JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.

Resumen

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsiva, el tratamiento más efectivo para la depresión severa. ECS induce convulsiones tonico-clónicas generalizadas con baja mortalidad y muerte neuronal y es un modelo ampliamente utilizado para drogas antiepilépticas de pantalla. Aquí, describimos un método de inducción de ECS en que se entrega una breve corriente de 55 mA para 0.5 s para hombre ratas 200-250 g de peso por medio de electrodos clip de oreja. Tal estimulación bilateral producida etapa 4-5 convulsiones clónicas que duró cerca de 10 s. Tras el cese de ECS aguda o crónica, las ratas más recuperadas para ser indistinguible su comportamiento simulado ratas "no crisis". Porque ECS a nivel mundial eleva la actividad cerebral, también se ha utilizado para examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas y sus efectos en la fuerza sináptica mediante varios métodos. En particular, fraccionamiento subcelular de la densidad postsináptica (PSD) en combinación con Western Blot permite la determinación cuantitativa de la abundancia de proteínas sinápticas a esta estructura sináptica especializada. En contraste con un método de fraccionamiento anterior que requiere gran cantidad de cerebros de roedores, se describe aquí un método de fraccionamiento en pequeña escala para aislar el PSD desde el hipocampo de una rata sola, sin centrifugación gradiente de sacarosa. Usando este método, nos muestran que la fracción aislada del PSD contiene proteínas de la membrana postsináptica, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2. Sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina fueron excluidos de la fracción PSD, demostrando el aislamiento exitoso de PSD. Además, ECS crónica disminuyó la expresión de GluN2B en PSD, lo que indica que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala puede aplicarse para detectar los cambios en las proteínas PSD hipocampales de una rata sola después de tratamientos genéticos, farmacológicos o mecánicos .

Introducción

La terapia electroconvulsiva se ha utilizado para tratar a pacientes con trastornos depresivos mayores, incluyendo depresión severa resistente a los medicamentos, depresión bipolar, enfermedades de Parkinson y esquizofrenia1,2. En esta terapia, crisis es generada por estímulos eléctricos a la cabeza de los pacientes anestesiados vía epicranial electrodos1,2,3. Administración repetitiva de ECS ha sido clínicamente beneficiosa para los trastornos depresivos resistentes a los medicamentos1,2,3. Sin embargo, el mecanismo exacto subyacente la eficacia a largo plazo del efecto antidepresivo en los seres humanos ha permanecido elusivo. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva y es ampliamente utilizada para investigar su mecanismo terapéutico. En roedores, ECS aguda y crónica tratamiento de ECS promoción la neurogénesis adulta en el hipocampo y reorganizan la red neuronal4,5, que es probable que contribuyen a las mejoras en la flexibilidad cognitiva. Además, la elevación global de la actividad cerebral por ECS altera la abundancia de las transcripciones, como un cerebro derivada factor neurotrópico6y varias proteínas, incluyendo metabotrópicos glutamato receptor 17 y la N-metil-D-Aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estos cambios están involucrados en mediar modificación a largo plazo del número de sinapsis, estructura y fuerza en el hipocampo7,8,9.

En modelos ECS, estimulación eléctrica se entrega a los roedores mediante electrodos implantados stereotaxically, electrodos corneales o electrodos de oído evocar convulsiones tonico-clónicas generalizadas10,11. Implantación estereotáctica de electrodos consiste en una cirugía de cerebro y requiere un tiempo considerable para mejorar las habilidades quirúrgicas del experimentador para minimizar el daño. Menos invasivos electrodos corneales pueden causar sequedad y abrasión corneal y requieren anestesia. El uso de electrodos clip de oreja omite estas limitaciones ya que pueden ser utilizados en roedores sin cirugía ni anestesia y causar lesión mínima. De hecho, encontramos que actual ratas entregado a despierto a través de clip de oreja electrodos confiablemente induce convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5 y altera las proteínas sinápticas en sus hipocampos10.

Para examinar la abundancia ECS-inducida de proteínas sinápticas en las regiones específicas del cerebro de los roedores, es importante elegir los métodos experimentales que son los más adecuados para su detección y cuantificación. Fraccionamiento subcelular del cerebro permite el aislamiento crudo de proteínas solubles del citosol; proteínas de membrana; proteínas orgánulo-límites; e incluso las proteínas en especiales estructuras subcelulares, tales como el PSD12,13,14. El PSD es un dominio subcelular densa y bien organizado en las neuronas en que las proteínas sinápticas están concentradas en y cerca de la membrana postsináptica12,13,15. El aislamiento de la PSD es útil para el estudio de las proteínas sinápticas enriquecido en el PSD, desde cambios dinámicos en la abundancia y la función de receptores de glutamato postsinápticos, proteínas de andamiaje y proteínas de transducción de señal en el PSD12 , 15 , 16 , 17 se correlacionan con la plasticidad sináptica y la synaptopathy observada en varios trastornos neurológicos17,18. Un método de fraccionamiento subcelular anterior utilizado para purificar el PSD participando el aislamiento de la fracción insoluble en detergente de la fracción cruda de la membrana del cerebro de la centrifugación diferencial de gradientes de sacarosa14, 19. el gran reto con este método tradicional es que requiere grandes cantidades de roedores los cerebros de14,19. Preparación de roedores 10-20 para aislar la fracción de la PSD por tratamiento requiere amplia costo e inversión de tiempo y no es prácticamente posible si hay muchos tratamientos.

Para superar este reto, hemos adaptado un método más sencillo que directamente aísla la fracción PSD, sin centrifugación del gradiente de sacarosa de20,21y revisada para que sea aplicable al aislamiento de PSD desde el hipocampo de una rata sola cerebro. Nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala produce sobre 30-50 μg de las proteínas PSD de 2 hipocampos, suficientes para el uso en diversos estudios bioquímicos, incluyendo inmunoprecipitación y Western blotting. El borrar occidental demuestra el éxito de nuestro método para aislar el PSD al revelar el enriquecimiento de proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la exclusión de sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina. Nuestra inducción de ECS y métodos de fraccionamiento de PSD en pequeña escala son fácilmente adaptables a otras regiones del cerebro de roedores y proporcionan una manera relativamente simple y confiable para evaluar los efectos de ECS en la expresión de las proteínas PSD.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales incluyendo temas animal han sido aprobados por el cuidado de animales institucional y Comité de uso de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.

1. mantener una colonia de la rata

  1. Raza de ratas Sprague-Dawley (véase la Tabla de materiales) y mantenerlas en condiciones estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ad libitum al alimento y al agua.
  2. Destetar las crías de rata en el día postnatal (P) 28 y alojarlos en grupos de 2-4 hermanos de camada machos o hembras.
  3. Marque las colas de ratas macho con un marcador negro permanente no tóxico para la identificación.
  4. Peso de las ratas macho 3 veces por semana y registrar sus pesos corporales.

2. preparación de una máquina ECS

  1. En 7:30, desinfectar el Banco en la sala de preparación de animales y poner una máquina ECS (generador de pulso) en el Banco.
  2. Lugar una rata macho individual pesa 200-250 g en una jaula limpia, vacía con una tapa. Repita para todas las ratas macho tratados con inducción de ECS. Que las ratas habituarse durante 30 minutos.
  3. Mientras que las ratas son habituar en sus jaulas, establece un generador de pulsos para la inducción de ECS en la frecuencia de 100 pulsos/s, una anchura de pulso de 0,5 ms, una duración de choque de 0,5 s y una corriente de 55 mA (figura 1A).
  4. Preparar el generador de impulsos empujando el botón de "RESET" y asegurando que el botón "Listo" se ilumina. Asegúrese que los clips de la oreja no están conectados a un generador de pulsos y luego presionen el botón de "Choque" durante unos segundos.
    Nota: en este punto, el generador de pulso está listo para la inducción de la ECS.
  5. Conecte los clips de la oreja en el generador de impulsos.

3. inducción de ECS aguda

Nota: Vea figura 1B, panel superior.

  1. Moje los clips del oído con solución salina estéril y asegurar que están saturadas.
  2. Mojar orejas de rata con solución salina estéril envolviéndolas en una gasa empapada en solución salina. Una vez mojados, retirar la gasa.
  3. Coloque un clip por oído, posición más allá de la banda principal del cartílago.
  4. Confirmar en la máquina ECS que se establece un lazo verdadero; Si no, un mensaje de error o una lectura de "1" aparecerá en la máquina.
  5. Use un guante grueso, no metal. Sosteniendo la rata suavemente en una mano enguantada, presione el botón de "Choque" durante unos segundos y suelte lentamente el apretón en la rata para observar la incautación. Para la farsa de "no crisis" (NS) de control, manejar la rata idénticamente pero no entregan la corriente.
  6. Desconecte las abrazaderas del oído como clonus comienza y registrar el comportamiento de incautación según escala22 que incluye "movimientos de boca y facial" (etapa 1), "cabeceo" (etapa 2), "clonus del miembro anterior de un Racine revisado" (etapa 3), "crianza con clonus de miembro anterior" (etapa 4), "crianza y caer con clonus de miembro anterior" (etapa 5). La toma debe durar aproximadamente 10 s; registrar la duración de la crisis mediante un temporizador.
  7. Tras la terminación de la crisis, volver la rata a su jaula casera. Seguimiento de la rata para otros 5 minutos para asegurarse de la recuperación de la rata de las convulsiones. Mantenerlo ubicado solo en la jaula y volver a la jaula a la sala de recuperación.
  8. Repetir la inducción de ECS en la rata próxima.
  9. Controlar las ratas en el resto del día y al menos una vez en la mañana y una vez en la tarde del día siguiente hasta que son sacrificados para los experimentos.
    Nota: El método de inducción de ECS puede llevar a signos clínicos como un efecto secundario accidental, que requiere atención. Por ejemplo, el protocolo de inducción de ECS podría inducir convulsiones que duran más de 15 s y causa sufrimiento innecesario a las ratas. En este caso, terminar la convulsiones utilizar diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Si las ratas desarrollan dificultad respiratoria o anormalidades del comportamiento severas tras el cese de la convulsión, les eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida por decapitación.

4. inducción de ECS crónica

Nota: Ver figura 1B, panel inferior.

  1. Inducir una ECS por día a la misma hora en la mañana como se describe en los pasos 1-3, anteriormente, durante siete días consecutivos.
  2. Monitor de las ratas dos veces al día después de que regresaron a su casa de jaulas.

5. homogeneización y fraccionamiento de hipocampo de rata

Nota: Véase la figura 2.

  1. Preparar un buffer de homogeneización fresco (solución A) que contiene sacarosa 320 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 ácido okadaico de nM y los inhibidores de la proteasa. Filtro-esterilizar el búfer utilizando filtros con un tamaño de poro de 0,22 μm para la filtración de vacío y coloque en hielo.
  2. En un momento dado el punto después de ECS aguda o crónica ECS (figura 1), eutanasia la rata por la inhalación de CO2 por 5-10 min, seguida de decapitación con una guillotina.
  3. Quitar el cerebro y diseccionar los hipocampos en la placa metálica colocada en hielo, como se describió anteriormente23,24.
  4. Coloque dos hipocampo de una rata en un cultivo de tejido de 30-mm plato y picar en trozos pequeños con unas tijeras.
  5. Transferencia de los hipocampos picaditos a un homogeneizador de vidrio manual con una pipeta de 1 mL y añadir 1 mL de buffer de homogenización helada (solución A, paso 5.1). Inserte un mortero redondo en un homogeneizador de vidrio. Mientras el homogenizador de vidrio en el hielo, suavemente y constantemente al movimiento hacia arriba y hacia abajo en la mano del mortero 10 - 15 veces durante 1 minuto, hasta desaparecerán pequeñas porciones de tejido del hipocampo.
  6. Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y centrifugar el homogeneizado a 800 x g por 10 min a 4 ° C para separar el sobrenadante postnuclear (fracción S1) pellets que contiene tejido insoluble y núcleos (fracción de P1). Transferir 50 μl y 950 μl de la fracción S1 a dos tubos de microcentrífuga de separado, nuevo 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar estos tubos en hielo. Guardar el sedimento de la fracción de P1 en el hielo.
  7. Centrifugar la fracción S1 (950 μL) durante 10 minutos a 13.800 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción S2), enriquecido con proteínas citosólicas solubles, y el pellet (fracción de P2), enriquecido con proteínas de membrana, incluyendo proteínas synaptosomal. Transferir la fracción S2 a una microcentrífuga nuevo de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.
  8. Resuspender el precipitado (fracción de P2) en 498 μl de agua purificada fría utilizando una pipeta de 1 mL. Añadir 2 μl de 1 M HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 20 μl para alcanzar una concentración final de 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubar a 4 ° C con agitación por 30 minutos tienda la fracción P2 resuspendida en el hielo.
  9. Determinar la concentración de proteína de las fracciones S1, S2 y P2 utilizando un ensayo BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso, o proceso de la fracción de P2 para aislar el PSD.

6. aislamiento de la PSD de la fracción de membrana cruda proteína (P2)

  1. Centrifugar la fracción P2 (500 μl) por 20 min a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante sometidas a lisis (LS2 fracción) y el pellet sometidas a lisis (fracción de LP1). Transferencia de la fracción de LS2 a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.
  2. Resuspender el precipitado de LP1 en 250 μl 50 mm HEPES (pH 7.4) mezclado con 250 μl de detergente al 1% en el 1 x de tampón PBS con una pipeta de 1 mL. Incubar a 4 ° C con agitación suave durante 15 minutos.
  3. Centrifugue la LP1 resuspendido por 3 h a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción no-PSD) pellets (fracción de PSD). Quite el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL y resuspender el precipitado PSD en 100 μl de 50 mM HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 200 μl.
  4. Determinar la concentración de proteína de las LS2, no PSD, PSD fracciones y usando un análisis de la BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso.
    Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 5-6 (es decir, solución tampón HEPES y tampón PBS) deben hacerse con agua purificada libre de partículas y contaminantes iónicos y orgánicos.

7. Western Blotting

  1. Descongelar cada fracción de proteína en el hielo. Transferencia 12 μl de cada fracción (S2 P2 y PSD en 1 mg/mL) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 20 μl.
  2. Agregar 3 μl de tampón de muestra de SDS de x 5 e incubar a 75 ° C por 30 min en un baño de agua. Enfriar la muestra a temperatura ambiente (RT).
  3. Cargar 10 μl de la muestra de proteína en cada pozo de 4-20% peine de 15 pozos gradiente SDS-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) en gel utilizando una pipeta de 20 μl. Correr el gel en el aparato de SDS-PAGE y en el 80-100 V en el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris, glicina de 190 mM y 0.1% SDS; pH 8,3).
    Nota: Cada gel debe contener muestras de proteína de NS ratas y ratas ECS en diferentes puntos temporales después de ECS aguda o crónica.
  4. Transferencia de las proteínas de la SDS-PAGE gel a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) en los aparatos de transferencia en 25-30 V (60 mA) durante 9-12 h en tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina de 190 mM y metanol 20%; pH 8,3).
  5. Quitar la membrana PVDF de la unidad de transferencia y lavar en solución salina tamponada con Tris (TBS) por 5 min en un agitador multiuso a TA.
  6. Bloquear la membrana en la leche de 5% y 0,1% Tween-20 en TBS para 1 h. Incubar en anticuerpos primarios (tabla 1) en tampón de lavado (leche 1% y 0,1% Tween-20 en TBS) durante la noche en un rotador de multiuso a 4 ° C (véase la Tabla de materiales para las diluciones).
  7. Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego lo Incube con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos secundarios en lavado tampón durante 1 h en un rotador de multiuso a TA.
  8. Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego con TBS durante 5 minutos.
  9. Incubar la membrana con mayor chemifluorescence sustrato durante 1 min y exponerlo a la película de rayos x. Desarrollar la película expuesta con un procesador de la película.

8. cuantificación de Western Blots

  1. Análisis del Western blot como un archivo TIFF y guardar este archivo en el ordenador.
  2. Abra el archivo de Western blot en el programa ImageJ como una imagen en escala de grises, debajo de "Archivo", "Abrir imagen" flecha derecha "escala de grises".
  3. Elija la herramienta selección rectangular de la barra de herramientas de ImageJ y dibujar un rectángulo que cubre una banda de Western blot solo de una proteína de interés.
  4. Bajo "Analizar," golpeó "Medida" para obtener el área y la densidad media de un grupo seleccionado.
  5. Mover el rectángulo a un área de fondo sin cambiar su forma y tamaño. Repita el paso 8.4 a la zona y la densidad media de un fondo.
  6. Restar el valor de la densidad media de una banda de fondo de la de una banda de Western blot, lo que da la densidad de banda resta de fondo de la proteína de interés.
  7. Repita los pasos 8.2 8.6 para todas las bandas de Western blot de interés.
  8. Dividir la densidad de banda resta de fondo de la proteína del interés por la densidad de banda resta de fondo de un producto génico de limpieza, tales como α-tubulina; Este paso obtiene el valor normalizado de la proteína de interés.

Resultados

Utilizando el procedimiento detallado aquí, presenta una descarga eléctrica (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) suministra a través de clip de oreja electrodos inducida por etapa no recurrente asimientos tónico-clónicos 4-5 en la rata (figura 1A-B). Un total 8 de ratas recibió inducción aguda de ECS y aparecen convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5. Las crisis duraron cerca de 10 s y todas las ratas recuperadas dentro de 1-2 minutos de...

Discusión

Aquí, describimos un método de inducción de ECS en ratas que provoca la estimulación global de la actividad neuronal en sus hipocampos. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva, que se utiliza clínicamente para tratar trastornos depresivos refractarios de drogas en los seres humanos1,2,3. A pesar de uso de la terapia electroconvulsiva para tratar la depresión severa, el mecanismo exacto subyacente sigue siendo ...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Dr. Eric C. Bolton por permitirnos usar su centrífuga para el fraccionamiento y el Dr. Graham H. Diering en laboratorio del Dr. Richard L. Huganir Universidad de John Hopkins por facilitarnos el protocolo en pequeña escala para el fraccionamiento de la PSD.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Referencias

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Neurociencian mero 126electroconvulsiva convulsioneshipocampofraccionamiento subcelulardensidad postsin pticareceptor NMDAel borrar occidental

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados