CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

요약

클러스터의 pronuclear (PN) 주입은 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced 그리고 CRISPR 관련 단백질-9 nuclease (CRISPR/Cas9) 시스템은 생산 하는 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터는 매우 효율적인 방법. 여기, 우리는 유전자 녹아웃 햄스터 CRISPR/Cas9 시스템의 생산에 대 한 자세한 PN 주입 프로토콜을 설명합니다.

초록

Pronuclear (PN) 주입 기술 1 셀 단계 배아의 pronuclei로 외국 유전 물질을 소개 하는 마우스에 처음 설립 되었다. 소개 유전 물질 배아 게놈으로 통합 하 고 외국 유전 정보 전송 주입된 태아의 어머니를 육성 하기 위해 유전자 변형 동물 생성 수 있습니다. 마우스에 성공, PN 주입 성공적으로 많은 다른 동물 종에 적용 되었습니다. 최근, PN 주입은 성공적으로 고용 되었다 유전자-수정 된 시 약을 소개 활동, 여러 실험실에서 사이트별 유전 수정 하 고 동물 농장을 CRISPR/Cas9 시스템 등. 마스터링 PN 주입 하 여 유전자 변형된 동물을 생산 하기 위해 microinjection 능력의 특별 한 세트, 뿐만 아니라 연구원 이해 해야 한다 재생산 생리학 및 동작의 대상 종 각 종족 고유 때문에 도전입니다. 예를 들어 시리아 황금 햄스터 배아는 독특한 PN 주입 기술을 우리의 그룹에 의해 최근 혁신까지이 종에 불가능 했다 그런 생체 외에서 요구 사항 처리. 우리의 종 수정 PN 주입 프로토콜, 우리는 여러 유전자 녹아웃 (KO)를 생성 하 고 모델 인간의 질병을 성공적으로 사용 되었습니다 (기) 햄스터를 쫓 고에 성공 했다. 여기 우리 햄스터, 배아 처리 조건, 배아 전송 절차, zygotes에 CRISPR/Cas9 복잡 한을 제공 하기 위한 PN 주입 절차를 설명 하 고 농업 유전자를 생산 하는 데 필요한 수정 햄스터.

서문

골든 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus) 생물 의학 연구에 대 한 가장 널리 사용 되는 설치류 중 하나입니다. 농업의 미 교육부에 따르면 약 100000 햄스터 동물 복지 행위 (http://www.aphis.usda.gov; 액세스에 의해 보호 종 중 총 실험 동물 사용의 13%, 2015 년에는 미국에서 사용 되었다 3 월 10 일, 2017).

햄스터는 다양 한 인간 질병의 연구에 다른 설치류에 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어 햄스터에서 유도 된 N-nitrosobis(2-oxopropyl) 아민 (밥)의 histopathology 췌 장 ductal adenocarcinomas 비슷합니다 인간의 췌 장 종양, 밥 처리는 주로 쥐와 폐에서 갑 상선 종양, 간 종양에 유도 하는 동안 마우스¹. 햄스터는 작은 설치류 adenoviruses의 복제를 지원 하기 위해 발견, 때문에 그들은 또한 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 벡터 및 안티 아 데 노 바이러스 약^2,,34테스트를 위한 선택의 모델. 혈의 연구에 햄스터 모델 쥐 및 쥐에 비해 우위를 제공 하는 점에서 또 다른 예가입니다. 인간과 햄스터 지질 대사 경로에 큰 유사성을 전시 하 고 두 종 인코딩 cholesteryl 에스테 르 이동 단백질 (CETP), 지질 물질 대사, CETP는 쥐에 결 석 하 고⁵쥐에 중심 역할을 담당 하는 유전자. 또한, 햄스터 출혈 질병 더 에볼라 바이러스⁶에 노출 다음 인간 형상의 대표적인 개발. 햄스터 아 테 롬⁷, 구두 carcinomas⁸및 선 동적인 myopathies⁹공부에 대 한 선택의 모델도 있습니다. 최근에, 그것은 또한 증명 되었습니다 햄스터 안데스 바이러스 감염에 매우 취약 하 고 hantavirus 폐 증후군 같은 질병, 안데스 바이러스 감염¹⁰만 설치류 모델을 개발.

신뢰할 수 없는 작은 설치류 모델을 사용할 수 있는 인간의 질병을 연구 소설 유전 동물 모델에 대 한 unmet 필요를 해결 하기 위해 우리가 최근에 햄스터에 CRISPR/Cas9 시스템 적용에 및 유전자 여러 줄의 생산 햄스터¹¹설계. 햄스터 zygotes는 환경 milieus에 매우 민감한 같은 다른 종에서 개발 된 PN 주입 프로토콜 적합 하지 않습니다. 따라서, 우리는 햄스터 햄스터 배아 시험관을 처리 하기 위한 특별 한 요구를 수용 하는 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템 및 받는 사람 여성에 주입 된 배아의 전송에 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 준비에서 동반 단계를 사용 하 여 자세한 PN 주입 절차를 설명 합니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 유타 주립 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC 프로토콜: 2484). 이 프로토콜에서 사용 하는 햄스터는 성인 (나이의 6-10 주) LVG 스트레인 시리아 황금 햄스터. 모든 햄스터 Bioinnovation 센터, 유타 주립 대학에서 물고기에서 지 내게 됩니다. 실내 온도 23 ° C에서 설정, 습도 40-50%에서 설정 되 고 가벼운 주기 설정 14 L: 10 (빛: 어둠). 가능 하다 면, 살 균 기술로 배아 조작 및 surugical 절차를 수행 합니다.

1. sgRNA 및 Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) 준비

1. SgRNAs 절차에 따라 체 외에 전사 (자료 테이블, 보충 1) 합성 키트 설명서에 설명 된 음성 합성.
2. Ribonucleoproteins 조립, 1 µ g의 sgRNA와 Cas9의 2 µ g을 혼합 하 고 10-15 분 동안 실내 온도에 믹스를 품 어. PN 주입, 100 ng / µ L Cas9, 50 ng / µ L sgRNA 10 m m 테 버퍼 (RNase 무료, 자료 테이블)의 농도에서 작업 솔루션을 확인 합니다.

2. 정 관 수술 준비

참고: 정 관 수술은 나이의 6-8 주에 남성 햄스터에 수행 됩니다. 수술 10-14 일 첫 짝짓기 앞서 수행 되어야 한다. 불 임은 비옥한 여성 짝짓기에서 실패 한 임신에 의해 확인 된다. Vasectomized 남성 일반적으로 성적으로 덜 활성화 되기 전에 1 년 동안 사용할 수 있습니다.

1. 40 mg/kg (마 취 제)와 (xylazine) 10 mg/kg의 복용량과 케 타 민/xylazine의 복 (i.p.) 주입 하 여 남성을 anesthetize. 페달 반사 (발가락 핀치)의 부족으로 마 취를 확인 합니다.
2. 마른 티슈 페이퍼에 지 recumbency에 sedated 햄스터를 하다. 린스 수술 대체 하 여 살 균 처리의 3 라운드와 복 부 사이 70% 알코올과 povidone-요오드 솔루션 스크럽.
3. 1.5 c m 중간 선 (그림 1a)에서 각 측에 1 cm를 확장 하는 포에 두개골을 시작 하는 수술가 위 수직 절 개를 확인 합니다. 피부, 피하 조직, 그리고 교육 incise 알바 복 막 공간 (그림 1b)에 액세스할 수.
4. 고환 및 지방 조직 밖으로 강제로 음 낭의 꼬리 부분에 부드러운 압력을 적용. 집게와 vas deferens를 부드럽게 잡고 하 고 신중 하 게 집게 (그림 1c)의 두 번째 세트로 중이 야에서 혈관을 분리.
5. 루프를 형성 하는 집게와 vas deferens를 잡으십시오. 그것은 빨간색 때까지 불꽃에 다른 집게의 끝을 열 고 vas deferens의 루프를 제거 하려면 그것을 사용 하 여. 지방 조직과 고환 다시 복 부에 삽입 합니다. 동일한 절차를 반대 하는 사이드에 vas deferens를 제거 합니다.
6. 먼저 피부를 봉합 뒤 근육 봉합 동물 복구 될 때까지 30 분 대 한 장에 따뜻한 패드에 동물을 놓습니다. 정상적인 활동을 다시 시작 될 때까지 동물을 관찰 합니다.

3. 기증/받는 햄스터 준비 일정

1. 모니터 및 기록 estrous 사이클입니다.
   참고: 여성 햄스터 출산 직후 유지 되는 안정적인 4 일 estrous 주기 있다. Estrous의 첫날에 여성, 노란 고 스티커 질 출력 (그림 2a)에 의해 식별할 수 있습니다. Estrous의 여성을 4 일에는 투명 하 고, 끈적끈적한 점액 (그림 2b)에 의해 식별할 수 있습니다.
2. 기증자 햄스터의 superovulation에 대 한 성적으로 성숙한 여성 superovulate (> 6 주) 임신 암 말의 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG; 50 IU/mL로에 녹아 PBS)의 IP 주입 estrous 사이클의 첫 번째 날에 (표 1) 9-12 분 사이.
   참고: PMSG는 유도 하는 superovulation에 대 한 하지만 estrous 주기 동기화.
3. 80-PMSG (4 일, 오후 6-8)의 주입 후 84 h 짝짓기 남성과 감 금 소에 여성을 놓습니다. 햄스터 matings 결합을 초래 하지 않는 플러그는 matings를 보고 하 여 성공적인 matings 확인 해야 합니다.
4. Pseudopregnant 여성 vasectomized 남성 estrous의 4 일에 성적으로 성숙한 암컷 짝짓기에 의해 준비. 기증자와 받는 여성을 준비 하기 위한 시간 일정은 표 2에 표시 됩니다.
   참고: 사실 임신 여성 또한 받는 사람, 즉, 여성 코트 색상 같은 색상 비옥한 남성과 헝 클 어진 황금 색깔 구별로 사용할 수 있습니다. 배아 전송에서 파생 된 강아지 코트 색상에 따라 확인할 수 있습니다. 사실 임신 여성을 사용 하 여 잠재적인 이점은 이다 endogenously 생산된 배아는 성공적인 임신을 확인 하 고 주입 PN 배아 이식; 하는 데 도움이 받는 사람으로 진정한 임신 여성을 사용 하 여 잠재적인 단점은 PN 주입 태아 필요가 endogenously 경쟁할 배아 이식에 대 한 생산.

4. 접합 자 격리

1. 문화 매체를 준비 (HECM-9; 보충 2에서 제조 법을 설명 하는), 앞에서 설명한 McKiernan 및 Bavister¹².
2. PN 주입에 앞서 1 일 접합 자 요리 (25 µ L/드롭)와 HECM 9 35 mm 접시의 뚜껑에 PN 주입 드롭 (100 µ L) 처리를 준비 합니다. 다음 커버 미네랄 오일 중간 상품. 다음과 같은 조건에서 하룻밤 인큐베이터에서 균형 매체: 37.5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ 와 100% 습도.
3. PN 주입 예정 당일, HECM 9 배아 내뿜는 요리 (1 접시/기증자 햄스터)를 준비 하 고 인큐베이터에서 사용까지 모든 요리를 저장.
4. CO₂superovulated 햄스터 안락사
5. 수 란 관 절연
   1. 외과 용 드 레이프 또는 휴지 등 recumbency에서 안락사 여성 햄스터를 놓고 70% 에탄올 스프레이 함께 복 부를 준비 합니다.
   2. 단단히 피부와 복 부 근육 층은 중간에 고 절 개. 복 부 장기 노출 복 incise
   3. 좋은 집게와 자 궁 뿔 중 하나를 파악 하 고 복 부에서 조직 철회. Mesometrium 및 지방 조직에서 자 궁을 구분 합니다. 수 란 관, 자 궁 (자 궁의 작은 부분을 포함)의 교차점에 인접 한은 수 란 관 및 난소와 두 번째 컷 컷을 확인 합니다. 두 oviducts 같은 플러시 접시에 놓습니다.
6. 플러시 및 zygotes 수집
   1. 해 부 현미경 아래 #5 Dumont 집게와 자 궁 경적의 측면을 잡고 고 infundibular 끝에서 수 란 관의 루멘으로 수 제 바늘 (그림 3)를 삽입 하 고 300-400 µ L HECM 9 매체의와 수 란 관을 플러시.
   2. zygotes를 즉시 수집 하 고 처리 접시에 HECM 9 매체와 두 번 그들을 씻어. 개발의이 단계에서 모두는 zygotes의 적 운 세포에서 걸치기 한다.
   3. 빛에 노출을 최소화 하기 위해 컬렉션 직후에 zygotes 인큐베이터 (37.5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ 와 100% 습도)에 놓습니다.

5. PN 주입

1. Cas9/sgRNA RNP 얼음에 녹여 고 전체 PN 주입 과정 동안 얼음에 복잡 한을 유지 합니다.
2. 주입 바늘 주입 실험 직전 Cas9/sgRNA RNP 솔루션을 로드 합니다. Cas9/sgRNA RNP 솔루션이 포함 된 튜브에 주입 바늘의 끝부분을 놓고 모 세관 작용에 의해 바늘을 채우기 위해 Cas9/sgRNA RNP 솔루션을 허용 합니다.
3. 주입 접시와 바늘을 준비 합니다. 홀더 바늘의 굴곡의 ~ 3 mm 이내에 미네랄 오일에 홀더 피펫으로를 채우십시오. 접시의 바닥에 수평 놓고 홀더는 바늘의 팁과 microinjector에서 흡입에 의해 매체와 바늘의 팁을 작성 합니다. 홀더 반대는 10-15 ° 각도로 주사 바늘을 설정 합니다.
4. PN 주입
   1. zygote를 식별 하 고 잘 흡입 홀더 바늘으로 적용. 이상적으로, 남성과 여성의 pronuclei 같은 초점 범위와 홀더를 정렬된 병렬 있습니다.
   2. 주사 바늘으로 구역 및 남성 pronuclei (3 시 위치)를 침투.
   3. 일단 바늘에 고착에서 핵을 방지 하 고는 pronucleus 손상을 방지 하는 pronucleus 부 주사 바늘을 신속 하 게 철회.

6. zygotes Pseudopregnant 햄스터를 전송

1. (같은 방법으로 정 관 위의 섹션에 설명 된) pseudopregnant 햄스터를 anesthetize 하 고 recumbency 복 부에 수술 드 레이프 또는 건조 티슈 페이퍼에 누워.
2. 눈 건조를 방지 하 고 천이나 종이 빛 으로부터 눈을 보호 하기 위해 머리를 커버 하는 동물의 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 면도 하 여 신체의 측면 측면을 준비는 몸 povidone-요오드 스크럽 및 3 번 70% 에탄올 스크럽의 3 배를 적용 하 여 다음의 각 측면에 약 4 cm x 4 cm 피부 지역. 게 2 cm 수직 절 개를 2 cm 꼬리 마지막 갈비뼈 ( 그림 4a, 4b에서 같이)는 동물의 뒷면의 각 측에.
3. 집게와 지방 패드를 잡고 고 수 란 관 및 자 궁 표시 될 때까지 부드럽게 당겨. 클램프는 hemostats와 지방 패드 하 고 반영 지방 패드 dorsally 척추 (그림 4c). 자 궁 관 배아 전송 (그림 4 d)에 대 한 30 게이지 바늘으로 관통 될 수 있다 그런 재생산 지역 위치.
4. HECM-9 새로운 접시에 주입된 zygotes 워시. 새로운 유리 피 펫을 사용 하 여 (직경: 150 ~ 200 µ m)를 10-15 zygotes 로드. 뒤에 여러 개의 공기 방울 진주의 사슬으로는 zygotes를 정렬 합니다. 피펫으로 단계 6.3에서에서 오픈 관통된 관으로 삽입 하 고 가볍게는 수 란 관에 zygotes 전송 피 펫에 불어. 부는 첫 번째 공기 방울이 수 란 관으로 (그림 4e)으로 될 때까지 계속 합니다.
5. 지방 패드를 분리 하 고 복 부 조직을 반환 합니다. 동일한 프로세스에서 다른 수 란 관으로 주입 된 배아의 약 동일한 번호 (10-15) 전송.
6. 근육과 2 층에 피부를 봉합. 수술 후 무 통으로 피하 Buprenorphine HCL (0.5 mg/kg)를 관리할 수 있습니다. 햄스터 감 금 소를 반환 하 고 복구에 대 한 따뜻한 패드에 케이지를 놓습니다. 동물 마 취에서 완전히 복구 되 면 동물 방에 감 금 소를 반환 합니다. 수술 후 진통제는 다시 6 시간 후 부여 됩니다.

결과

다음 두 가지 중요 한 단계의 결과에 따라 유전자 변형된 햄스터를 생성에서 설명한 프로토콜의 효율성: 받는 사람 성과 의도 유전 수정 라이브 새끼 수의 라이브 출생 률. 출산 율은 배아 품질의 직접적인 결과 및 PN 사출 고 배아 전송 절차를 수행 하는 개인의 기술. 조작된 배아의 발달 잠재력 손상 되지 보장 하기 위해, 큰 관심은 햄스터 배아의 시험관에서 처리 ?...

토론

더 나은 인간 질병의 모델로 시리아 황금 햄스터의 잠재력을 악용, 우리는 CRISPR/Cas9 복잡 한 햄스터 게놈을 대상으로 제공 하기 위한 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. PN 주입 프로토콜 배아 배양, 온도 및 빛¹³의 파장을 포함 하 여 몇 가지 주요 변수를 최적화 합니다. 또한 성공적으로 햄스터에 유전자를 대상으로 실시 하기 위한 따라야 하는 여러 햄스터 관련 동물 처리 절차가 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 μg/μL (~6.1 μM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation