إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

Summary

حقن (PN) برونوكلير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) ونظام البروتين-9 المرتبطة كريسبر نوكلاس (كريسبر/Cas9) طريقة ذات كفاءة عالية لإنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا. هنا، نحن تصف البروتوكول حقن PN مفصلة لإنتاج الجينات خروج المغلوب الهامستر مع نظام كريسبر/Cas9.

Abstract

تقنية حقن (PN) pronuclear أنشئت أول مرة في الفئران لإدخال المواد الجينية الأجنبية في برونوكلي الأجنة مرحلة خلية واحدة. عرض المواد الجينية قد دمج الجينوم الجنينية وتوليد الحيوانات المحورة وراثيا مع المعلومات الجينية الأجنبية بعد نقل الأجنة حقن لتشجيع الأمهات. وعقب النجاح الذي حققه في الفئران، تم تطبيق حقن PN بنجاح في العديد من أنواع الحيوانات الأخرى. في الآونة الأخيرة، حقن السند الإذني قد استخدمت بنجاح لإدخال الكواشف مع تعديل الجينات الأنشطة، مثل نظام كريسبر/Cas9، لتحقيق التعديلات الوراثية الخاصة بالموقع في المختبر عدة ومزرعة الحيوانات. بالإضافة إلى إتقان مجموعة خاصة من microinjection المهارات اللازمة لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا بحقنه PN، الباحثين يجب أن نفهم فسيولوجية الإنجاب وسلوك الأنواع المستهدفة، لأنه يقدم كل أنواع فريدة من نوعها التحديات. على سبيل المثال، قد الأجنة الهامستر السوري الذهبي فريدة معالجة الاحتياجات في المختبر بتقنيات الحقن PN لم تكن ممكنة في هذه الأنواع حتى الاكتشافات الأخيرة من مجموعتنا. لدينا بروتوكول الحقن PN تعديل الأنواع، نجحنا في إنتاج العديد من خروج المغلوب الجينات (كو) و knockin الهامستر (كي)، التي استخدمت بنجاح للأمراض التي تصيب الإنسان النموذجي. هنا يمكننا وصف الإجراء حقن PN لإيصال المعقدة كريسبر/Cas9 إلى زيجوتيس الهامستر، وشروط التعامل مع الجنين، إجراءات نقل الأجنة، وتربية المطلوبة لإنتاج وراثيا تعديل الهامستر.

Introduction

الهمستر السوري الذهبي (Mesocricetus الذهبي) واحد من القوارض الأكثر استخداماً للبحوث الطبية الحيوية. ووفقا "وزارة الزراعة الأمريكية"، واستخدمت قداد 100,000 تقريبا في الولايات المتحدة في عام 2015، الذين يمثلون 13% استخدام مختبر مجموع الحيوانات فيما بين الأنواع المشمولة "قانون رعاية الحيوان" (http://www.aphis.usda.gov; الوصول إلى 10 مارس 2017).

الهمستر يوفر العديد من المزايا الأخرى القوارض في الدراسة لعدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. على سبيل المثال، adenocarcinomas الأقنية البنكرياس الأنسجة من N-nitrosobis(2-oxopropyl) أمين (ميزان المدفوعات) التي يسببها في الهامستر مماثل لاورام البنكرياس البشرية، بينما يدفع أسعار صرف العلاج أساسا أورام الغدة الدرقية في الفئران والرئة وأورام الكبد في ¹من الفئران. لأن الهامستر هي القوارض الصغيرة فقط وجدت لدعم النسخ متماثل غدية، وهم أيضا النموذج المفضل لاختبار العقاقير المضادة إتش^2،،من³⁴ومتجهات أونكوليتيك المستندة إلى إتش. مثال آخر حيث يقدم نموذج الهامستر ميزة على الفئران والجرذان في دراسة الدهون. البشر والهامستر معرض للتشابه الكبير في الدهون الأيضية وتحمل الجينات ترميز cholesteryl إستر نقل البروتين (التبادل)، الذي يلعب دوراً محوريا في دهن الأيض، بينما يتم التبادل غائبة في الفئران والجرذان⁵من كل الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، وضع الهامستر النزفية مرض أكثر تمثيلاً لمظاهر البشرية بعد التعرض ل فيروس الإيبولا⁶. قداد أيضا نماذج الاختيار لدراسة تصلب الشرايين⁷، وسرطانات الفم⁸، والتهاب ميوباثيس⁹. في الآونة الأخيرة، كما ثبت أن الهامستر تكون عرضه للإصابة بعدوى الفيروس الأنديز وتطوير فيروس هانتا الرئوية مثل متلازمة المرض، تقديم نموذج القوارض فقط من الإصابة بالفيروس الأنديز¹⁰.

لمعالجة الحاجة غير الملباة لرواية النماذج الحيوانية الوراثية لدراسة الأمراض البشرية التي يتوفر فيها لا نموذج القوارض صغيرة يمكن الاعتماد عليها، نحن قد نجحت في تطبيق نظام كريسبر/Cas9 إلى الهامستر مؤخرا وقد أنتجت عدة أسطر من وراثيا هندسة قداد¹¹. زيجوتيس الهامستر حساسة للغاية للأوساط البيئية أن البروتوكولات حقن PN نمواً في الأنواع الأخرى غير مناسبة. ولذلك، علينا وضع بروتوكول حقن PN الهامستر يتوافق مع المتطلبات الخاصة للتعامل مع الهامستر أجنة في المختبر. هنا، نحن تصف الإجراء حقن PN مفصلة باستخدام نظام كريسبر/Cas9 والخطوات المرافقة، من إعداد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) لنقل الأجنة حقنه في الإناث المتلقية.

Protocol

وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية يوتا الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول (بروتوكول إياكوك: 2484). المستخدمة في هذا البروتوكول قداد الكبار (6-10 أسابيع عمر) [لفغ] سلالة الهامستر السوري الذهبي. قداد جميع يسكن في فيفاريوم في مركز بيوينوفيشن، جامعة ولاية يوتا. يتم تعيين درجة حرارة الغرفة في 23 درجة مئوية، يتم تعيين الرطوبة في 40-50%، ويتم تعيين دائرة الضوء 02:00 م (الضوء: الظلام). كلما كان ذلك ممكناً، ينبغي القيام بإجراءات سوروجيكال والتلاعب الجنين مع تقنيات عقيمة.

1-سجرنا، وإعداد ريبونوكليوبروتينس (رنب) Cas9/سجرنا

1. توليف سجرناس في المختبر النسخ الإجراءات التالية المبينة في الدليل لتوليف كيت (جدول المواد، الملحق 1).
2. لتجميع ريبونوكليوبروتينس، خلط 2 ميكروغرام من Cas9 مع 1 ميكروغرام من سجرنا واحتضان هذا المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة. لحقن PN، جعل حلاً عامل في تركيز 100 نانوغرام/ميليلتر Cas9 وسجرنا 50 نانوغرام/ميليلتر مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 10 ملم (رناسي الحرة، مواد الجدول).

2-استئصال الاسهر بإعداد

ملاحظة: يتم استئصال الاسهر في الهامستر الذكور في 6-8 أسابيع عمر. ينبغي إجراء عملية جراحية قبل التزاوج الأولى 10-14 يوما. ويؤكد فشل الحمل من التزاوج مع الإناث الخصبة العقم. يمكن عادة استخدام الذكور استؤصل الاسهر لديهم لمدة سنة قبل أن يصبحوا ناشطين جنسياً أقل.

1. تخدير الذكور عن طريق الحقن داخل (القائمة) من الكيتامين/xylazine مع جرعة من 40 مغ/كغ (الكيتامين) و 10 مغ/كغ (إكسيلازيني). تأكيد التخدير بانعدام منعكس دواسة (قرصه تو).
2. وضع الهامستر مخدراً في ريكومبينسي الظهرية على ورقة الأنسجة جافة. شطف البطن مع ثلاث جولات من العلاجات مطهر بالتناوب الجراحية فرك الحلول بين الكحول 70% وبوفيدون.
3. جعل شق عمودي مع المقص الجراحي ابتداء من الجمجمة إلى القلفة تمتد 1 سم على كل جانب من منتصف الخط (الشكل 1a) 1.5 سم. جداً الجلد والنسيج تحت الجلد وينيا ألبا الوصول إلى الفضاء البريتوني (الشكل 1b).
4. تطبيق ضغط لطيف على الجانب والذيلية الصفن إلى القوة في الخصيتين والأنسجة الدهنية بها. فهم الاسهر بلطف مع الملقط وفصل الأوعية الدموية من خدمات القيمة المضافة عناية مع مجموعة ثانية من الملقط (الشكل 1 ج).
5. عقد الاسهر مع الملقط لتشكيل حلقة. حرارة غيض الملقط آخر في اللهب حتى أنها حمراء، وثم استخدامه لإزالة حلقة الاسهر. إدراج الأنسجة الدهنية والخصيتين مرة أخرى إلى البطن. إزالة الاسهر على الجانب الآخر بنفس الإجراءات.
6. خياطة العضلات أولاً متبوعاً بخياطة الجلد. وضع الحيوان على وسادة دافئة في قفص لمدة 30 دقيقة حتى يسترد الحيوان. مراقبة الحيوان حتى يستأنف النشاط العادي.

3-الجهات المانحة والمتلقية الهامستر إعداد الجدول الزمني

1. رصد وتسجيل الدورات الشبقية.
   ملاحظة: لدى اليرانب الإناث دورة الشبقية مستقرة 4-أيام التي يتم الاحتفاظ بها بعد الولادة مباشرة. يمكن التعرف على الإناث في اليوم الأول من استروس بالافرازات المهبلية مبهمة وصفراء ولزجة (الشكل 2a). يمكن التعرف على الإناث في يوم 4 من استروس بالمخاط شفافة ولزجة (الشكل 2).
2. سوبيروفوليشن الهامستر المانحين، سوبيروفولاتي الإناث جنسياً ناضجة (> 6 أسابيع) اليوم الأول من الدورة الشبقية بالحقن IP تروج الحوامل مير المصل (بمسج؛ وتم حله في برنامج تلفزيوني ك 50 وحدة دولية/مل) (الجدول 1) بين 9-12 صباحا.
   ملاحظة: يتم بمسج لحمل سوبيروفوليشن ولكن ليس لتزامن الدورة الشبقية.
3. 80-84 ح بعد حقن بمسج (يوم 4، ص 6-8)، وضع الإناث في أقفاص مع الذكور للتزاوج. كما الهامستر ماتينجس لا يؤدي الجماع المقابس، ضمان ماتينجس الناجحة التي تشاهد في ماتينجس.
4. إعداد الإناث بسيودوبريجنانت بالتزاوج الإناث جنسياً ناضجة في يوم 4 من استروس مع الذكور استؤصل الاسهر لديهم. الجدول الزمني لإعداد الإناث في الجهات المانحة والمتلقية مبينة في الجدول 2.
   ملاحظة: الإناث الحوامل صحيح يمكن أيضا استخدام المستلمين، أي، والإناث بلون معطف يمكن تمييزها من اللون الذهبي متعقد مع نفس لون الذكور الخصبة. ويمكن تحديد الجراء المستمدة من نقل الأجنة استناداً إلى ألوان معطف. ميزة محتملة في استخدام الإناث الحوامل الحقيقي هو أن الأجنة المنتجة اندوجينوسلي أن ضمان نجاح الحمل وتساعد PN حقن الأجنة الزرع؛ عيب محتمل في استخدام الإناث الحوامل الحقيقية كمتلقين أن PN حقن الأجنة الحاجة إلى التنافس مع اندوجينوسلي إنتاج أجنة لغرس.

4-اقحه العزلة

1. تعد الثقافة المتوسطة (حكم-9؛ ويرد وصفه في الملحق 2)، كما هو موضح سابقا في ماكيرنان وبفيستر¹².
2. يوم واحد قبل الحقن PN، إعداد اقحه التعامل مع الأطباق (25 ميليلتر في إسقاط) وانخفاض حقن PN (100 ميليلتر) غطاء طبق 35 ملم مع حكم-9. ثم تغطية قطرات متوسطة مع الزيوت المعدنية. متوسط الرصيد في حاضنة بين عشية وضحاها تحت الظروف التالية: 37.5 درجة مئوية والرطوبة 100% 10% CO₂, 85% N % 5 س_{2، 2} .
3. في اليوم المقرر لحقن PN، إعداد أطباق الجنين التفريغ (1 طبق والجهات المانحة الهامستر) مع حكم-9 وتخزين جميع الأطباق في الحاضنة حتى الاستخدام.
4. Euthanize الهامستر سوبيروفولاتيد مع أول أكسيد الكربون₂.
5. عزل قناة
   1. ضع الهامستر الإناث يوثانيزيد في ريكومبينسي الظهرية في ثني الجراحية أو المناديل الورقية، وإعداد البطن مع رذاذ إيثانول 70%.
   2. بقوة عقد الجلد وطبقة العضلات البطن في خط الوسط وجعل شق. جداً الصفاق لفضح أعضاء البطن.
   3. فهم أحد ابواق الرحم مع ملقط ما يرام، وسحب الأنسجة من البطن. فصل الرحم من الأنسجة ميسوميتريوم والدهون. جعل قطع بين في قناة المبيض وقطع ثانية المجاورة لنقطة التقاء قناة والرحم (وتشمل جزءا صغيراً من الرحم). مسح أوفيدوكتس مكان الاثنين في نفس الطبق.
6. مسح وجمع زيجوتيس
   1. تحت مجهر التشريح، فهم الجانب من القرن الرحم مع ملقط دومون #5 وأدخل إبرة محلية صنع (الشكل 3) في التجويف قناة من نهاية إينفونديبولار ومسح قناة مع 300-400 ميليلتر من المتوسطة حكم-9.
   2. جمع زيجوتيس الفور وغسلها مرتين مع حكم-9 المتوسطة في صحن المناولة. في هذه المرحلة من التنمية، ينبغي تجريد جميعا زيجوتيس من خلايا الركام.
   3. مكان في zygotes في حاضنة (37.5 درجة مئوية، 10% CO₂، 5% O_2, 85% N₂ و 100% رطوبة) فورا بعد جمع لتقليل التعرض للضوء.

5-PN حقن

1. ذوبان الجليد رنب Cas9/سجرنا على الجليد والحفاظ على المجمع على الجليد أثناء عملية الحقن PN بأكملها.
2. تحميل إبر الحقن مع الحل رنب Cas9/سجرنا فورا قبل تجارب الحقن. ضع نهاية الجزء الخلفي من الحقن بالإبر في أنبوب يحتوي على الحل رنب Cas9/سجرنا ويسمح الحل رنب Cas9/سجرنا لشغل الإبرة بعمل شعري.
3. تحضير طبق الحقن والإبر. تعبئة ماصة حامل بالزيوت المعدنية إلى داخل ~ 3 مم خضوع الإبرة حامل. وضع الحامل في ميكروينجيكتور بطرف الإبرة الأفقي للجزء السفلي من الطبق وتعبئة غيض الإبرة بالمتوسطة بالشفط. تعيين إبرة حقن بزاوية 10-15 درجة مئوية مقابل حامل.
4. حقن PN
   1. تحديد اقحه وتطبيق شفط غرامة مع الإبرة حامل. ومن الناحية المثالية، يتم برونوكلي الذكور والإناث ضمن نفس نطاق التنسيق والتوازي تمت محاذاته إلى حامل.
   2. اختراق زونا و pronuclei الذكور (03:00 ص موقف) مع إبرة حقن.
   3. سحب إبرة حقن بسرعة بمجرد برونوكليوس تتضخم لمنع النواة من التمسك بالإبرة وتجنب الأضرار برونوكليوس.

6-زيجوتيس نقل إلى الهامستر بسيودوبريجنانت

1. تخدير بسيودوبريجنانت الهامستر (نفس الطريقة كما هو موضح في المقطع استئصال الاسهر أعلاه)، ووضع على ثني الجراحية أو جفاف المناديل الورقية في ريكومبينسي البطني.
2. تطبيق مواد التشحيم العين لعيون الحيوان لمنع جفاف العين وتغطية الرأس بقطعة قماش أو ورقة لحماية العينين من الضوء. إعداد الجانب الأفقي للجسم عن طريق حلق حول منطقة الجلد 4 × 4 سم على كل من جانبي الجسم متبوعاً بتطبيق 3 مرات يدعك بوفيدون ويدعك الإيثانول 70% 3 مرات. جعل شق عمودي 2 سم 2 سم والذيلية للضلع الأخير (كما هو موضح في الأرقام 4a, 4b) على كل جانب من الجزء الخلفي الحيوان.
3. فهم لوحة الدهون مع الملقط وسحب بلطف حتى قناة والرحم مرئية. المشبك لوح الدهون مع هيموستاتس وتعكس لوحة الدهون دورسالي على العمود الفقري (الشكل 4 ج). ضع المسالك التناسلية مثل أنه يمكن اختراق أنبوب الرحم بإبرة قياس 30 لنقل الأجنة (الشكل 4 د).
4. أغسل زيجوتيس حقن مع حكم-9 في صحن جديد. استخدام ماصة زجاجية جديدة (القطر: ~ 150-200 ميكرون) لتحميل زيجوتيس 10-15. ترتيب زيجوتيس كسلسلة من اللؤلؤ تليها عدة فقاعات الهواء. إدراج الماصة فتح الأنبوب اخترق من الخطوة 6.3 وضربه برفق في الماصة لنقل زيجوتيس إلى قناة. ما زالت تهب حتى يتم الإفراج عن أول فقاعة هواء في المسالك قناة (4e الشكل).
5. الإفراج عن لوحة الدهون وعودة الأنسجة في البطن. نقل العدد نفسه تقريبا (10-15) لحقن الأجنة إلى آخر قناة المسالك بنفس العمليات.
6. خياطة العضلات والجلد في الطبقات 2. إدارة البوبرينورفين-HCL (0.5 ملغ/كغ) تحت الجلد التسكين بعد العملية. عودة الهامستر إلى قفص ووضع القفص على منصة حارة للانتعاش. العودة من القفص إلى غرفة الحيوانات عند الحيوان هو تعافي تماما من التخدير. يتم إعطاء المسكنات بعد العملية مرة أخرى بعد ست ساعات.

النتائج

تتوقف فعالية البروتوكول هو موضح في إنتاج الهامستر المعدلة وراثيا على نتائج اثنين الخطوات الحاسمة التالية: معدل المواليد الإناث المستفيدة وعدد الجراء يعيش مع التعديلات الوراثية المقصود. معدل المواليد هو نتائج مباشرة لنوعية الجنين والمهارة للفرد أداء السندات الإذنية ال...

Discussion

أفضل استغلال إمكانات الهامستر السوري الذهبي كنماذج للأمراض البشرية، قمنا بتطوير بروتوكول حقن PN لإيصال كريسبر/Cas9 معقدة لاستهداف الجينوم الهامستر. بروتوكول الحقن PN يحسن عدة متغيرات رئيسية بما في ذلك الجنين الثقافة المتوسطة، ودرجة الحرارة، والاطوال الموجية ل الضوء¹³. وهناك أي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation