Üretim CRISPR/Cas9 kompleks Pronuclear enjeksiyonla genetiği altın Suriye hamster

Özet

Pronuclear (PN) iğne kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced ve CRISPR ilişkili protein-9 nükleaz (CRISPR/Cas9) sistemi genetiği altın Suriye hamster üretmek için son derece verimli bir yöntemdir. Burada, biz gene nakavt hamster CRISPR/Cas9 sistemi ile üretim için detaylı PN enjeksiyon Protokolü tanımlamak.

Özet

Pronuclear (PN) iğne tekniği ilk yabancı genetik malzeme tek hücreli sahne embriyo pronuclei tanıtmak farelerde kurulmuştur. Tanıtılan genetik materyal embriyonik genom entegre ve Transjenik hayvanlar anneler beslemek için enjekte embriyo transferi sonrasında yabancı genetik bilgileri ile oluşturmak. Farelerde başarı, PN enjeksiyon içinde pek çok hayvan türü başarıyla uygulandı. Son zamanlarda, PN enjeksiyon başarıyla reaktifler gen değiştirme ile tanıtmak için olan istihdam faaliyetleri, çeşitli laboratuvar olarak siteye özgü genetik değişiklikleri elde ve çiftlik hayvan türleri için CRISPR/Cas9 sistemi gibi. Çünkü her tür benzersiz sunar mikroenjeksiyon becerileri genetiği değiştirilmiş hayvanlar PN enjeksiyonu ile üretmek için özel set mastering ek olarak, araştırmacılar üreme fizyolojisi ve hedef türler davranışını anlamak gerekir zorluklar. Örneğin, altın Suriye hamster embriyo benzersiz var PN enjeksiyon teknikleri grubumuz tarafından son devrimler kadar bu tür mümkün değildi öyle ki gereksinimleri vitro işleme. Bizim türler-modified PN enjeksiyon protokolü ile biz ve birkaç gen nakavt (KO) üreten başarılı modeli insan hastalıkları için kullanılan (KI) hamster knockin başardı. Burada CRISPR/Cas9 karmaşık hamster, embriyo işleme koşulları, embriyo transferi yordamlar zigotları teslim PN enjeksiyon yordamı açıklamak ve genetik olarak üretmek için gerekli yetiştiriciliği hamster değiştirilebilir.

Giriş

Altın Suriye hamster (Mesocricetus hava) biyomedikal araştırmalar için en çok kullanılan kemirgenler biridir. ABD Tarım Bakanlığı göre yaklaşık 100.000 hamster hayvan refah kanun (http://www.aphis.usda.gov; erişilen kapsamına türler arasında toplam laboratuvar hayvan kullanımı % 13'ü temsil eden 2015 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde kullanıldı 10 Şubat 2017).

Hamster insan hastalıkların bir dizi çalışmanın diğer kemirgen birkaç avantaj sunar. Örneğin, N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) ile indüklenen histopatoloji pankreas duktal Adenokanserine hamster insan pankreas tümörü, benzer BOP tedavi esas olarak tiroid bezi tümörleri fareler ve akciğer ve karaciğer tümörleri sebep olur ise Fareler¹. Hamster adenovirüse bakın çoğaltma desteklemek için buldum sadece küçük kemirgen olduğundan, onlar da adenovirus tabanlı oncolytic Vektörler ve anti-adenovirus uyuşturucu^2,3,4test etmek için seçim modeli vardır. Neyin hamster model fare ve sıçanlar üzerinde bir avantaj sağlar başka bir hiperlipidemi çalışmada örnektir. İnsanlar ve hamster lipid metabolik yollar büyük benzerlikler sergiler ve her iki tür İngilizce ise metabolizmaları, farelerde yok ve⁵sıçanlar lipid içinde merkezi bir rol oynayan Kolesteril ester transfer proteini (İngilizce), kodlama gen taşırlar. Ayrıca, hamster Hemorajik hastalığı daha fazla maruz kalma Ebola virüs⁶takip insan tezahürü temsilcisi geliştirmek. Hamster da ateroskleroz⁷, sözlü karsinomlar⁸ve inflamatuar myopathies⁹çalışmak için seçim modelleri vardır. Son zamanlarda, bu da hamster Andes virüs enfeksiyonu için son derece duyarlı ve hantavirus pulmoner sendromu gibi hastalığı, Andes virüs enfeksiyonu¹⁰sadece kemirgen model sağlar geliştirmek kanıtlanmıştır.

Biz son zamanlarda hamster için CRISPR/Cas9 sistem uygulama başarmış ve birkaç satırlık genetik olarak üretilen güvenilir küçük kemirgen model kullanılabilir olduğu insan hastalıkları eğitim roman genetik hayvan modelleri .ilgi görme ihtiyacına yönelik olarak, hamster¹¹mühendislik. Öyle ki diğer türler içinde geliştirilen PN enjeksiyon protokolleri uygun olmayan hamster zigotları için çevre ni son derece duyarlıdır. Bu nedenle, biz bir PN enjeksiyon protokol hamster embriyo içinde vitroişleme için özel gereksinimleri karşılar hamster için geliştirilmiştir. Burada, CRISPR/Cas9 sistemi ve beraberindeki adımlardan tek Kılavuzu RNA (sgRNA) enjekte embriyo transferi alıcı kadın içine hazırlanması kullanarak ayrıntılı PN enjeksiyon yordamı açıklar.

Protokol

Bu protokol için açıklanan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Utah State University tarafından kabul edildi (IACUC Protokolü: 2484). Bu protokol için kullanılan hamster are yetişkin (6-10 hafta-in yaş) LVG altın Suriye hamster süzün. Tüm hamster Bioinnovation Merkezi, Utah State University vivaryum yerleştirilmiştir. Oda Sıcaklık 23 ° C'de ayarla, nem oranı % 40-50 ayarlanır ve ışık-siklet ayarlanır 14L: 10D (ışık: karanlık). Mümkün olduğunda, embriyo manipülasyon ve surugical yordamları steril teknikleri ile yapılmalıdır.

1. sgRNA ve Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) hazırlık

1. Sentez seti (malzemeler tablo, özel sayı: 1) kılavuzda açıklandığı vitro transkripsiyon prosedürleri takip sgRNAs sentez.
2. Ribonucleoproteins bir araya getirmek için Cas9 2 µg sgRNA 1 µg ile karıştırın ve mix 10-15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. PN enjeksiyon için çalışan bir çözüm 100 ng/µL Cas9 ve 50 ng/µL sgRNA 10 mM TE arabelleği (RNase free, Malzemeler tablo) ile konsantrasyon yaptırın.

2. vazektomi hazırlık

Not: 6-8 haftalık erkek hamster kısırlaştırma ameliyatı gerçekleştirilir. Ameliyat 10-14 gün ilk çiftleşme öncesinde yapılmalıdır. Kısırlık kimden verimli dişilerle çiftleşme başarısız gebelik tarafından onaylanır. Vasectomized erkek normalde onlar daha az cinsel açıdan aktif hale gelmeden önce bir yıl boyunca kullanılabilir.

1. Erkekler bir doz 40 mg/kg (ketamin) ve 10 mg/kg (xylazine) ketamin/xylazine, mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi pedal refleks (ayak tutam) eksikliği onaylayın.
2. Uyuşturulmuş hamster dorsal recumbency kuru bir doku kağıt üzerinde yatıyordu. Durulama karın antiseptik tedavi cerrahi alternatif tarafından üç tur ile fırçalayın çözümleri arasında % 70 alkol ve povidone-iyot.
3. Cerrahi makas 1,5 cm 1 cm her tarafına uzanan orta satırından (Şekil 1a) sünnet derisi kafatası başlayan ile dikey kesi yapmak. Cilt, Cilt altı doku ve linea deşmek alba Periton boşluğu (Şekil 1b) erişmek için.
4. Testis testis ve yağ dokusu dışarı zorlamak için Kaudal durumuyla hafif basınç uygulayın. Vas deferens yavaşça Forseps ile kavramak ve dikkatle vas gelen kan damarı forseps (şekil 1 c) ikinci bir dizi ile ayırın.
5. Vas deferens Forseps ile bir döngü oluşturmak için basılı tutun. Kırmızı olana alev başka bir forseps ucu ısı ve sonra vaz deferens döngü kaldırmak için kullanabilirsiniz. Yağ dokusu ve testis karın için geri takın. Aynı işlemleri ile karşı taraftaki vas deferens kaldırın.
6. İlk deri dikiş tarafından takip kas dikiş. Hayvan normale dönene kadar hayvan 30 min için bir kafes içinde bir sıcak yastık yerleştirin. Normal aktiviteye devam eder kadar hayvan gözlemlemek.

3. donör/alıcı Hamster hazırlık programı

1. Monitör ve kayıt estrous döngüleri.
   Not: Kadın hamster hemen doğum sonra tutulan bir istikrarlı 4-days estrous döngüsü vardır. Kadın ilk gününde estrous opak, sarımsı ve yapışkan vajinal akıntı tarafından (şekil 2a) tespit edilebilir. Dişilerini gün 4'te estrous şeffaf, yapışkan mukus (şekil 2b) tarafından tespit edilebilir.
2. Cinsel Olgun kadın için ovumun donör hamster superovulate (> 6 hafta) hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG; 50 IU/mL olarak içinde çözünmüş PBS), IP enjeksiyonla estrous döngüsünün ilk günü (Tablo 1) 9-12 AM arasında.
   Not: PMSG ovumun inducing için ama estrous döngüsü eşitleme için değil.
3. 80 - 84 h PMSG (gün 4, 6-8 PM), enjeksiyon sonra koyun kadın erkek kafeslerde çiftleşme için. Matings birleşme içinde neden hamster takılan, başarılı matings matings izleyerek garanti.
4. Pseudopregnant kadın vasectomized erkekler estrous gün 4'te cinsel Olgun kadın çiftleşme tarafından hazırlayın. Donör ve alıcı kadın hazırlanması için zaman çizelgesi Tablo 2' de gösterilmiştir.
   Not: Gerçek hamile dişiler de kullanılabilir olarak alıcılar, Yani, kadın ayırt aynı renk verimli erkek ile keçeleşmiş altın renkten bir ceket renk ile. Embriyo transferi türetilmiş pups kat renkleri dayalı tespit edilebilir. Gerçek hamile kadın kullanarak potansiyel bir avantaj endogenously üretilen embriyolar başarılı gebelik sağlamak ve implant enjekte PN embriyo yardımcı olduğunu; gerçek hamile kadın alıcılar kullanarak bir potansiyel endogenously ile rekabet için enjekte PN embriyo gerekir embriyo implantasyonu için üretilen dezavantajıdır.

4. zigot yalıtım

1. Kültür ortamı hazırlamak (HECM-9; tarifi ek 2'de açıklanan), McKiernan ve Bavister¹²' daha önce açıklandığı gibi.
2. PN enjeksiyon önce bir gün yemekleri (25 µL/damla) ve HECM-9 ile bir 35 mm çanak kapağı bir PN enjeksiyon damla (100 µL) işleme zigot hazırlayın. Sonra orta damla mineral yağ ile kapağı. Denge orta bir kuluçka gecede aşağıdaki koşullar altında: 37,5 ° C, % 10 CO₂, %5 O_2, %85 N₂ ve %100 nem.
3. PN enjeksiyon için zamanlanan gün, embriyo reçeteye göre sarf yemekleri (1 çanak/donör hamster) HECM-9 ile hazırlamak ve bütün yemekleri kullanmak kadar da kuluçka makinesine saklamak.
4. CO₂superovulated hamster ötenazi.
5. Ovidukt yalıtım
   1. Euthanized kadın hamster dorsal recumbency bir cerrahi örtüsü veya doku kağıt yerleştirin ve karın % 70 etanol sprey ile hazırlayın.
   2. Sıkıca cilt ve karın kas katmanı orta hat sık ve kesik. Karın organları ortaya çıkarmak için karın zarını deşmek.
   3. Rahim boynuzları biri iyi bir Forseps ile kavramak ve karın dokudan geri çek. Rahim mesometrium ve Yağ dokusundan ayırmak. Bir kesim ovidukt ve yumurtalık ve ikinci bir kesim arasında (rahim küçük bir parçası dahil) ovidukt ve rahim bitişik olun. İki oviducts aynı floş çanak yerleştirin.
6. Temizleme ve zigotları toplamak
   1. Diseksiyon mikroskop altında rahim boynuz tarafında #5 Dumont Forseps ile kavramak ve infundibular sonundan itibaren ovidukt Lümen ev yapımı iğne (şekil 3) yerleştirin ve ovidukt 300-400 µL HECM-9 orta ile yıkayın.
   2. Hemen zigotları toplar ve onları iki kez HECM-9 orta işleme tabak içinde yıkayın. Gelişme bu aşamada, tüm zigotları kümülüs hücreleri yalanlarım.
   3. Zigotları hemen toplandıktan sonra gün ışığına maruz kalma en aza indirmek için bir kuluçka (37,5 ° C, % 10 CO₂, %5 O_2, %85 N₂ ve % 100 nem) yerleştirin.

5. PN enjeksiyon

1. Cas9/sgRNA RNP buz çözme ve buz üzerinde karmaşık tüm PN enjeksiyon işlemi sırasında korumak.
2. Cas9/sgRNA RNP çözüm hemen önce enjeksiyon deneyler enjeksiyon iğnelerle yükleyin. Cas9/sgRNA RNP solüsyon içeren tüp içine enjeksiyon iğneler arka sonuna yerleştirin ve iğne kılcal eylem tarafından doldurmak Cas9/sgRNA RNP çözüm sağlar.
3. İğne ve enjeksiyon yemek hazırlamak. Tutucu pipet için mineral yağ tutucu iğne nın ~ 3 mm içinde ile doldurun. İğne ucu ile microinjector içinde yer tutucu çanak altına yatay ve iğne ucu ile orta emme tarafından doldurun. Enjeksiyon iğne tutucu ters bir 10-15 ° açıyla ayarlayın.
4. PN enjeksiyon
   1. Bir zigot tanımlamak ve tutucu iğne ile iyi bir emici uygulamak. İdeal olarak, erkek ve dişi pronuclei aynı odak mesafesi ve sahibi için hizalanmış paralel bir uzaklıktadır.
   2. Zona ve erkek pronuclei (saat 3 pozisyon) enjeksiyon iğnesiyle nüfuz.
   3. Enjeksiyon iğne iğne için kalarak çekirdeği engellemek ve pronucleus zarar görmemesi için pronucleus şişer bir kez hızlı bir şekilde geri alıyorum.

6. zigotları Transfer Pseudopregnant hamster için

1. Bir pseudopregnant hamster (aynı şekilde vazektomi bölümünde açıklandığı gibi) anestezi ve ventral recumbency bir cerrahi örtüsü veya kuru doku kağıt üzerinde yatıyordu.
2. Göz kuruluğu önlemek ve başından bir bez veya kağıt ışıktan gözleri korumak için kapak hayvan gözünde göz Yağlama maddeleri uygulanır. Tıraş tarafından vücut yanal yönünü hazırlamak bir yaklaşık 4 cm x 4 cm cilt alan povidone-iyot scrubs ve 3 kez % 70 etanol scrubs 3 kez uygulayarak takip vücudun her tarafında. 2 cm dikey kesi 2 cm Kaudal son kaburga ( rakamlar 4a, 4bgösterildiği gibi) her hayvanın arka tarafında olun.
3. Yağ yastığı Forseps ile kavramak ve ovidukt ve rahim görünür hale gelene kadar yavaşça çekin. Bir hemostats ile yağ yastığı Klamp ve yağ yastığı dorsally (şekil 4 c) omurga yansıtır. Öyle ki rahim tüp embriyo transferi (şekil 4 d) için 30 gauge iğne ile nüfuz üreme sistemi getirin.
4. HECM-9 yeni bir tabak ile enjekte zigotları yıkayın. Yeni bir cam pipet kullanın (çapı: ~ 150-200 µm) 10-15 zigotları yüklemek için. Bir zincir inci birkaç hava kabarcıkları tarafından takip olarak zigotları düzenleyin. Adım 6.3 açık nüfuz tüpünden pipet yerleştirin ve nazikçe zigotları ovidukt için aktarmak için pipet içine darbe. İlk hava kabarcığı ovidukt yolu (şekil 4e) serbest bırakılıncaya kadar üfleme devam edin.
5. Serbest yağ yastığı ve doku karında dönün. Yaklaşık aynı numara (10-15) enjekte embriyoların başka bir ovidukt sistemi için aynı işlemler tarafından aktarın.
6. Kas ve 2 kat deride dikiş. Buprenorfin-HCL (0.5 mg/kg) subkutan ameliyat sonrası analjezi yönetmek. Hamster için bir kafes dönmek ve kurtarma için sıcak bir yastık üzerinde kafes yerleştirin. Hayvanın anesteziden tamamen iyileşti sonra kafes hayvan odasına dönün. Ameliyat sonrası ağrı daha altı saat sonra verilir.

Sonuçlar

Genetiği değiştirilmiş hamster üreten açıklanan protokolünün etkinliği aşağıdaki iki kritik adımı sonuçları üzerinde bağlıdır: canlı doğum oranı alıcı kadın ve amaçlanan genetik değişiklikler ile canlı yavru sayısı. Canlı doğum embriyo kalitesi doğrudan sonuçlarını ve PN enjeksiyon ve embriyo transferi işlemleri gerçekleştirme bireysel beceri oranıdır. İşlenmiş embriyoların gelişim potansiyelini atılmamasını emin olmak için büyük bir ...

Tartışmalar

Daha iyi altın Suriye hamster insan hastalık modelleri olarak potansiyeli için geliştirdiğimiz bir CRISPR/hamster genom hedeflemek için Cas9 karmaşık teslim etmeye yönelik bir PN enjeksiyon protokolü. PN enjeksiyon Protokolü birçok anahtar değişken embriyo kültürü orta, sıcaklık ve dalga boylarında ışık¹³de dahil olmak üzere en iyi duruma getirir. Ayrıca gen hamster hedefleme başarıyla yürütmek için izlemeniz gereken birkaç hayvan hamster özel işleme yordamlarını...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation