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요약

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

초록

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 "발작" 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .

서문

Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.

ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.

ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.

이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.

프로토콜

동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.

1. 쥐 식민지를 유지 하

  1. Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것.
  2. 출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또는 여성 littermates의 그룹에서 그들을 집.
  3. 확인을 위해 비 독성 영구 블랙 마커 남성 쥐의 꼬리를 표시 합니다.
  4. 주 당 3 번 남성 쥐 무게와 그들의 bodyweights를 기록.

2입니다. ECS 시스템의 준비

  1. 오전 7 시 30 분, 동물 준비 실에서 벤치를 소독 하 고 벤치에는 ECS 컴퓨터 (펄스 발생기)를 배치 합니다.
  2. 장소는 개별 남성 쥐 새 장에 깨끗 하 고 빈 뚜껑 200-250 g를 무게. 이 모든 남성 쥐 ECS 유도 치료를 반복 합니다. 30 분 동안 길 들 쥐를 보자.
  3. 쥐가 그들의 감 금 소에서 habituating는, ECS 유도 대 한 펄스 발생기 100 펄스/s, 0.5 ms의 펄스 폭, 0.5의 충격 기간의 주파수로 설정 s, 및 55의 전류 (그림 1A).
  4. "리셋" 버튼을 누르면 하 고 "준비" 버튼이 켜져 확인 하 여 펄스 발생기를 준비 합니다. 귀 클립 펄스 발생기에 연결 되지 않습니다 다음 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누릅니다 있는지 확인 합니다.
    참고:이 시점에서, 펄스 발생기는 ECS 유도 대 한 준비.
  5. 펄스 발생기에 귀 클립을 연결 합니다.

3입니다. 급성 ECS의 유도

: 참고 그림 1B, 상단 패널.

  1. 멸 균 식 염 수와 귀 클립 젖은 고 그들은 포화 상태를 확인 합니다.
  2. 식 염 수에 젖은 거 즈에서 그들을 포장 하 여 멸 균 식 염 수와 쥐의 귀를 젖은. 일단 그들이 젖은 거 즈를 제거 합니다.
  3. 귀, 주요 연골 밴드 넘어 위치 당 하나의 클립을 연결 합니다.
  4. 그는 진정한 루프 설립; ECS 시스템에서 확인 그렇지 않으면, 오류 메시지 또는 "1"의 컴퓨터에 표시 됩니다.
  5. 두께, 비-금속 장갑 착용. 부드럽게 gloved 손에서 쥐를 잡고, 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누르고 천천히 발작을 관찰 하기 위해 쥐에 그립을 풀어. "발작" 가짜 (NS) 제어, 쥐를 동일 하 게 처리 하지만 현재 제공 하지 않습니다.
  6. Clonus 시작으로 귀 클립을 분리 하 고 (1 단계), "머리를 끄 덕" (2 단계), "forelimb clonus" "입과 얼굴의 움직임"를 포함 하는 개정된 라신의 규모22 에 따라 발작 동작 기록 (3 단계), "양육 forelimb clonus와" (4 단계), 그리고 "양육과 forelimb clonus 떨어지고" (5 단계). 나포 약 10 마지막으로 해야 s; 타이머를 사용 하 여 발작 기간을 기록 합니다.
  7. 나포 종료, 다음 홈 그것의 감 금에 쥐를 반환 합니다. 쥐의 발작에서 회복 되도록 또 다른 5 분 동안 쥐를 모니터링 합니다. 장에 홀로 지 내게 그것을 유지 하 고 회복 실에 감 금 소를 반환.
  8. 다음 쥐에 ECS 유도 반복 합니다.
  9. 나머지 하루 아침에 한 번 이상 있고 그들은 실험에 대 한 안락사는 때까지 다음 날 오후에 한번 걸쳐 쥐를 모니터링 합니다.
    참고: ECS 유도 메서드는 부수적 부작용으로, 주의 요하는 임상 증상을 발생할 수 있습니다. 예를 들어, ECS 유도 프로토콜 수 쥐를 15 s 및 원인 불필요 한 고통 보다 더 오래 지속 되는 발작을 유도 하 고 있다. 이 경우에, 다이아 제 팜 (10 mg/kg, i.p.) 또는 pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 발작을 종료 합니다. 쥐 호흡 곤란 이나 심한 행동 이상 발작 정지 다음 개발, 경우 잘린 뒤 이산화탄소 흡입에 의해 그들을 안락사.

4입니다. 만성 ECS의 유도

주: 그림 1B, 하단 패널을 참조 하십시오.

  1. 7 일 연속, 위의 1-3 단계에 설명 된 대로 아침에 같은 시간에 하루 한 ECS를 유도.
  2. 모니터는 쥐 두 번 하루에 그들은 그들의 가정에 반환 된 후 연습장.

5. 균질 및 쥐 된의 분류

참고: 그림 2를 참조 하십시오.

  1. 자당 320 m m, 5mm 나트륨 파이 인산, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 포함 하는 신선한 균질 버퍼 (솔루션) 준비 200 nM okadaic 산 및 효소 억제제. 필터-필터를 사용 하 여 진공 여과 0.22 μ m 기 공 크기와 버퍼를 소독 하 고 얼음에 그것을 배치.
  2. 주어진된 시간에 가리킨 다음 ECS 급성 또는 만성 ECS (그림 1), 5-10 분, 잘린은 단두대를 사용 하 여 다음 공동2 흡입에 의해 쥐를 안락사.
  3. 두뇌를 제거 하 고 앞에서 설명한23,24얼음에 배치 하는 금속 격판덮개에 된 해 부.
  4. 30 m m 조직 문화에 한 쥐에서 장소 2 된 접시 하 고가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 말하다.
  5. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수동 유리 균질 화기를 다진된 된 전송 하 고 차가운 균질 버퍼 (솔루션, 단계 5.1)의 1 mL를 추가 합니다. 유리 균질 화기에 둥근 유 봉을 삽입 합니다. 얼음에 유리 균질 화기를 실행 하는 동안 부드럽게 그리고 꾸준히 뇌졸중 위아래로 10-15 시간 1 분, 대 한 유 봉에 hippocampal 조직의 작은 조각을 사라질 때까지.
  6. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 1.7 mL microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 불용 성 조직 및 핵 (P1 분수)를 포함 하는 펠 릿에서 homogenate postnuclear 상쾌한 (S1 분수)를 구분을 4 ° C에서 10 분 동안 800 x g에서 원심. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 두 개의 별도, 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 50 µ L 및 S1 분수의 950 µ L를 전송 및 얼음이 튜브를 저장. 얼음에 P1 분수 펠 릿을 저장 합니다.
  7. S1 분수 (950 µ L) 13, 800 x g와 상쾌한 (S2 분수), 수용 성 cytosolic 단백질 농축 분리 하 4 ° C에서 10 분 원심 하 고 펠 릿 (P2 분수), 막 바인딩 단백질, synaptosomal 단백질을 포함 한 농축. S2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.
  8. 얼음 처럼 차가운 물 1 mL 피 펫을 사용 하 여 정화의 498 µ L에서 펠 릿 (P2 분수)를 resuspend. 추가 1 M HEPES (pH 7.4)의 2 µ L 4 mM HEPES (pH 7.4)의 최종 농도 달성 하기 위해 20 µ L 피 펫을 사용 하 여. Resuspended P2 분수 얼음에 30 분이 게에 대 한 동요와 4 ° C에서 품 어.
  9. BCA 분석 결과 사용 하 여 S1, S2, P2 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C까지 사용, 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 하거나 PSD를 분리 하는 P2 분수를 처리 합니다.

6. 원유 막 단백질 (P2) 분수에서 PSD의 격리

  1. Lysed 상쾌한 (LS2 분수)와 lysed 펠 릿 (LP1 분수)를 분리 하는 P2 분수 (500 µ L) 25000 x g와 4 ° C에서 20 분을 원심. LS2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.
  2. 250 µ L 1 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 1에 1% 세제의 혼합 50 mM HEPES (pH 7.4)의 250 µ L에서 LP1 펠 릿을 resuspend. 15 분에 대 한 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 품 어.
  3. 25000 x g와 펠 릿 (PSD 분수)에서 상쾌한 (비 PSD 분수)를 분리 하 4 ° C에서 3 h resuspended LP1 펠 렛 원심 상쾌한 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 50 mm HEPES (pH 7.4) 100 µ L에서 PSD 펠 릿 resuspend 200 µ L 피 펫을 사용 하 여.
  4. LS2, 비-PSD를, 그리고 BCA 분석 결과 사용 하 여 PSD 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C에서 사용까지 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 합니다.
    참고: 모든 솔루션 (즉, 해결책, HEPES 버퍼, 그리고 PBS 버퍼) 5-6 단계에서 사용 되는 정화 물 이온 및 유기 오염 물질과 입자의 무료 여야 한다.

7. 서 부 럽

  1. 각 단백질 분수 얼음에 녹여 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브 (S2, P2, 그리고 1 mg/mL의 PSD) 각 분수의 12 µ L를 전송 합니다.
  2. 5 x SDS 샘플 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 물 욕조에 30 분 동안 75 ° C에 품 어. 차가운 실내 온도 (RT) 아래로 샘플.
  3. 4-20% 그라데이션 15 잘 빗 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 젤 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 단백질 샘플의 10 µ L를 로드 합니다. SDS 페이지 장치에 버퍼를 실행에 80-100 V에서 젤을 실행 (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 0.1 %SDS; pH 8.3).
    참고: 각 젤 NS 쥐와 급성 또는 만성 ECS 다음 다른 시간 지점에서 ECS 쥐에서 단백질 견본을 포함 해야 합니다.
  4. 전송 SDS 페이지에서 단백질 젤 25-30 V에서 전송 장치에 비닐 difluoride (PVDF) 막 (60 mA) 전송 버퍼에 9-12 h (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 20% 메탄올; pH 8.3).
  5. 전송 장치에서 PVDF 멤브레인을 제거 하 고 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 실시간 다중 목적 회전에 5 분에서 그것을 씻어합니다
  6. 5% 우유에 막 차단 및 0.1% 트윈-20 1 헤에 대 한 TBS에서 품 어 그것 세척 버퍼에 1 차 항 체 (표 1)에서 (1% 우유와 0.1 %TBS 트윈-20) 4 ° C에서 다중 목적 회전에 하룻밤 (희석에 대 한 재료의 표 참조).
  7. 워시 버퍼에서 4 시간 10 분 대 한 멤브레인을 세척 하 고 다음 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 그것을 품 어-실시간에 다중 목적 회전에 1 시간에 대 한 버퍼를 세척에 2 차 항 체를 활용
  8. 5 분 4 시간 10 분 대 한 막 워시 버퍼 그리고 TBS로 세척.
  9. 1 분에 대 한 향상 된 chemifluorescence 기판으로 막 품 어 하 고 x 선 필름에 노출. 필름 프로세서와 함께 노출된 영화를 개발할 수 있습니다.

8입니다. 서 부도 말의 정량화

  1. 검색 양과 TIFF 파일로 오 컴퓨터에이 파일을 저장 합니다.
  2. "파일," "이미지 열기," 오른쪽 화살표 "그레이 스케일" 회색조 이미지로 ImageJ 프로그램에서 서쪽 오 점 파일을 엽니다
  3. ImageJ 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 선택 하 고 관심사의 단백질의 하나의 서양 오 점 밴드를 포함 하는 사각형을 그립니다.
  4. "분석" 아래 "측정을" 지역 및 선택한 밴드의 평균 밀도를 했다.
  5. 그것의 크기와 모양을 변경 하지 않고 배경 영역에 사각형을 이동 합니다. 및 배경의 밀도 8.4 단계를 반복 합니다.
  6. 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도 주는 서쪽 오 점 밴드의 배경 밴드의 밀도 값을 뺍니다.
  7. 관심의 모든 서쪽 오 점 밴드 8.2 8.6 단계를 반복 합니다.
  8. Α-Tubulin;와 같은 내부 관리 유전자 제품의 배경 빼고 밴드 밀도 의해 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도를 나눕니다 이 단계는 관심사의 단백질의 정규화 된 값을 생성합니다.

결과

상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 "아니 발작" 쥐 전기 충격을 ...

토론

여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 ?...

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 말

저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS supplies
A pulse generatorUgo Bsile, Comerio, Italy57800ECS supplies
MilliQ water purifying systemEMD MilliporeZ00Q0VWWSubcellular fractionation supplies
SucroseEm scienceSX 1075-3Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Subcellular fractionation supplies
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Subcellular fractionation supplies
Okadaic acidTOCRIS1136Subcellular fractionation supplies
Halt Protease InhibitorThermo Scientific78429Subcellular fractionation supplies
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top FiltersFisher ScientificSCGPS05RESubcellular fractionation supplies
Iris ScissorsWPI (World Precision Instruments)500216-GSubcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dishFisher Scientific08-772BSubcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestleVWR89026-384Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tubeDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher75004521Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mLThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SWestern blot supplies
Running BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gelBIO-RAD#1658004Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in the labWestern blot supplies. 
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot supplies
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfateSIGMA-ALDRICH436143Western blot supplies
Methanol Fisher ScientificA454-4Western blot supplies
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot supplies
Nonfat instant dry milkGreat valueWestern blot supplies
Multi-purposee rotator Thermo ScientificModel-2314Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate Thermo Scientific32106Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processorKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
SynaptophysinCell Signaling#4329Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-TubulinSantacruzSC-5286Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2BNeuromab75-097Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

참고문헌

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