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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie für schwere Depressionen. ECS stimuliert weltweit Aktivität im Hippocampus, führt zu Synaptogenese und synaptische Plastizität. Hier beschreiben wir Methoden für ECS Induktion bei Ratten und subzellulären Fraktionierung von ihren Hippocampi, Beschlagnahme verursachten Veränderungen in synaptischen Proteine zu untersuchen.

Zusammenfassung

Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die effektivste Behandlung für schwere Depressionen. ECS generalisierte Stärkungsmittel-klonischen Anfällen mit niedrigen Mortalität und neuronalen Tod induziert und ist eine weit verbreitete Modell Bildschirm antiepileptische Drogen. Hier beschreiben wir eine ECS-Induktion-Methode in die kurze 55 mA Strom für 0,5 geliefert wird s zu männlichen Ratten 200-250 g Gewicht über Ohr-Clip-Elektroden. Diese bilaterale Stimulation produziert Stufe 4-5 klonische Anfällen, die dauerte ca. 10 s. Nach der Einstellung der akuten oder chronischen ECS Schein die meisten Ratten erholt, um Verhalten von nisht zu unterscheidend werden "keine Beschlagnahme" Ratten. Da ECS weltweit erhöht die Aktivität des Gehirns, dient es auch aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Proteine und deren Auswirkungen auf synaptische Stärke mit mehreren Methoden zu untersuchen. Insbesondere kann subzellulären Fraktionierung der postsynaptischen Dichte (PSD) in Kombination mit Western blotting für die quantitative Bestimmung der Fülle der synaptischen Proteine bei dieser spezialisierten synaptischen Struktur. Im Gegensatz zu früheren Fraktionierung-Methode, die große Menge an Nagetier Gehirne erfordert, beschreiben wir hier eine kleine Fraktionierung-Methode, um die PSD von Hippokampi einer einzigen Ratte ohne Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung isoliert. Mit dieser Methode zeigen wir, dass die isolierte PSD Bruchteil postsynaptischen Membranproteine, einschließlich PSD95, GluN2B und GluA2 enthält. Präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin wurden von der PSD-Bruch, zeigen erfolgreiche PSD Isolierung ausgeschlossen. Darüber hinaus verringerte chronische ECS GluN2B Ausdruck in der PSD, die darauf hinweist, dass unsere kleine PSD Fraktionierung Methode angewendet werden kann, um die Änderungen im Hippokampus PSD Proteine aus einer einzigen Ratte nach genetischen, pharmakologische oder mechanische Behandlungen zu erkennen .

Einleitung

Elektrokrampftherapie wurde zur Behandlung von Patienten mit großen depressive Störungen, einschließlich schweren Medikamenten-resistenten Depression, bipolare Depression, Parkinson Erkrankungen und Schizophrenie1,2. In dieser Therapie wird Beschlagnahme durch elektrische Impulse geliefert an den Leiter der narkotisierten Patienten über Epicranial Elektroden1,2,3erzeugt. Wiederholte Gabe von ECS wurde klinisch vorteilhaft für resistente depressive Störungen1,2,3. Der genaue Mechanismus zugrunde liegt die langfristige Wirksamkeit der antidepressiven Wirkung beim Menschen blieben jedoch schwer. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie und ist weit verbreitet, seine therapeutischen Mechanismus zu untersuchen. Bei Nagetieren akute ECS und ECS Langzeitbehandlung Förderung der adulten Neurogenese in den Hippocampi und reorganisieren der neuronalen Netzwerk4,5, kognitive Flexibilität zu Verbesserungen beitragen dürfte. Darüber hinaus ändert globale Erhöhung der Aktivität des Gehirns von ECS die Fülle der Transkripte, wie eine Gehirn neurotropic Faktor6und mehrere Proteine, einschließlich metabotropen Glutamat-Rezeptor 17 und N-Methyl-D-Aspartat-abgeleitet (NMDA) Typ Glutamat-Rezeptor-Untereinheiten7. Diese Änderungen sind bei der Vermittlung von langfristigen Veränderung der Synapse Nummer, Struktur und Stärke im Hippocampus7,8,9beteiligt.

ECS-Modelle ist elektrischer Stimulation an Nagetieren per stereotaxically implantierte Elektroden, Hornhaut Elektroden oder Ohrelektroden zu evozieren generalisierten Stärkungsmittel-klonischen Anfällen10,11geliefert. Stereotaktischen Implantation von Elektroden beinhaltet Gehirnchirurgie und erfordert viel Zeit zur Verbesserung der Experimentator chirurgischen Fähigkeiten um Verletzungen zu minimieren. Weniger invasiven Hornhaut Elektroden könnte Korneaabnutzung und Trockenheit verursachen und erfordern Anästhesie. Die Verwendung von Ohr-Clip Elektroden umgeht diese Einschränkungen, weil sie auf Nagetiere ohne Chirurgie oder Anästhesie verwendet werden können und nur minimale Verletzungen verursachen. In der Tat fanden wir, dass aktuelle gelieferten zu wach Ratten über Ohr-Clip Elektroden zuverlässig induziert Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen und synaptischen Proteine in ihrer Hippokampi10verändert.

Um die ECS-induzierte Fülle der synaptischen Proteine in bestimmten Gehirnregionen von den Nagetieren zu untersuchen, ist es wichtig, die experimentellen Methoden zu wählen, die am besten geeignete für ihre Erkennung und Quantifizierung. Subzellulären Fraktionierung des Gehirns ermöglicht für die grobe Lokalisierung der löslichen cytosolischen Proteine; Membranproteinen; Organell-Grenzen Proteine; auch Proteine in speziellen subzellulären Strukturen, wie z. B. die PSD12,13,14. Die PSD ist eine Dichte und gut organisierte subzelluläre Domain in Neuronen in denen synaptischen Proteine hochkonzentriert an und in der Nähe der postsynaptischen Membran12,13,15 sind. Die Isolation der PSD eignet sich für die Untersuchung von synaptischen Proteinen angereichert an der PSD, da dynamische Änderungen in die Fülle und die Funktion der postsynaptischen Glutamatrezeptoren, Gerüstbau Proteine und Signal Transduction Proteine in der PSD-12 , 15 , 16 , 17 sind korreliert mit synaptische Plastizität und die Synaptopathy in mehrere neurologische Störungen17,18beobachtet. Eine vorherige subzellulären Fraktionierung-Methode verwendet, um die PSD zu reinigen beteiligt die Isolation der Waschmittel-unlösliche Fraktion aus Roh Membran Bruchteil des Gehirns durch die differentielle Zentrifugation von Saccharose Steigungen14, 19. die größte Herausforderung bei dieser traditionellen Methode ist, dass es erfordert große Mengen von Nagetier Gehirne14,19. Vorbereitung von 10-20 Nagetiere zu isolieren, die PSD-Fraktion pro Behandlung erfordert umfangreiche Kosten- und Zeitaufwand und ist nicht praktisch durchführbar, wenn es viele Behandlungen gibt.

Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir eine einfachere Methode angepasst, die direkt den PSD-Bruch ohne Saccharose Steigung Zentrifugierung20,21, isoliert und überarbeitet um auf PSD-Isolierung aus der Hippocampi einer einzigen Ratte anwendbar Gehirn. Unsere kleine PSD-Fraktionierung-Methode führt zu über 30-50 µg der PSD Proteine aus 2 Hippokampi, ausreichend für den Einsatz in mehreren biochemischen Tests, einschließlich Immunopräzipitation und westliche Beflecken. Westliche Beflecken, zeigt den Erfolg unserer Methode zur Isolierung von der PSD durch die Enthüllung der Bereicherung der postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD-95) und der Ausschluss von präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin. Unsere ECS Induktion und kleine PSD Fraktionierung Methoden sind leicht anpassbar an anderen Nagetier Gehirnregionen und bieten eine relativ einfache und zuverlässige Möglichkeit zur Bewertung der Auswirkungen von ECS auf die Expression von Proteinen, PSD.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der institutionellen Tiere kümmern und Nutzung hat an der University of Illinois at Urbana-Champaign genehmigt.

1. die Aufrechterhaltung einer Ratte-Kolonie

  1. Züchten Sie Sprague-Dawley Ratten (siehe die Tabelle der Materialien) zu und pflegen sie in standard-Bedingungen mit 12-h-hell-dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
  2. Entwöhnen Sie die Ratte-Welpen an postnatalen Tag (P) 28 zu und beherbergen sie in Gruppen von 2-4 männlich oder weiblich Wurfgeschwistern.
  3. Markieren Sie die Schwänzen von männlichen Ratten mit einem ungiftigen Permanentmarker Schwarz zur Identifikation.
  4. Wiegen der männlichen Rats 3 Mal pro Woche, und notieren Sie ihre Körpergewichte.

2. Vorbereitung einer ECS-Maschine

  1. 07:30 desinfizieren der Bank in den tierischen Vorbereitungsraum und eine ECS-Maschine (Impulsgeber) auf der Bank Platz.
  2. Legen Sie eine einzelne männliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g in einem sauberen, leeren Käfig mit einem Deckel. Wiederholen Sie dies für alle männlichen Ratten mit ECS Induktion behandelt werden. Lassen Sie die Ratten für 30 min zu gewöhnen.
  3. Während die Ratten in ihren Käfigen förderliche sind, legen Sie Impulsgeber für ECS Induktion auf die Frequenz von 100 Impulse/s, eine Pulsbreite von 0,5 ms, eine Schock-Dauer von 0,5 s und einem Strom von 55 mA (Abb. 1A).
  4. Bereiten Sie den Impulsgenerator durch Drücken der Taste "RESET" und sicherzustellen, dass die "READY"-Taste leuchtet. Stellen Sie sicher, dass die Ohr-Clips nicht mit einem Impulsgenerator verbunden sind und dann drücken Sie den "Schock" für ein paar Sekunden.
    Hinweis: an dieser Stelle ist der Impulsgeber für ECS Induktion bereit.
  5. Stecken Sie die Ohr-Clips in den Impulsgenerator.

(3) Induktion von akuten ECS

Hinweis: Siehe Abbildung 1B, Oberseite.

  1. Die Ohr-Clips mit steriler Kochsalzlösung nass und stellen Sie sicher, dass sie gesättigt sind.
  2. Befeuchten Sie eine Ratte in den Ohren mit steriler Kochsalzlösung durch Umwickeln sie in Kochsalzlösung getränkten Gaze. Sobald sie nass sind, entfernen Sie die Gaze.
  3. Befestigen Sie einen Clip pro Ohr, Position jenseits der wichtigsten Knorpel-Band.
  4. Bestätigen Sie auf der ECS-Maschine, dass eine wahre Schleife entsteht; Wenn dies nicht der Fall ist, erscheint eine Fehlermeldung oder eine Lesung von "1" auf dem Computer.
  5. Tragen Sie einen dicken, Nichtmetall Handschuh. Halten Sie die Ratte sanft in einer behandschuhten Hand, drücken Sie den "Schock" für ein paar Sekunden und lassen Sie langsam den Griff auf die Ratte, die Beschlagnahme zu beobachten los. Für die Farce "keine Beschlagnahme" (NS) kontrollieren, Ratte gleich zu behandeln aber nicht den Strom liefern.
  6. Trennen Sie die Ohr-Clips als Klonus beginnt und erfassen die Beschlagnahme Verhalten nach einer überarbeiteten Racine Skala22 , die "Mund- und Gesichts-Bewegungen" (Stufe 1), "Kopf nicken" (Stufe 2), "Vordergliedmaße Klonus" enthält (Stufe 3), "Aufzucht mit Vordergliedmaße Klonus" (Stufe 4), und "Aufzucht und Vordergliedmaße Klonus verliebt" (Stufe 5). Die Beschlagnahme dauert ca. 10 s; Notieren Sie die Beschlagnahme Dauer mit Hilfe eines Timers.
  7. Nach der Aufhebung der Beschlagnahme die Ratte zurück zu seinem Hause Käfig. Überwachen Sie die Ratte für weitere 5 min um sicherzustellen, dass die Erholung der Ratte von den Anfällen. Halten Sie es einzeln in den Käfig untergebracht und wieder den Käfig in den Aufwachraum.
  8. Wiederholen Sie die ECS-Induktion auf die nächste Ratte.
  9. Überwachen Sie die Ratten für den Rest des Tages und mindestens einmal morgens und einmal am Nachmittag des Folgetages bis sie für Experimente eingeschläfert werden.
    Hinweis: Die ECS Induktionsmethode klinischen Symptome als gelegentliche Nebenwirkung, könnten die Aufmerksamkeit erfordert. Beispielsweise könnte das ECS-Induktion-Protokoll Anfälle auslösen, die länger als 15 s und verursachen unnötige Notlage für die Ratten. In diesem Fall kündigen Sie die Beschlagnahme mit Diazepam (10 mg/kg, i.p.) oder Pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Wenn die Ratten Atemnot oder schweren Verhaltens-Auffälligkeiten nach Beschlagnahme Einstellung entwickeln, einschläfern sie durch Kohlendioxid einatmen gefolgt durch Enthauptung.

(4) Induktion von chronischen ECS

Hinweis: Siehe Abbildung 1B, Bodenplatte.

  1. Induzieren Sie eine ECS täglich zur gleichen Zeit am Morgen in den Schritten 1-3, oben beschriebenen, für sieben aufeinander folgende Tage.
  2. Monitor die Ratten Käfige zweimal einen Tag, nachdem sie in ihre Heimat zurückgekehrt sind.

5. Homogenisierung und Fraktionierung der Ratte Hippocampi

Hinweis: Siehe Abbildung 2.

  1. Bereiten Sie einen frisches Homogenisierung Puffer (Lösung A), Saccharose 320 mM, 5 mM Natrium Pyrophosphat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4 enthält, 200 nM Okadaic Säure- und Protease-Inhibitoren. Sterilisieren Sie den Puffer mit Filter mit einer 0,22 µm Porengröße für Vakuumfiltration Filter zu und legen Sie es auf dem Eis.
  2. Zu einem bestimmten Zeitpunkt Punkt nach ECS akute oder chronische ECS (Abbildung 1), die Ratte von CO2 Inhalation für 5-10 min, gefolgt von Enthauptung mit einer Guillotine einschläfern.
  3. Entfernen Sie das Gehirn und sezieren Sie die Hippocampi auf der Metallplatte auf Eis gelegt, wie zuvor beschrieben23,24.
  4. Legen Sie zwei Hippokampi von einer Ratte auf ein 30-mm-Gewebe-Kultur-Speise- und sie mit einer Schere in kleine Stücke hacken.
  5. Übertragen Sie Hackfleisch / Hippokampi auf eine manuelle Glas-Homogenisator mit einer 1 mL-Pipette und 1 mL eiskaltes Homogenisierung Puffer (Lösung A, Schritt 5.1). Legen Sie eine Runde Stößel in ein Glas-Homogenisator. Während die Glas-Homogenisator auf Eis, streicheln Sie sanft und gleichmäßig rauf und runter auf den Stößel 10 - 15 Mal für 1 min, bis kleine Stücke des Hippokampus Gewebe verschwinden.
  6. Übertragen Sie das Homogenat auf einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette und Zentrifugieren Sie Homogenat 800 X g für 10 min bei 4 ° C, die postnukleare überstand (S1 Bruch) zu trennen von der Pellet mit unlöslichen Gewebe und Kerne (P1-Bruch). Übertragen Sie 50 µL und 950 µL der S1-Fraktion auf zwei separate, neue 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 1 mL-Pipette und speichern Sie diese Rohre auf Eis. Speichern Sie das P1 Bruchteil Pellet auf Eis.
  7. Zentrifugieren den S1-Bruch (950 µL) für 10 min bei 13.800 x g und 4 ° C, den überstand (S2 Bruch), angereichert mit cytosolischen lösliche Proteine zu trennen und das Pellet (P2 Bruch), angereichert mit Membran-gebundene Proteine, einschließlich synaptosomal Proteine. Übertragen Sie die S2-Fraktion auf eine neue 1,7 mL Microcentrifuge mit einer 1-mL-Pipette und speichern Sie es auf dem Eis.
  8. Aufzuwirbeln Sie das Pellet (P2 Bruch) in 498 µL eiskaltes gereinigtes Wasser mit einer 1-mL-Pipette. Fügen Sie 2 µL 1 M HEPES (pH 7,4) mit einer 20 µL Pipette, um eine Endkonzentration von 4 mM HEPES (pH 7,4) zu erreichen. Inkubieren Sie bei 4 ° C mit Agitation für 30 min. laden die resuspendierte P2-Fraktion auf Eis.
  9. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der S1, S2 und P2 Fraktionen mit einem BCA-Assay. Jede Fraktion zu erreichen eine Konzentration von 1 mg/mL und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren 50 mM HEPES (pH 7,4) hinzufügen oder Bearbeiten der P2-Fraktion um die PSD zu isolieren.

6. Isolierung der PSD aus dem Roh Membran Proteinfraktion (P2)

  1. Zentrifugieren Sie den P2-Bruch (500 µL) für 20 min bei 25.000 x g und 4 ° C der lysierten überstand (LS2 Bruch) und lysierten Pellet (LP1 Bruch) zu trennen. Übertragen Sie den LS2-Bruch zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1 mL-Pipette und speichern Sie es auf dem Eis.
  2. Aufschwemmen Sie LP1 Pellet in 250 µL 50 mM HEPES (pH 7,4) gemischt mit 250 µL 1 % Waschmittel in 1 x PBS-Puffer mit einer 1 mL-Pipette. Bei 4 ° C mit sanften Agitation für 15 min inkubieren.
  3. Zentrifugieren Sie die resuspendierte LP1-Pellet für 3 h bei 25.000 x g und 4 ° C, den überstand (Bruch-PSD) von Pellet (PSD Bruch) zu trennen. Den Überstand zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch entfernen und Aufschwemmen der PSD Pellet in 100 µL 50 mM HEPES (pH 7,4) mit einer 200 µL Pipette.
  4. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der LS2-PSD und PSD Brüche mit einem BCA-Assay. Jede Fraktion zu erreichen eine Konzentration von 1 mg/mL und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren fügen Sie 50 mM HEPES (pH 7,4 hinzu).
    Hinweis: Alle Lösungen für die Schritte 5 und 6 (d. h. Lösung A, HEPES-Puffer und PBS-Puffer) sollten mit gereinigtem Wasser frei von ionischen und organischen Verunreinigungen und Partikel erfolgen.

(7) Western Blotting

  1. Jede Proteinfraktion auf Eis auftauen. Übertragen Sie 12 µL der einzelnen Fraktionen (S2, P2 und PSD in 1 mg/mL) auf einen neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einem 20-µL Pipette.
  2. Fügen Sie 3 µL 5 X SDS-Probenpuffer und bei 75 ° C für 30 min im Wasserbad inkubieren. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur (RT).
  3. Laden Sie 10 µL der Probe Protein in jede Vertiefung von 4-20 % Steigung 15-Well-Kamm SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gel mit einer 20 µL Pipette. Führen Sie das Gel in der SDS-PAGE-Apparat und bei 80-100 V im laufenden Puffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 0,1 % SDS; pH 8,3).
    Hinweis: Jedes Gel sollte Proteinproben von NS-Ratten und ECS Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten nach akuter oder chronischer ECS enthalten.
  4. Transfer die Proteine aus der SDS-PAGE gel auf eine Membran polyvinyl Difluoride (PVDF) in den Transfer-Apparat bei 25-30 V (60 mA) für 9-12 h im Transfer-Puffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 20 % Methanol; pH 8,3).
  5. Entfernen Sie die PVDF-Membran aus dem Transfer-Gerät zu und waschen Sie es in Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) für 5 min auf ein Mehrzweck-Rotator bei RT
  6. Blockieren der Membran in 5 % Milch und 0,1 % Tween-20 in TBS für 1 h inkubieren sie in primären Antikörper (Tabelle 1) waschen Puffer (1 % Milch und 0,1 % Tween-20 in TBS) über Nacht auf ein Mehrzweck-Rotator bei 4 ° C (siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungen).
  7. Die Membran 4 Mal für 10 min in Waschpuffer waschen und inkubieren Sie es dann mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper in Waschpuffer für 1 h auf ein Mehrzweck-Rotator bei RT
  8. Waschen Sie die Membran 4 Mal für 10 min in Waschpuffer und dann mit TBS für 5 Minuten.
  9. Inkubieren Sie die Membran mit verstärkten Chemifluorescence Substrat für 1 min und setzen sie auf Röntgenfilm. Entwickeln Sie den belichteten Film mit einem Film-Prozessor.

(8) Quantifizierung des Western Blots

  1. Der Western blot als TIFF-Datei und speichern Sie diese Datei auf den Computer zu scannen.
  2. Öffnen Sie die Western-Blot-Datei in das Programm ImageJ als Graustufenbild, unter "Datei", "Bild öffnen," Pfeil nach rechts "Graustufen."
  3. Wählen Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug aus der ImageJ-Symbolleiste und zeichnen Sie ein Rechteck, das eine einzelne Western-Blot-Band eines Proteins des Interesses abdeckt.
  4. Treffen Sie unter "Analyze" "Maßnahme" um die Gegend und der mittleren Dichte einer ausgewählten Band zu erhalten.
  5. Bewegen Sie das Rechteck auf ein Hintergrundbereich ohne Änderung seiner Größe und Form. Wiederholen Sie Schritt 8.4 zu der mittleren Dichte des Hintergrunds und der Umgebung.
  6. Subtrahieren Sie den mittleren Dichte-Wert einer Hintergrund-Band von der Western-Blot-Band, die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte des Proteins des Interesses zu geben.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 8,2-8,6 für alle Western-Blot-Bänder von Interesse.
  8. Teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte des Proteins des Interesses durch die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte von einem Zimmermädchen Genprodukt, z. B. α-Tubulin; Dieser Schritt führt zu den normalisierte Wert des Proteins des Interesses.

Ergebnisse

Mit dem detaillierten Verfahren präsentiert hier einen elektrischen Schlag (55 mA, 100 Impulse/s für 0,5 s) über die Ohr-Clip Elektroden induzierten einmalige Bühne 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen bei Ratten (Abbildung 1A-B) geliefert. Insgesamt 8 von Ratten akute ECS Induktion empfangen und angezeigt Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen. Die Anfälle dauerten ca. 10 s und alle Ratten, die innerhalb von 1-2 Minuten Beschlagnahme Einste...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine ECS Induktionsmethode bei Ratten, die die globale Stimulation neuronaler Aktivität in ihren Hippokampi entlockt. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die klinisch zur Behandlung von Drogen feuerfest depressive Störungen bei Menschen1,2,3. Trotz Verwendung der Elektrokrampftherapie Therapie zur Behandlung von schweren Depressionen bleibt die präzise zugrunde liegende Mechanismus unklar. D...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Eric C. Bolton für die Erlaubnis, seine Zentrifuge für die Fraktionierung und Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir Lab an Johns Hopkins Universität für die Bereitstellung von uns mit dem kleinen Protokoll für die PSD-Fraktionierung zu verwenden.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

Referenzen

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