran 10 min için 4 kez yıkama arabellekte yıkayın ve ardından horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Birleşik arabellek için 1S RT. çok amaçlı rotator yıkama içinde ikincil antikorlar
  8. Membran 10 min için 4 kez yıkama yıkama arabellek ve sonra TBS ile 5 min için.
  9. Membran ile 1 min için geliştirilmiş chemifluorescence substrat kuluçkaya ve röntgen filmi ile maruz kalmaktadır. Film işlemciye sahip maruz filmi banyo.

8. Batı lekesi miktar

  1. İnceden inceye gözden geçirmek Western blot TIFF dosyası olarak ve bu dosyayı bilgisayarınıza kaydedin.
  2. "Dosya," "Açık resim," sağ ok "gri ölçekli." altında gri tonlamalı bir görüntüyü olarak ImageJ programda Western blot dosya açmak
  3. ImageJ araç çubuğundan dikdörtgen seçim aracı seçin ve bir tek Western blot grup ilgi bir proteinin kapsar bir dikdörtgen çizin.
  4. "Analiz" altında "alan ve seçilen bir grubun ortalama yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi" vurmak.
  5. Dikdörtgenin boyutunu ve şeklini değiştirmeden bir arka plan alanına taşıyın. 8.4 alan ve bir arka plan ortalama yoğunluğu arasındaki adımları yineleyin.
  6. Ortalama yoğunluk değeri, bir arka plan grubu bu bir Western blot orkestra'arka plan düşülen grup yoğunluk ilgi protein veren çıkarma.
  7. İlgi için tüm Western blot bantlarında 8.2 8.6 adımları yineleyin.
  8. Protein ilgi grubu arka plan düşülen yoğunluğu α-tübülin gibi bir temizlik gen ürünü arka plan düşülen grup yoğunluğu tarafından bölmek; Bu adım faiz protein normalleştirilmiş değerini verir.

Sonuçlar

Ayrıntılı yordam kullanılarak sunulan burada, bir elektrik çarpması (55 anne, 0,5 için 100 bakliyat/s s) kulak-küçük elektrotlar indüklenen yinelenmeyen sahne ile 4-5 Tonik-klonik nöbetler içinde rats (şekil 1A-B) teslim. Toplam 8 sıçan akut ECS indüksiyon alınan ve sahne 4-5 Tonik-klonik nöbetler görüntülenir. Nöbetler hakkında 10 sürdü s ve 1-2 dk içinde nöbet bırakma kurtarılan tüm rats. Sahte "yok nöbet" fa...

Tartışmalar

Burada, biz onların hippocampi nöronal aktivite küresel uyarılması ortaya çıkarır bir ECS indüksiyon yöntemi Sıçanlarda açıklayın. ECS Elektrokonvulsif terapi, klinik olarak insanlar1,2,3' te uyuşturucu ateşe dayanıklı depresif bozuklukların tedavisinde kullanılır hayvan bir modeldir. Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon tedavisi için kullanılmasına rağmen kesin altta yatan mekanizma belirsizdir....

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Eric C. Bolton onun santrifüj ayırma ve Dr. Graham H. Diering için bize PSD ayırma için küçük ölçekli kuralıyla sağlamak için John Hopkins Üniversitesi'nde Dr. Richard L. Huganir'ın laboratuarında kullanmak izin verdiğiniz için teşekkür ederim.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Referanslar

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 126Elektrokonvulsif n betHipokampush cre alt ay rmapostsinaptik yo unlu uNMDA resept rWestern Blot

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır