הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

Summary

Pronuclear (PN) הזרקה של באשכולות באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR), מערכת CRISPR-הקשורים חלבון-9 נוקלאז (CRISPR/Cas9) היא שיטה יעילה במיוחד להפקת מהונדס גנטית אוגרים סוריים הזהב. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של הזרקת PN לייצור של אוגרים נוקאאוט גנטי עם מערכת CRISPR/Cas9.

Abstract

טכניקת ההזרקה (PN) pronuclear הוקם לראשונה בעכברים להציג חומרים גנטיים זרים לתוך pronuclei של שלב אחד-תא עוברי. החומר הגנטי הציג עשויים לשלב הגנום העוברי וצור הטרנסגניים חיות עם זרים מידע גנטי בעקבות העברת העוברים מוזרק לטפח אימהות. בעקבות ההצלחה בעכברים, הזרקת PN הוחל בהצלחה במינים בעלי חיים רבים אחרים. לאחרונה, הזרקת PN כבר בהצלחה מועסקים להציג ריאגנטים עם שינוי גנטי פעילויות, כגון מערכת CRISPR/Cas9, כדי להשיג שינויים בייעודי לאתר גנטית במעבדה מספר החווה מיני בעלי חיים. בנוסף מאסטרינג בערכה מיוחדת של מיומנויות microinjection כדי לייצר חיים מהונדסים בזריקה PN, חוקרים חייב להבין את הפיזיולוגיה של רבייה וההתנהגות של המין היעד, בגלל כל מיני מתנות ייחודיות אתגרים. לדוגמה, אוגר סורי זהוב עוברי יש ייחודי טיפול בדרישות במבחנה כזאת PN הזרקת טכניקות היו אפשריים במין זה עד פריצות דרך זה התבצעה על ידי הקבוצה שלנו. עם מינים-השתנה PN הזרקת הפרוטוקול שלנו הצלחנו לייצר מספר נוקאאוט גנטי (KO) ו knockin אוגרים (KI), אשר שימשו בהצלחה מודל מחלות אנושיות. כאן נתאר את הליך הזרקת PN מוסר את CRISPR/Cas9 מורכבים מופרות של האוגר, העובר טיפול בתנאים, נהלי ההעברה העובר ולאחר גידול הדרושה להפקת גנטית שונה אוגרים.

Introduction

האוגר הסורי הזהב (אם לדייק Mesocricetus) הוא אחד המכרסמים הנפוצה ביותר למחקר ביורפואי. על-פי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, כ-100,000 אוגרים שימשו בארצות הברית בשנת 2015, המייצג 13% השימוש בבעלי חיים המעבדה הכולל בין המינים מכוסה על ידי חוק רווחת בעלי חיים (http://www.aphis.usda.gov; לגשת מרץ 10, 2017).

האוגר מציע כמה יתרונות על פני מכרסמים אחרים במחקר של מספר מחלות אנושיות. לדוגמה, אדנוקרצינומה בלבלב histopathology של N-nitrosobis(2-oxopropyl) אמין (BOP) המושרה ductal ב אוגר דומה גידולים בלבלב האנושי, בעוד הטיפול בופ מעוררת בעיקר גידולי בלוטת התריס חולדות, ריאות, גידולים בכבד עכברים¹. בגלל אוגרים למכרסמים קטנים בלבד נמצאו כדי לתמוך את השכפול של adenoviruses, הם גם המודל של בחירה עבור בדיקות oncolytic המבוסס על אדנו וקטורים, אנטי-אדנו סמים-^2,-^3,-⁴. דוגמה נוספת שבה המודל אוגר מציע יתרון על עכברים וחולדות היא במחקר של היפרליפידמיה. אוגרים ובני להפגין קווי דמיון גדול בין משעולים חילוף החומרים של השומנים, בשני המינים הם נשאים של הגן קידוד cholesteryl אסתר העברה חלבון (CETP), אשר ממלא תפקיד מרכזי השומנים שיטות ההזנה, בעוד CETP הוא נעדר עכברים, חולדות⁵. בנוסף, אוגרים לפתח יותר נציג של הביטוי האנושי בעקבות חשיפה וירוס האבולה⁶hemorrhagic המחלה. אוגרים הם גם הדגמים של בחירה עבור הלומדים טרשת עורקים⁷, קרצינומות אוראלי⁸ו דלקתיים myopathies⁹. . לאחרונה, זה גם הוכח כי אוגרים הם רגישים מאוד זיהום בנגיף האנדים, לפתח מחלות כמו תסמונת ריאתי הנטא וירוס, מתן המודל מכרסמים רק Andes וירוס זיהום¹⁰.

כדי לענות על הצורך קיימים מודלים גנטי הרומן ללמוד את מחלות אנושיות איפה לא אמין דגם מכרסם קטן זמין, לאחרונה הצליחו החלה מערכת CRISPR/Cas9 על האוגר ואנו יצרו מספר שורות גנטית מתוכנן אוגרים¹¹. אוגר מופרות רגישים מאוד milieus סביבתי כזה כי הפרוטוקולים הזרקת PN פותח במינים אחרים מתאימים למחייה. לכן, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN עבור אוגר התואם את דרישות מיוחדות לטיפול אוגר העוברים בתוך חוץ גופית. כאן, אנו מתארים את ההליך הזרקת PN מפורט באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 והצעדים הנלווה, משלב הכנת מדריך בודד RNA (sgRNA) העברת העוברים מוזרק לתוך נקבות הנמען.

Protocol

בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת יוטה (פרוטוקול IACUC: 2484). אוגרים המשמשים פרוטוקול זה הם מבוגרים (מגיל 6-10 שבועות) LVG זן הזהב אוגרים סוריים. אוגרים כל מלון את ביבר במרכז Bioinnovation, אוניברסיטת מדינת יוטה. בטמפרטורת החדר מוגדר ב 23 ° C, לחות מוגדרת ב- 40-50%, ולכן מחזור אור מוגדר 14L: 10D (בהירה: כהה). במידת האפשר, שגרות מניפולציה ו- surugical העובר צריכה להתבצע עם טכניקות סטרילי.

1. sgRNA והכנות Ribonucleoproteins (RNP) Cas9/sgRNA

1. לסנתז sgRNAs ביצוע במבחנה שעתוק הפרוצדורות המתוארות במדריך של ערכת סינתזה (חומרים לטבלה, נספח 1).
2. להרכיב ribonucleoproteins, לערבב 2 µg של Cas9 עם µg 1 של sgRNA, דגירה המיקס בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות. להזרקה PN, הופך הפתרון עובד-הריכוז של 100 ng/µL Cas9 ו 50 ng/µL sgRNA עם 10 מ מ טה מאגר (RNase חינם, חומרים טבלה).

2. אופן ההכנה של עיקור

הערה: הניתוח מתבצע על אוגרים זכר רוב בגיל 6-8 שבועות. הניתוח צריך להתבצע 10-14 ימים לפני ההזדווגות הראשונה. עקרות אושר על ידי הריונות כושל מ להזדווג עם נקבות פורייה. עיקור זכרים ניתן בדרך כלל במשך שנה לפני שהם הופכים פעילים מינית פחות.

1. עזים ומתנגד זכרים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.) של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים מנה של 40 מ"ג/ק"ג (קטמין) ו- 10 מ"ג/ק"ג (חריגות השירותים הווטרינריים). לאשר הרדמה על ידי חוסר רפלקס פדלים (הבוהן צביטה).
2. נעוץ האוגר מסומם הגבי recumbency על נייר טישו יבש. יש לשטוף הבטן עם שלושה סבבי הטיפולים חיטוי, לסירוגין כירורגי לקרצף פתרונות בין 70% אלכוהול povidone יוד.
3. עושים חתך אנכי עם מספריים כירורגיים החל 1.5 ס מ הגולגולת כדי ערלה הארכת 1 ס מ מכל צד של קו אמצע (איור 1 א'). תחתכי את העור עורית, לינאה אלבה כדי לגשת אל החלל הצפק (איור 1b).
4. הפעילו לחץ עדין ההיבט סימטרית של שק האשכים כדי לאלץ את האשכים ואת רקמת השומן החוצה. לתפוס את צינור הזרע בעדינות עם מלקחיים, הפרד בזהירות את כלי הדם מן vas עם עוד זוג מלקחיים (איור 1 c).
5. להחזיק את צינור הזרע עם מלקחיים ליצירת לולאה. מחממים את קצה מלקחיים נוספת בלהבה עד שזה אדום ולאחר מכן להשתמש בו כדי להסיר את הלולאה של הזרע הזרע. הכנס רקמת שומן ועל האשכים אל הבטן. הסר את צינור הזרע על הצד היריב עם אותם הליכים.
6. תפר מערכת השרירים הראשון ואחריהם תפירת העור. במקום החיה על כרית חמה בכלוב במשך 30 דקות עד החיה יחלים. להתבונן החיה עד מהפעולה מפעילות רגילה.

3. תורם/נמען אוגר הכנת לוח זמנים

1. צג ולהקליט מחזורים estrous.
   הערה: אוגרים הנקבה יש 4 יציב-ימים של ייחום המתוחזק מיד לאחר parturition. ניתן לזהות נקבות ביום הראשון של estrous על ידי אטום, צהבהב, דביק הפרשות מהנרתיק (איור 2 א). נקבות ביום הרביעי של estrous ניתן לזהות באמצעות ריר שקוף, דביק (איור 2b).
2. עבור superovulation של התורם אוגר, superovulate הנקבות בגרו (> 6 שבועות) ביום הראשון של ייחום בזריקה ה-IP של גונדוטרופין סרום של סוסה הרה (PMSG; מומס ב- PBS כמו 50 IU/mL) (טבלה 1) בין 9-12 AM.
   הערה: PMSG הוא עבור גרימת superovulation אך לא עבור סינכרון-ייחום.
3. 80 - h 84 לאחר הזרקה של PMSG (היום 4, 6-8 PM), מקום הנקבות בכלובים עם הזכרים להזדווגות. כמו אוגר matings התוצאה אינה הזדווגות מחבר, ודא matings מוצלחת על-ידי צפייה של matings.
4. להכין נשים pseudopregnant על ידי הזדווגות הנקבות בגרו ביום הרביעי של estrous עם זכרים עיקור. לוח הזמנים של הכנת נקבות התורם וחתן מוצגות בטבלה מס ' 2.
   הערה: נקבות בהריון אמיתי יכול לשמש גם נמענים, קרי, נשים עם צבע הפרווה להבדיל בין צבע זהוב מעוצבת עם הזכרים פורה באותו צבע. הגורים נגזר השתלת ניתן לזהות המבוססת על צבעי סמל. יתרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי הוא עוברי endogenously המיוצר להבטיח הריונות מוצלחים ולעזור PN מוזרק עוברי להשתיל; חיסרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי כמו נמענים היא PN מוזרק עוברי צורך להתחרות עם endogenously המיוצר העוברים להשתלה.

4. זיגוטה בידוד

1. להכין תרבות בינוני (HECM-9; מתכון מתוארת תוספת 2), כפי שתואר לעיל McKiernan ו- Bavister¹².
2. יום אחד לפני זריקה PN, להכין זיגוטה טיפול מנות (µL 25/טיפה) ויש ירידה הזרקת PN (100 µL) במכסה של מאכל 35 מ מ עם HECM-9. לאחר מכן מכסים את הטיפות בינוני עם שמן מינרלי. שיווי משקל בינוני באינקובטור ללון בתנאים הבאים: 37.5 ° C, 10% CO₂, 85% N 5% או_{2, 2} , ו- 100% לחות.
3. יום המתוזמנת עבור הזרקה PN, להכין מאכלים שטיפה העובר (אוגר צלחת/תורם 1) עם HECM-9 ולאחסן כל המנות בחממה עד השימוש.
4. המתת חסד עם CO₂אוגרים superovulated.
5. בידוד oviduct
   1. הכנס אוגר נקבה לאללה recumbency הגבי מאסו כירורגי או ממחטת נייר ולהכין את הבטן עם תרסיס אתנול 70%.
   2. להחזיק העור, שכבת שריר הבטן בקו האמצע וביציבות בחתך. פצעים וחתכים של הצפק לחשוף את אברי הבטן.
   3. לאחוז באחד הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ומשכו את הרקמה מהבטן. להפריד בין הרחם לבין הרקמה mesometrium ושומן. לעשות חתך בין של oviduct ו השחלה ואת חתך השני סמוך לצומת של oviduct ואת הרחם (כולל חלק קטן של הרחם). מקם את שני oviducts בצלחת ריקון אותו.
6. להוריד ולאסוף מופרות
   1. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, תופס את הצד של קרן הרחם עם מלקחיים דומונט #5 להכניס מחט תוצרת בית (איור 3) לתוך לומן של oviduct אנד infundibular, לרוקן את oviduct עם 300-400 µL בינוני HECM-9.
   2. לאסוף את מופרות באופן מיידי ולשטוף אותם פעמיים עם HECM-9 במדיום הצלחת הטיפול. בשלב זה של התפתחות, כולן מופרות צריכה שברציונליות מתאי קומולוס.
   3. מקם את מופרות בתוך אינקובטור (37.5 ° C, 10% CO₂, 5% או_2, 85% N₂ ו- 100% לחות) מיד לאחר איסוף כדי למזער את החשיפה לאור.

5. PN הזרקה

1. להפשיר את RNP Cas9/sgRNA על הקרח ולשמור על המתחם על קרח במהלך התהליך הזרקת PN.
2. לטעון את המחטים הזרקת Cas9/sgRNA RNP פתרון מיד לפני הניסויים הזרקה. מניחים על חלקו האחורי של המחטים הזרקה לתוך הצינור המכיל את הפתרון Cas9/sgRNA RNP ולאפשר הפתרון RNP Cas9/sgRNA כדי למלא את המחט על ידי נימיות.
3. להכין את המנה הזרקת מחטים. למלא את פיפטה מחזיק שמן מינרלי כדי בתוך ~ 3 מ מ של העיקול של המחט למחזיק. למקם את המחזיק microinjector עם קצה המחט האופקי לתחתית של המנה ולמלא את קצה המחט בינונית ביניקה. הגדר את המחט זריקה בזווית של 10-15° מול בעל.
4. הזרקת PN
   1. לזהות זיגוטה ולהחיל יניקה בסדר עם המחט למחזיק. באופן אידיאלי, pronuclei זכר ונקבה הם בתוך אותו טווח מוקד, במקביל מיושר למחזיק.
   2. לחדור את zona ואת זכר pronuclei (בשעה 3 עמדה) עם מחט ההזרקה.
   3. תיסוג המחט הזרקת במהירות ברגע pronucleus מתנפח כדי למנוע את הגרעין של הקפדה על המחט, כדי למנוע נזק של pronucleus.

6. מופרות להעביר אוגרים Pseudopregnant

1. עזים ומתנגד אוגר pseudopregnant (באותה דרך בה המתוארות בסעיף הניתוח לעיל), תניח אותם על מאסו כירורגי או נייר טישו יבש recumbency הגחון.
2. חומרי סיכה העין חלות על העיניים של החיה כדי למנוע יובש בעין, לכסות את הראש עם בד או נייר כדי להגן על העיניים מפני אור. הכן את הפן הלטראלי של הגוף על ידי גילוח שטח העור 4 ס"מ על 4 ס"מ על כל הצדדים של הגוף ולאחר מכן על-ידי החלת 3 פעמים של פי 3 70% אתנול קרצוף והחלוקים povidone יוד. לבצע חתך אנכי 2 ס מ 2 ס מ סימטרית הצלע האחרונה (כפי שמוצג דמויות 4a, 4b) בכל צד של החלק האחורי של החיה.
3. משטח שמן עם מלקחיים ומשוך בעדינות עד oviduct של הרחם גלויים. תהדק את משטח שמן עם. טוב ומשקפים את משטח שמן dorsally מעל עמוד השדרה (איור 4 c). מקם את באיברי הרבייה כזה יכול להיות שחדר הצינור הרחם עם מחט מד 30 להעברת העובר (איור 4 d).
4. לשטוף את מופרות מוזרק עם HECM-9 בתבשיל חדש. להשתמש על פיפטה מזכוכית חדש (קוטר: ~ 150-200 מיקרומטר) כדי לטעון מופרות 10-15. לארגן את מופרות כשרשרת פנינים ואחריו מספר בועות אוויר. להוסיף על פיפטה לתוך הצינור אף פתוח משלב 6.3, נשוף בעדינות לתוך פיפטה כדי להעביר את מופרות oviduct. המשיכו לנשוף עד בועת האוויר הראשון הוא שוחרר לתוך מערכת oviduct (איור 4e).
5. לשחרר את משטח שמן ולחזור הרקמה אל הבטן. העברה בקירוב אותו מספר (10-15) של העוברים מוזרק עוד בדרכי oviduct על ידי התהליכים.
6. תפר את מערכת השרירים והעור ב 2 שכבות. לנהל הבופרנורפין-HCL (0.5 מ ג/ק ג) subcutaneously כמו נגד כאבים לאחר הניתוח. לחזור האוגר בכלוב ולמקם את הכלוב על משטח חם להתאוששות. להחזיר את הכלוב לחדר בעלי חיים כאשר החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. משככי כאבים לאחר הניתוח מקבלים שוב כעבור 6 שעות.

תוצאות

היעילות של הפרוטוקול המתואר בהפקת אוגרים מהונדסים תלוי התוצאות של שני קריטי בשלבים הבאים: live הילודה של נקבות הנמענים ואת מספר הגורים בשידור חי עם השינויים הגנטי המיועד. קצב הילודה live הוא של תוצאות ישירות של איכות העובר את המיומנות של הפרט מבצע את הזרקת PN העובר נהלי ההעבר?...

Discussion

כדאי לנצל את הפוטנציאל של אוגרים סוריים הזהב כמודלים של מחלות אנושיות, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN להעברת של CRISPR/Cas9 מורכבים כדי למקד את הגנום אוגר. פרוטוקול הזרקת PN מיטוב מספר משתני מפתח לרבות העובר תרבות בינוני, טמפרטורה, אורכי גל של אור¹³. ישנם גם מספר הליכים ספציפיים אוגר לטיפול ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation