Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Резюме

Pronuclear (PN) инъекции кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и ТРИФОСФАТЫ связанные белком-9 нуклеиназы (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) системы является весьма эффективным методом для производства генетически Золотой сирийских хомяков. Здесь мы описываем подробный протокол PN инъекции для производства хомяков Нокаут гена с системой ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

Аннотация

Pronuclear Техника инъекции (PN) был впервые создан в мышей внести иностранные генетических материалов в pronuclei один клеточной стадии эмбриона. Введено генетический материал может интегрироваться в геноме эмбриональных и создания трансгенных животных с иностранными генетической информации, после передачи вводят эмбрионов для содействия матерям. После успеха в мышей PN инъекции успешно применяется в многих других видов животных. Недавно, PN инъекции успешно проработал представить реагентов с ген изменение видов деятельности, например ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, для достижения конкретных генетических модификаций в нескольких лабораторных и сельскохозяйственных животных. Наряду с овладением Специальный набор навыков микроинъекции производить генетически модифицированных животных путем инъекций PN, исследователи должны понимать воспроизводства физиологии и поведения целевых видов, потому что каждый вид представляет уникальный проблемы. Например, Золотой сирийского хомяка эмбрионы имеют уникальный обработки требований в пробирке , таким образом, что до последних открытий нашей группой PN инъекций методы были невозможны в этот вид. С нашей видов модифицированные PN инъекции протоколом нам удалось в производстве несколько Нокаут гена (KO) и knockin хомяков (KI), которые успешно используются для модели заболеваний человека. Здесь мы описываем процедуры инъекции PN для доставки комплекс Cas9 ТРИФОСФАТЫ зигот хомяка, эмбриона обработки условий, процедур передачи эмбриона, и животноводства, необходимых для производства генетически изменены хомяков.

Введение

Золотой сирийского хомяка (Mesocricetus auratus) является одним из наиболее широко используемых грызунов для биомедицинских исследований. По данным Департамента сельского хозяйства США около 100,000 хомяков были использованы в Соединенных Штатах в 2015 году, составляет 13% всего лабораторных животных использования среди видов, охватываемых Закон о благосостоянии животных (http://www.aphis.usda.gov; доступ 10 марта 2017).

Хомяк предлагает несколько преимуществ по сравнению с другими грызунами в изучении ряда заболеваний человека. К примеру гистопатология N-nitrosobis(2-oxopropyl) Амин (ПБ) индуцированной поджелудочной железы протоковой аденокарциномы в хомяка похож на человека опухоли поджелудочной железы, в то время как лечение ПБ главным образом вызывает опухоли щитовидной железы у крыс и легких и печени в ¹мышей. Потому что хомяков только небольшой грызун, найденных для поддержки репликации аденовирусы, они также являются модель выбора для тестирования на основе аденовирусной онколитического векторов и аденовирус анти наркотики^2,3,4. Другой пример, где хомяк модель предлагает преимущество над мышей и крыс находится в исследовании гиперлипидемии. Люди и хомяков выставки большое сходство в липидной метаболических и обоих видов нести ген кодирования передачи белка (ПООППО), Эстер cholesteryl, который играет центральную роль в липидной метаболизмом, а ПООППО отсутствует у мышей и крыс⁵. Кроме того хомяков развивать геморрагическая болезнь более представительным человеческого проявления после контакта с вирусом Эбола⁶. Хомяков также являются модели выбора для изучения атеросклероза⁷, устные карциномы⁸и⁹воспалительных миопатий. Недавно также было продемонстрировано что хомяков очень восприимчивы к инфекции вируса Анд и хантавирусный легочный синдром как заболевание, предоставляя только грызунов модель Анд вирусной инфекции¹⁰.

Для решения неудовлетворенная потребность Роман генетических животных моделей для изучения заболеваний человека, где нет надежной малых грызунов модель доступна, мы недавно добились успеха в применении системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 хомяк и дали несколько линий генетически инженерии хомяков¹¹. Хомяк зигот очень чувствительны к экологических средах, что протоколы инъекции PN, разработанных в других видов являются неподходящими. Таким образом мы разработали протокол PN инъекции для хомяка, который учитывает особые требования к обработке хомяка эмбрионов в пробирке. Здесь мы описываем подробные процедуры инъекции PN, с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы и сопутствующие шаги, от подготовки единого руководства РНК (sgRNA) для переноса эмбрионы вводят в получателей женщины.

протокол

Процедуры, описанные в настоящем протоколе были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) государственного университета штата Юта (протокол IACUC: 2484). Хомяков, используемые в настоящем Протоколе взрослых (6-10 недель возраста) LVG штамма Золотой сирийских хомяков. Все хомяки размещены в виварий на биоинновация центр, Университет штата Юта. Комнатной температуре устанавливается при 23 ° C и влажности установлен на уровне 40-50% света цикл 14L: 10D (свет: темный). Всякий раз, когда это возможно, эмбриона манипуляции и surugical процедуры должны быть выполнены с стерильной технологии.

1. sgRNA и Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) подготовка

1. Синтезировать sgRNAs после в vitro транскрипция процедуры, описанные в руководстве синтеза комплект (таблица материалов, дополнение 1).
2. Чтобы собрать ribonucleoproteins, смешать 2 мкг Cas9 с 1 мкг sgRNA и инкубировать смеси при комнатной температуре за 10-15 мин. Для PN инъекций сделайте рабочего раствора в концентрации 100 нг/мкл Cas9 и 50 нг/мкл sgRNA с буфером TE 10 мм (РНКазы бесплатно, Таблица материалов).

2. вазэктомии подготовка

Примечание: Вазэктомия выполняется на мужской хомяков в возрасте 6-8 недель. Операции должны быть выполнены 10-14 дней до первого спаривания. Стерильность подтверждается неудачных беременностей от скрещивания с плодородной самок. Вазэктомии мужчины обычно может использоваться для год, прежде чем они становятся менее сексуально активными.

1. Анестезировать мужчины впрыской внутрибрюшинного (и.п.) кетамина/Ксилазина доза-40 мг/кг (кетамин) и 10 мг/кг (Ксилазина). Подтвердите анестезии, отсутствие педали рефлекс (мыс сжатие).
2. Положите седативных хомяка в спинной recumbency на сухую салфетку. Промыть живота с трех раундов антисептические лечения путем чередования хирургические скраб решений между 70% спирта и повидон йода.
3. Сделайте вертикальный разрез с Ножницы хирургические, начиная с 1,5 см краниально к крайней плоти, расширяя 1 см с каждой стороны от середины линии (рис. 1a). Надрезать кожи, подкожной клетчатки и linea alba для доступа к перитонеального пространства (рис. 1b).
4. Приложите нежное давление на хвостовой аспект мошонки может заставить яичек и жировой ткани из. Возьмите семявыносящих аккуратно пинцетом и тщательно отдельный сосуд от СОСТС с второй набор щипцов (рис. 1 c).
5. Держите семявыносящих с щипцами в форме петли. Нагрейте кончик другой щипцами в пламени до тех пор, пока он горит красным, а затем использовать его для удаления цикла семявыносящих. Вставьте жировой ткани и яичках обратно в живот. Удаление семявыносящих на противоположной стороне с теми же процедурами.
6. Шовные мускулатура, впервые после ушивания кожи. Поместите животное на теплые площадку в клетке за 30 мин до тех пор, пока животное восстанавливает. Наблюдать за животное, до тех пор, пока он возобновляет нормальную деятельность.

3. доноров/получателей помощи Hamster подготовке расписание

1. Мониторинг и запись эстрального цикла.
   Примечание: Женский хомяков имеют стабильные 4-дневный эстральный цикл, который поддерживается сразу после родов. Самки в первый день эстрального может быть идентифицирован непрозрачный, желтоватые и липкие влагалища (рис. 2a). Самки на 4 день эстрального может быть идентифицирован прозрачный, липкой слизью (рис. 2b).
2. Для суперовуляции доноров хомяка, superovulate половозрелых самок (> 6 недель) в первый день эстрального цикла IP инъекции гонадотропина сыворотки беременных Маре (ГСЖК; растворяют в PBS как 50 МЕ/мл) (Таблица 1) между 9-12 утра.
   Примечание: ГСЖК предназначен для стимулирования суперовуляции, но не для эстральный цикл синхронизации.
3. 80 - 84 ч после инъекции ГСЖК (день 4, 6-8 вечера), место женщины в клетках с самцами для спаривания. Хомяк, который вязки не приводят к случке вилки, обеспечить успешные вязки, наблюдая вязки.
4. Подготовьте pseudopregnant самок, спаривания половозрелых самок на 4 день эстрального с вазэктомии мужчины. График подготовки женщины доноров и получателей приведены в таблице 2.
   Примечание: Правда беременных также может использоваться как получателей, то есть, самки с пальто цвета отличимые от Золотой цвет матовый с же цвет плодородные мужчин. Щенков, производные от эмбриона могут быть определены на основании пальто цвета. Потенциальное преимущество в использовании верно беременных самок, что эндогенно производимых эмбрионов обеспечит успешные беременности и помочь эмбрионы вводят PN имплантировать; потенциальным недостатком в использовании верно беременных женщин как получателей является, что эмбрионы вводят PN необходимость конкурировать с эндогенно производимых эмбрионов для имплантации.

4. зигота изоляции

1. Подготовка питательной среды (HECM-9; рецепт описан в дополнение 2), как описано ранее в Маккирнан и Bavister¹².
2. Один день до PN инъекции, подготовьте зиготы, обработка блюда (25 мкл/падение) и PN инъекции падение (100 мкл) в крышке 35 мм блюдо с HECM-9. Затем накройте среднего капель с минеральным маслом. Средний баланс в инкубаторе на ночь при следующих условиях: 37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ и влажности 100%.
3. В день, запланированных для PN инъекций подготовить эмбриона промывки блюда (1 блюдо/доноров хомячок) с HECM-9 и хранить все блюда в инкубаторе до использования.
4. Усыпить суперовулированных хомяков с CO₂.
5. Маточных труб изоляция
   1. Усыпленных женский хомяк в спинной recumbency на хирургические драпировка или папиросной бумаги и подготовить живота с спрей, этанол 70%.
   2. Твердо проводить кожи и мышц живота слоя на срединной и надрезают. Надрезать брюшины подвергать органов брюшной полости.
   3. Возьмите один из маточные рожки с тонкой щипцами и отозвать ткани от живота. Отдельно от mesometrium и жировой ткани матки. Сделайте разрез между маточных труб и яичников и второй сократить рядом с перекрестка маточных труб и матки (включают в себя небольшую часть матки). Место два яйцеводов в том же флеш блюдо.
6. Потолочные и собирать зигот
   1. Под микроскопом рассечение понять стороне рога матки с щипцами Дюмон #5 и вставьте просвета маточных труб от конца вороноковидными домашнее иглы (рис. 3) и промойте маточных труб с 300-400 мкл HECM-9 средних.
   2. Собирать зигот немедленно и мыть их дважды с HECM-9 средних в обработке блюдо. На этой стадии развития все зигот следует зачищенное от кучевые клеток.
   3. Место зигот в инкубатор (37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ и 100% влажность) сразу же после сбора для сведения к минимуму воздействия на свет.

5. PN инъекций

1. Оттепель RNP Cas9/sgRNA на льду и поддерживать комплекс на льду во время всего процесса впрыска PN.
2. Загрузите инъекций иглами с Cas9/sgRNA RNP раствора непосредственно перед инъекции экспериментов. Место задней части инъекций иглами в пробирку, содержащую решение RNP Cas9/sgRNA и позволяют RNP Cas9/sgRNA решение для заполнения иглы капиллярных действий.
3. Подготовьте инъекции блюдо и иглы. Заполните держатель пипетку с минеральным маслом для в течение ~ 3 мм загиба держателя иглы. Установите держатель в microinjector с кончика иглы горизонтальной нижней части блюдо и заполнить кончик иглы с среднего методом всасывания. Установите иглу на 10-15° угол противоположной держателя.
4. PN-инъекций
   1. Идентифицировать зиготы и применить штраф всасывания с держателя иглы. В идеале мужские и женские pronuclei находятся в пределах же диапазон фокусных расстояний и соответствие параллельно держатель.
   2. Проникать zona и мужской pronuclei (позиции 3 часа) с инъекционной иглы.
   3. Быстро снять иглу после пронуклеусами набухает для предотвращения ядро от присоединения к иглы и избежать повреждения пронуклеусами.

6. зигот передачи Pseudopregnant хомяков

1. Анестезировать pseudopregnant Хомяк (так же, как описано в разделе вазэктомии выше) и уложить его на хирургические драпировка или сухой оберточной бумаги в брюшную recumbency.
2. Применение смазки глаз глаза животного, чтобы предотвратить сухость глаз и головы с помощью ткани или бумаги, чтобы защитить глаза от света. Подготовьте боковой аспект тела, для бритья около 4 x 4 см участок кожи по бокам тела следуют применения 3 раза повидон йод скрабы и 3 раза 70% этанол скрабы. Сделать 2 см вертикальный разрез 2 см хвостового последнего ребра (как показано в цифры 4a, 4b) на каждой стороне задней части животного.
3. Возьмите жировой ткани с щипцами и осторожно потяните видны маточных труб и матки. Зажим жировой ткани с hemostats и отражают жировой ткани дорзально над позвоночника (рис. 4 c). Расположите репродуктивного тракта, таким образом, что маточные трубы могут быть проникли с 30 иглы для переноса эмбрионов (рис. 4 d).
4. Вымойте вводят зигот с HECM-9 в новое блюдо. Использование новой стеклянной пипетки (диаметр: ~ 150-200 мкм) для загрузки зигот 10-15. Организовать зигот как цепь жемчуг, последовали несколько пузырьков воздуха. Вставьте трубки на открытых вторглись шага 6.3 пипетки и осторожно дуть в пипетку для передачи зигот маточных труб. По-прежнему дует до тех пор, пока первый воздушный пузырь освобождается в урочище маточных труб (фигуры 4e).
5. Освободить жировой ткани и вернуть ткани в области живота. Передавать примерно такое же количество (10-15) вводят эмбрионов другой тракта маточных труб, те же процессы.
6. Шовные мускулатуры и кожи в 2 слоя. Администрировать подкожно бупренорфин-HCL (0,5 мг/кг) как послеоперационное обезболивание. Вернуться к клетке хомяка и поместить клетку на теплые площадку для восстановления. Возвращение клетки животных комнате, когда животное полностью оправился от анестезии. Послеоперационное анальгетиков даны снова в шесть часов спустя.

Результаты

Результаты следующих двух критических этапов зависит эффективность описанных протокола в производстве генетически модифицированных хомяков: коэффициент рождаемости получателей самок и количество живых детенышей с предполагаемых генетических модификаций. Коэффи?...

Обсуждение

Чтобы лучше использовать потенциал Золотой сирийских хомячков как модели болезней человека, мы разработали PN инъекции протокол для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 комплекс для хомячка генома. Протокол инъекции PN оптимизирует несколько ключевых переменных, включая эмбриона питательной среды,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation