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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.

Resumo

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de eletroconvulsoterapia, o tratamento mais eficaz para a depressão severa. ECS induz convulsões tônico-clônica generalizadas com baixa mortalidade e morte neuronal e é um modelo utilizado para droga anti-epiléptica de tela. Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em que uma corrente de 55-mA breve é entregue para 0,5 s para macho ratos 200-250 g de peso através de eletrodos de orelha-clip. Tal estimulação bilateral produzida estágio 4-5 convulsões Clônicas que durou cerca de 10 s. Após a cessação da ECS aguda ou crônica, a maioria dos ratos recuperados para ser comportamentalmente indistinguível de sham a ratos "nenhuma apreensão". Porque ECS globalmente eleva a atividade cerebral, ele também serviu para examinar alterações de atividade-dependente de proteínas sinápticas e seus efeitos na força sináptica, usando vários métodos. Em particular, fraccionamento subcelular da densidade pós-sináptica (PSD) em combinação com mancha ocidental permite a determinação quantitativa da abundância de proteínas sinápticas nesta estrutura sináptica especializada. Em contraste com um método de fracionamento anterior que exige grande quantidade de cérebros de roedores, descrevemos aqui um método de fracionamento de pequena escala para isolar o PSD do hipocampo de rato único, sem centrifugação gradiente de sacarose. Usando esse método, mostramos que a fração isolada do PSD contém proteínas de membrana pós-sináptica, incluindo PSD95, GluN2B e GluA2. Sinaptofisina marcador pré-sináptica e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina foram excluídas a fração PSD, demonstrando bem sucedido isolamento do PSD. Além disso, a ECS crônica diminuiu GluN2B expressão no PSD, indicando que o nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala pode ser aplicado para detectar as alterações no hipocampo proteínas PSD de um único rato após tratamentos genéticos, farmacológicos ou mecânicos .

Introdução

Eletroconvulsoterapia tem sido usada para tratar pacientes com distúrbios depressivos major, incluindo depressão severa resistente a medicamentos, depressão bipolar, a doença de Parkinson doenças e esquizofrenia1,2. Esta terapia, convulsão é gerado pelo estímulo eléctrico entregado na cabeça de pacientes anestesiados através de sub-fascial eletrodos1,2,3. Administração repetitiva de ECS tem sido clinicamente benéfica para transtornos depressivos resistentes1,2,3. No entanto, o mecanismo exato subjacentes a eficácia a longo prazo do efeito antidepressivo em humanos permaneceu indescritível. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia e é amplamente usado para investigar seu mecanismo terapêutico. Em roedores, ambos ECS aguda e crônico tratamento ECS promovem neurogénese adulta no hipocampo em reorganizar a rede neural4,5, susceptível de contribuir para melhorias na flexibilidade cognitiva. Além disso, elevação global da atividade cerebral por ECS altera a abundância de transcrições, tais como um cérebro derivada neurotrópica fator6e várias proteínas, incluindo metabotrópico glutamato receptor 17 e o N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estas mudanças estão envolvidas na mediação a longo prazo modificação do número de sinapse, estrutura e força do hipocampo7,8,9.

Modelos ECS, estimulação elétrica é entregue para roedores via stereotaxically implantados eletrodos, eletrodos corneais ou eletrodos de orelha para evocar as convulsões tônico-clônica generalizada10,11. Estereotáxica implante de eletrodos envolve cirurgia cerebral e exige um tempo significativo para melhorar habilidades cirúrgicas do experimentador para minimizar a lesão. Menos invasivos eletrodos corneais podem causar secura e abrasão corneal e requer anestesia. O uso de eletrodos de orelha-clip ignora essas limitações porque eles podem ser usados em roedores sem cirurgia ou anestesia e causam lesão mínima. De fato, descobrimos que atual entregues ao acordado ratos através de orelha-clip eletrodos confiantemente induz convulsões tônico-clônicas fase 4-5 e altera as proteínas sinápticas em seu hipocampo10.

Para examinar a abundância de ECS-induzida de proteínas sinápticas em regiões específicas do cérebro dos roedores, é importante escolher os métodos experimentais que são mais adequados para a sua detecção e quantificação. Fraccionamento subcelular do cérebro permite o isolamento bruto de proteínas citosólico solúveis; proteínas de membrana; proteínas de organela-limites; e até mesmo proteínas em estruturas subcelulares especiais, tais como o PSD12,13,14. O PSD é um domínio subcellular denso e bem organizado em neurônios no qual proteínas sinápticas são altamente concentradas em e perto da membrana pós-sináptica12,13,15. O isolamento do PSD é útil para o estudo de proteínas sinápticas enriquecido no PSD, desde mudanças dinâmicas na abundância e função de receptores pós-sinápticos glutamato, andaimes proteínas e proteínas de transdução de sinal no PSD12 , 15 , 16 , 17 são correlacionadas com plasticidade sináptica e o synaptopathy observado em várias doenças neurológicas17,18. Um método de fracionamento subcelular anterior usado para purificar o PSD envolveu o isolamento da fração insolúvel em detergente da fracção bruto da membrana do cérebro pela centrifugação diferencial de gradientes de sacarose14, 19. o grande desafio com esse método tradicional é que ele requer grandes quantidades de roedores cérebros14,19. Preparação de 10-20 roedores para isolar a fração do PSD por tratamento exige extensivo custo e investimento de tempo e não é praticamente viável se existem muitos tratamentos.

Para superar este desafio, nós adaptamos um método mais simples que diretamente isola a fração do PSD, sem sacarose centrifugação gradiente20,21e revisto para ser aplicável ao isolamento do PSD do hipocampo de rato único cérebro. Nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala produz sobre 30-50 µ g de proteínas PSD de 2 hipocampo, suficiente para o uso em vários ensaios bioquímicos, incluindo imunoprecipitação e mancha ocidental. Mancha ocidental demonstra o sucesso do nosso método para isolar o PSD, revelando o enriquecimento da proteína densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e a exclusão de marcador pré-sináptica Sinaptofisina e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina. Nossa indução ECS e métodos de fracionamento de PSD em pequena escala são facilmente adaptáveis para outras regiões do cérebro de roedor e fornecem uma maneira relativamente simples e confiável para avaliar os efeitos da ECS na expressão de proteínas do PSD.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign e cuidado de animais institucionais.

1. manter uma colônia de rato

  1. Raça de ratos Sprague-Dawley (consulte a Tabela de materiais) e mantê-las em condições normais, com um ciclo de 12 h claro-escuro e ad libitum acesso à comida e água.
  2. Desmamar os filhotes de rato no dia pós-natal (P) 28 e colocá-los em grupos de 2-4 machos ou fêmeas littermates.
  3. Marca as caudas dos ratos machos com um marcador preto permanente de tóxicos para identificação.
  4. Pesar os ratos machos 3 vezes por semana e registar a sua bodyweights.

2. preparação de uma máquina de ECS

  1. Às 07:30, desinfectar o banco na sala de preparação de animais e colocar uma máquina ECS (gerador de pulso) no banco.
  2. Coloque um rato masculino individual pesando 200-250 g numa gaiola limpa e vazia com tampa. Repita isto para todos os ratos machos devem ser tratados com indução de ECS. Deixe os ratos se habituar por 30 min.
  3. Enquanto os ratos são habituating em suas gaiolas, defina um gerador de pulso para indução de ECS para a frequência de 100 pulsos/s, uma largura de pulso de 0,5 ms, a duração do choque de 0,5 s e uma corrente de 55 mA (Figura 1A).
  4. Prepare o gerador de pulso, apertando o botão de "RESET" e garantindo que o botão "Pronto" estiver acesa. Certifique-se de que os clipes de ouvido não estão conectados a um gerador de pulso e em seguida, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos.
    Nota: neste ponto, o gerador de pulso está pronto para a indução de ECS.
  5. Conecte os clipes de orelha o gerador de pulso.

3. indução de ECS aguda

Nota: Ver Figura 1B, painel superior.

  1. Molhar os clipes de orelha com solução salina estéril e certifique-se de que eles estão saturados.
  2. Molhe as orelhas de um rato com solução salina estéril por envolvê-los em gaze embebida em soro fisiológico. Uma vez que eles estão molhados, remova a gaze.
  3. Anexe um clip por orelha, posição além da banda principal de cartilagem.
  4. Confirmar na máquina ECS que seja estabelecido um laço verdadeiro; Se não, uma leitura de "1" ou uma mensagem de erro aparecerá na máquina.
  5. Use uma luva grossa, não-metálicos. Enquanto segura o rato delicadamente em uma mão enluvada, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos e solte lentamente o punho no rato para observar a apreensão. Para a farsa "nenhuma apreensão" (NS) controlam, manipular o rato de forma idêntica, mas não entregam a corrente.
  6. Desconecte os clipes de orelha como clonus começa e registrar o comportamento de ataque de acordo com uma revista Racine escala22 que inclui "os movimentos faciais e boca" (fase 1), "cabeça a acenar" (fase 2), "clonus membro anterior" (fase 3), "criação com clonus membro anterior" (etapa 4) e "criação e caindo com clonus membro anterior" (etapa 5). A apreensão deve durar cerca de 10 s; registar a duração de ataque usando um timer.
  7. Após a cessação de apreensão, retorne o rato para sua gaiola em casa. Monitore o rato para outro 5 min certificar-se da recuperação do rato de apreensões. Mantê-lo isoladamente alojado na gaiola e retornar a gaiola para a sala de recuperação.
  8. Repita a indução de ECS no próximo rato.
  9. Monitore os ratos no restante do dia e pelo menos uma vez de manhã e uma vez na parte da tarde no dia seguinte, até que eles são sacrificados para experimentos.
    Nota: O método de indução de ECS pode levar a sinais clínicos como um efeito colateral incidental, o que requer atenção. Por exemplo, o protocolo de indução de ECS pode induzir convulsões que duram mais de 15 s e causa sofrimento desnecessário para os ratos. Neste caso, encerrar o ataque usando o diazepam (10 mg/kg, i.p.) ou pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se os ratos desenvolvem insuficiência respiratória ou graves anomalias comportamentais após a cessação de apreensão, sacrificá-los por inalação de dióxido de carbono, seguida por decapitação.

4. indução de ECS crônica

Nota: Consulte a Figura 1B, painel inferior.

  1. Induzi uma ECS por dia ao mesmo tempo pela manhã, conforme descrito nas etapas 1-3, acima, durante sete dias consecutivos.
  2. Monitor os ratos gaiolas duas vezes um dia depois que eles são retornados para a sua casa.

5. homogeneização e fracionamento do hipocampo de rato

Nota: Consulte a Figura 2.

  1. Preparar uma reserva de homogeneização fresco (solução A) que contém sacarose 320mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 1 mM EDTA, pH de 10 mM HEPES 7.4, 200 o ácido ocadaico nM e inibidores da protease. Filtro-esterilizar o buffer usando filtros com um tamanho de poro 0,22 µm para filtragem do vácuo e colocá-lo no gelo.
  2. Em um determinado momento ponto seguinte ECS aguda ou crônica ECS (Figura 1), eutanásia o rato por inalação de CO2 por 5-10 min, seguido por decapitação usando uma guilhotina.
  3. Remover o cérebro e dissecar o hipocampo na placa de metal colocados no gelo, conforme descrito anteriormente,23,24.
  4. Coloque dois hipocampo de um rato em uma cultura de tecido de 30 mm do prato e pique-os em pequenos pedaços com uma tesoura.
  5. Transferir o hipocampo picado para um homogeneizador de vidro manual usando uma pipeta de 1 mL e adicionar 1 mL de tampão de homogeneização gelada (solução A, passo 5.1). Inserir um pilão redondo em um homogeneizador de vidro. Enquanto o homogenizador de vidro está no gelo, delicadamente e com firmeza curso acima e para baixo sobre o pilão 10 - 15 vezes por 1 min, até pequenos pedaços de tecido hippocampal desapareceram.
  6. Transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrifuga de 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e centrifugar o homogenate a 800 x g durante 10 minutos a 4 ° C para separar o sobrenadante pós-nucleares (fração de S1) da pelota contendo tecido insolúvel e núcleos (fração de P1). Transferir 50 µ l e 950 µ l da fração S1 para dois tubos de microcentrifuga separado, nova 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazenar esses tubos no gelo. Salve a pelota de fração de P1 no gelo.
  7. Centrifugue a fração de S1 (950 µ l) durante 10 minutos a 13.800 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração S2), enriquecido com proteínas solúveis no citosol, e a pelota (fração P2), enriquecido com proteínas de membrana-limite, incluindo proteínas synaptosomal. Transferir a fração S2 para novo microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.
  8. Resuspenda o pellet (fração P2) em 498 µ l de água filtrada gelada, utilizando uma pipeta de 1 mL. Adicionar 2 µ l de 1 M HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 µ l a obter uma concentração final de 4 mM HEPES (pH 7,4). Incube a 4 ° C, com agitação por 30 min. loja a ressuspensa fração P2 no gelo.
  9. Determine a concentração de proteína das frações S1, S2 e P2 usando um ensaio BCA. Adicionar 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso, ou processar a fração P2 para isolar o PSD.

6. isolamento do PSD da fracção membrana bruto proteína (P2)

  1. Centrifugue a fração P2 (500 µ l) por 20 min em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante lisado (LS2 fração) e o pellet lisado (LP1 fração). A fração LS2 de transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.
  2. Resuspenda o pellet LP1 em 250 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) misturado com 250 µ l de detergente de 1% em tampão PBS, usando uma pipeta de 1 mL de 1x. Incube a 4 ° C, com agitação suave por 15 min.
  3. Centrifugue o ressuspenso LP1 para 3h em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração não-PSD) a pelota (fração do PSD). Remover o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL e ressuspender o PSD em 100 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 200 µ l.
  4. Determine a concentração de proteína da LS2, não-PSD e frações PSD usando um ensaio BCA. Adicione 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso.
    Nota: Todas as soluções utilizadas nas etapas 5-6 (ou seja, A solução tampão HEPES e tampão PBS) devem ser feitas com água purificada e livre de partículas e contaminantes orgânicos e iônicos.

7. mancha ocidental

  1. Descongele a cada fração de proteína no gelo. Transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 20 µ l de 12 µ l de cada fração (S2, P2 e PSD em 1 mg/mL).
  2. Adicione 3 µ l de buffer de amostra 5 x SDS e incubar a 75 ° C por 30 min em um banho de água. Refrigerar a amostra até à temperatura (RT).
  3. Carrega 10 µ l da amostra da proteína em cada poço de 4-20% gradiente 15-bem pente SDS-gel de eletroforese (SDS-PAGE) do gel de polyacrylamide usando uma pipeta de 20 µ l. Funcione o gel no aparato de SDS-PAGE e em 80-100 V em reserva de marcha (25 mM Tris glicina de 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3).
    Nota: Cada gel deve conter amostras da proteína de NS ratos e ratos ECS em pontos diferentes do tempo seguindo ECS aguda ou crônica.
  4. Transferência das proteínas da SDS-página do gel para uma membrana de policloreto difluoreto (PVDF) no aparelho de transferência em 25-30 V (60 mA) para 9-12 h no buffer de transferência (25 mM Tris glicina 190mm e 20% de metanol; pH 8.3).
  5. Retire o aparelho de transferência da membrana PVDF e lavá-lo em salino Tris (TBS) por 5 min em um rotador de múltiplos propósito a RT
  6. Bloquear a membrana em leite de 5% e 0,1% Tween-20 em TBS para h. 1-incubar em anticorpos primários (tabela 1) em tampão de lavagem (leite de 1% e 0.1% Tween-20 em TBS) durante a noite em um rotador de múltiplos propósito a 4 ° C (ver a Tabela de materiais para as diluições).
  7. Lavar a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e incube-a então com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados com anticorpos secundários no buffer para 1h de lavagem em rotacao multi-uso em RT
  8. Lave a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e depois com TBS por 5 min.
  9. Incubar a membrana com substrato chemifluorescence reforçada por 1 min e expô-la a película de raio x. Desenvolva o filme exposto com um processador de filme.

8. quantificação dos borrões ocidentais

  1. Varredura do Western blot como um arquivo TIFF e salve este arquivo no computador.
  2. Abra o arquivo de borrão ocidental no programa ImageJ como uma imagem em tons de cinza, em "Arquivo", "Abrir imagem", seta para a direita "escala de cinza".
  3. Escolha a ferramenta de seleção retangular na barra de ferramentas do ImageJ e desenhe um retângulo que abrange uma banda simples borrão ocidental de uma proteína de interesse.
  4. Sob "Analisar," bateu "Medida" para obter a área e a densidade média de uma banda selecionada.
  5. Mova o retângulo de uma área de fundo sem alterar seu tamanho e forma. Repita a etapa 8.4 para a área e a densidade média de um plano de fundo.
  6. Subtrai o valor da densidade média de uma banda de fundo daquele de uma banda de Western blot, dando a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse.
  7. Repita as etapas de 8,2-8,6 para todas as bandas de borrão ocidental de interesse.
  8. Dividir a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse pela densidade banda fundo-subtraído de um produto de gene das tarefas domésticas, tais como a α-tubulina; Esta etapa produz o valor normalizado da proteína de interesse.

Resultados

Usar o procedimento detalhado apresentado aqui, um choque elétrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) entregues via orelha-clip eletrodos induzidos não recorrente estágio 4-5 convulsões tônico-clônicas em ratos (Figura 1A-B). Um total de 8 de ratos recebeu aguda indução ECS e exibido convulsões tônico-clônicas fase 4-5. As convulsões duraram cerca de 10 s e todos os ratos recuperados dentro de 1-2 min de cessação de apreensão. Sh...

Discussão

Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em ratos que provoca a estimulação global da atividade neuronal em seu hipocampo. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia, que clinicamente é usada para tratar transtornos depressivos refratários de drogas em seres humanos1,2,3. Apesar do uso da terapia electroconvulsive para tratar a depressão grave, o mecanismo preciso subjacente permanece obscuro. Porque ECS induz...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Os autores agradecer Dr. Eric C. Bolton por nos permitir usar sua centrífuga para fracionamento e Dr. Graham H. Diering no laboratório do Dr. Richard L. Huganir Universidade de John Hopkins, nos fornecer o protocolo de pequena escala para o fraccionamento do PSD.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Referências

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