Produção de geneticamente modificados Hamsters sírios dourados por injeção pró-nuclear do complexo CRISPR/Cas9

Resumo

Pró-nuclear injeção (PN) do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) e sistema CRISPR-associada da proteína-9 nuclease (CRISPR/Cas9) é um método altamente eficiente para produzir hamster sírio dourado geneticamente modificado. Aqui, descrevemos o protocolo de injeção PN detalhado para a produção de hamsters de gene nocaute com o sistema CRISPR/Cas9.

Resumo

A técnica de injeção pró-nuclear (PN) foi criada em ratos para introduzir materiais genéticos estranhos os pró-núcleos do estágio de uma célula. O material genético introduzido pode integrar o genoma embrionário e gerar animais transgénicos com informação genética externa após transferência dos embriões injetados para fomentar as mães. Após o sucesso em camundongos, injeção de PN tem sido aplicada com sucesso em muitas outras espécies animais. Recentemente, injeção de PN tem sido empregada com sucesso para introduzir os reagentes com gene-modificando atividades, tais como o sistema CRISPR/Cas9, para alcançar as modificações genéticas site-specific em laboratório vários e espécies de animais da fazenda. Além de dominar o conjunto especial de habilidades de microinjeção de produzir animais geneticamente modificados pela injeção de PN, pesquisadores devem entender a fisiologia da reprodução e comportamento das espécies-alvo, porque cada espécie apresenta exclusivo desafios. Por exemplo, o hamster sírio dourado embriões têm únicas exigências em vitro de manipulação tal que PN injeção técnicas não foram possíveis nesta espécie até recentes descobertas pelo nosso grupo. Com nosso protocolo de injeção PN espécies modificadas, conseguimos produzir vários nocaute do gene (KO) e batendo os hamsters (KI), que têm sido utilizados com sucesso para doenças humanas de modelo. Aqui descrevemos o procedimento de injeção de PN para entregar o complexo CRISPR/Cas9 zigotos do hamster, condições de manipulação do embrião, os procedimentos de transferência de embriões, e pecuária necessária para produzir geneticamente modificado os hamsters.

Introdução

O hamster sírio dourado (Mesocricetus auratus) é um dos roedores mais amplamente utilizados para a investigação biomédica. De acordo com o departamento de agricultura dos EUA, aproximadamente 100.000 hamsters foram utilizados nos Estados Unidos em 2015, que representam 13% do uso de animais de laboratório total entre as espécies abrangidas pelo acto de bem-estar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acessado 10 de março de 2017).

O hamster oferece diversas vantagens sobre outros roedores no estudo de uma série de doenças humanas. Por exemplo, as adenocarcinomas ductal pancreático de histopatologia de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) induzida em hamster é semelhante à humanos tumores pancreáticos, enquanto BOP tratamento principalmente induz tumores da glândula tireoide em ratos e pulmão e tumores no fígado em os ratos¹. Porque os hamsters são o apenas pequeno roedor encontrado para suportar a replicação de adenovírus, eles também são o modelo de escolha para testes baseados em adenovírus Oncolíticos vetores e drogas antiadenovírus^2,3,4. Outro exemplo no qual o modelo de hamster oferece uma vantagem sobre ratos e ratos é no estudo de hiperlipidemia. Os seres humanos e hamsters apresentam grandes semelhanças nas vias metabólicas de lipídios e ambas as espécies carregam o gene que codifica o colesterol éster proteína de transferência (CETP), que desempenha um papel central em lipídios, metabolismo, enquanto CETP é ausente em camundongos e ratos⁵. Além disso, os hamsters desenvolvem doença hemorrágica mais representativa da manifestação humana após exposição a vírus de Ebola⁶. Os hamsters são também os modelos de escolha para o estudo da aterosclerose⁷, carcinomas oral⁸e miopatias inflamatórias⁹. Recentemente, também demonstrou que os hamsters são altamente suscetíveis a infecção pelo vírus Andes e desenvolvem a doença, como síndrome pulmonar hantavírus, fornecendo o modelo apenas roedor de Andes vírus infecção¹⁰.

Para resolver a necessidade não atendida de novos modelos animais genéticas estudar as doenças humanas onde nenhum modelo de roedor pequeno confiável está disponível, nós recentemente conseguido aplicando o sistema CRISPR/Cas9 para o hamster e produziram várias linhas de geneticamente os hamsters engenharia¹¹. Zigotos de hamster são altamente sensíveis a www.UniEthos.org.br ambiental tal que os protocolos de injeção PN desenvolvidos em outras espécies são inadequados. Portanto, nós desenvolvemos um protocolo de injeção de PN para o hamster que acomoda os requisitos especiais para a manipulação de embriões de hamster em vitro. Aqui, descrevemos o procedimento de injeção de PN detalhado utilizando o sistema CRISPR/Cas9 e as etapas de acompanhamento, desde a preparação do único guia de RNA (sgRNA) para a transferência de embriões injetados em fêmeas de destinatário.

Protocolo

Os procedimentos descritos no presente protocolo foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade do estado de Utah (protocolo IACUC: 2484). Os hamsters utilizados neste protocolo são adultos (6-10 semanas de idade) LVG Coe hamster sírio dourado. Todos os hamsters são alojados no viveiro no centro Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente encontra-se a 23 ° C, umidade é fixada em 40-50% e ciclo de luz está situado 14:00 (luz: escuro). Sempre que possível, os procedimentos de manipulação e surugical do embrião devem ser realizados com técnicas estéreis.

1. sgRNA e preparação de ribonucleoproteínas (RNP) Cas9/sgRNA

1. Sintetiza sgRNAs seguindo os procedimentos da transcrição em vitro descritos no manual do kit de síntese (tabela de materiais, suplemento 1).
2. Para montar ribonucleoproteínas, misture 2 µ g de Cas9 com 1 µ g de sgRNA e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10-15 min. Para injeção de PN, fazer uma solução de trabalho na concentração de 100 ng / µ l Cas9 e sgRNA de 50 ng / µ l com 10 mM de tampão TE (RNase livre, Tabela de materiais).

2. vasectomia preparação

Nota: Vasectomia é realizada em hamsters masculinos em 6-8 semanas de idade. A cirurgia deve ser realizada 10-14 dias antes do primeiro acasalamento. Esterilidade é confirmada por gravidezes falhadas de acasalamento com as fêmeas férteis. Vasectomizado machos normalmente podem ser usados por um ano antes que se tornem menos sexualmente ativos.

1. Anestesia os machos por injeção intraperitoneal (i.p.) de xilazina/cetamina com uma dose de 40 mg/kg (cetamina) e 10 mg/kg (xilazina). Confirme a anestesia por falta de um pedal reflex (pitada de dedo do pé).
2. Estabeleça o hamster sedado prostração dorsal no papel de tecido seco. Enxágue o abdômen com três rodadas de tratamentos anti-séptico, alternando cirúrgico esfrega soluções entre 70% álcool e iodo-povidona.
3. Faça uma incisão vertical com tesoura cirúrgica começando 1,5 cm cranial ao prepúcio estendendo de 1 cm de cada lado da linha média (Figura 1a). Faça uma incisão da pele, tecido subcutâneo e linea alba para acessar o espaço peritoneal (Figura 1b).
4. Aplique uma pressão suave ao aspecto caudal do escroto para forçar os testículos e tecido adiposo para fora. Agarre os canais deferentes suavemente com fórceps e cuidadosamente separe o vaso sanguíneo do SAV com um segundo conjunto de pinças (Figura 1C).
5. Segure o canal deferente com fórceps para formar um laço. Aqueça a ponta do outro fórceps em chamas até o vermelho e então usá-lo para remover o loop dos canais deferentes. Introduza o tecido adiposo e testículos de volta para o abdômen. Remova o canal deferente no lado oposto com os mesmos procedimentos.
6. Sutura da musculatura primeiro seguida de sutura da pele. Coloque o animal em uma almofada quente em uma gaiola por 30 min até que o animal se recupere. Observe o animal até ele reinicia a atividade normal.

3. doador/beneficiário Hamster preparação cronograma

1. Monitorar e gravar ciclos estrais.
   Nota: Hamsters fêmeas têm um ciclo estral estável 4 dias é mantido imediatamente após o parto. As fêmeas no primeiro dia de estral podem ser identificadas pela descarga vaginal opaca, amarelada e pegajosa (Figura 2a). As fêmeas no dia 4 de estral podem ser identificadas pelo muco pegajoso, transparente (Figura 2b).
2. Para superovulação de hamster doador, superovulate as fêmeas sexualmente maduras (> 6 semanas) no primeiro dia do ciclo estral por injeção de IP de gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG; dissolvido em PBS como 50 UI/mL) (tabela 1) entre 9-12 AM.
   Nota: PMSG é para indução de superovulação, mas não para a sincronização do ciclo estral.
3. 80 - 84 h após a injeção de PMSG (dia 4, 6-8 PM), colocar as fêmeas em gaiolas com machos para acasalamento. Como plugues do hamster acasalamentos não resultam em cópula, garantir sucesso acasalamentos observando os acasalamentos.
4. Prepare pseudopregnant fêmeas por fêmeas sexualmente maduras no dia 4 de estral com machos vasectomizados de acasalamento. O calendário para a preparação de fêmeas do dador e do receptor são mostrados na tabela 2.
   Nota: As fêmeas grávidas de verdadeiras também podem ser usadas como destinatários, isto é, as fêmeas com uma casaco cor distingue a cor dourada emaranhada com os machos férteis de cor mesmo. Filhotes derivados de transferência de embriões podem ser identificados com base nas cores do brasão. Uma potencial vantagem em usar o verdadeiras fêmeas grávidas é que embriões produzidos endogenamente iria garantir gravidez bem sucedida e ajudar embriões PN injetado para implante; uma desvantagem potencial na utilização de fêmeas grávidas de verdadeiras como destinatários é que necessidade de embriões PN injetado para competir com endogenamente produzido embriões para implantação.

4. zigoto isolamento

1. Preparar o meio de cultura (HECM-9; receita é descrita no suplemento 2), conforme descrito anteriormente na McKiernan e Bavister¹².
2. Um dia antes da injeção de PN, prepare o zigoto manusear pratos (25 µ l/gota) e uma gota de injeção de PN (100 µ l) na tampa de um prato de 35mm com HECM-9. Em seguida, cubra as gotas médias com óleo mineral. Médio de equilíbrio na incubadora durante a noite nas seguintes condições: 37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ e 100% de umidade.
3. No dia agendado para a injeção de PN, preparar pratos-lavagem do embrião (1 hamster de prato/doador) com HECM-9 e armazenar todos os pratos na incubadora até o uso.
4. Eutanásia em hamsters superovulados com CO₂.
5. Isolamento do oviduto
   1. Coloque um hamster fêmea euthanized em prostração dorsal em um pano cirúrgico ou lenços de papel e preparar o abdômen com um spray de etanol 70%.
   2. Firmemente pele e camada muscular abdominal na linha e fazer uma incisão. Faça uma incisão do peritônio para expor os órgãos abdominais.
   3. Segure um dos cornos uterinos com uma pinça fina e retirar o tecido do abdômen. Separe o útero o tecido mesometrium e gordura. Fazer um corte entre o oviduto e ovário e um segundo corte adjacente à junção do oviduto e útero (incluem uma pequena parte do útero). Coloque os dois ovidutos na mesma lavar prato.
6. Liberar e recolher zigotos
   1. Sob o microscópio de dissecação, segure o lado do corno uterino com uma pinça de Dumont #5 e inserir uma agulha caseira (Figura 3) o lúmen do oviduto da extremidade infundibular e irrigue o oviduto com 300-400 µ l de meio HECM-9.
   2. Recolher os zigotos imediatamente e lave duas vezes com HECM-9 médio no prato de manipulação. Nesta fase de desenvolvimento, todos os zigotos devem ser desmatados de células do cumulus.
   3. Coloque os zigotos na incubadora (37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ e 100% de umidade) imediatamente após a colheita para minimizar a exposição à luz.

5. PN injeção

1. Descongelar o RNP Cas9/sgRNA no gelo e manter o complexo no gelo durante todo o processo de injeção de PN.
2. Carrega as agulhas de injeção com solução Cas9/sgRNA RNP imediatamente antes dos experimentos de injeção. Coloque a extremidade traseira da agulha de injeção no tubo que contém a solução de Cas9/sgRNA RNP e permitir que a solução da RNP Cas9/sgRNA preencher a agulha por ação capilar.
3. Prepare o prato de injeção e agulhas. Encha a pipeta de titular com óleo mineral para dentro ~ 3 mm da curva da agulha titular. Coloque o suporte no microinjector com a ponta da agulha horizontal no fundo do prato e encha a ponta da agulha com meio por sucção. Defina a agulha de injeção em um ângulo de 10-15° oposto ao titular.
4. Injeção de PN
   1. Identificar um zigoto e aplicar uma sucção bem com a agulha de titular. Idealmente, os pronúcleos masculinos e femininos estão dentro da mesma gama focal e alinhado paralelamente ao titular.
   2. Penetra a zona e pró-núcleos masculinos (posição 03:00) com a agulha de injeção.
   3. Retire a agulha de injeção rapidamente, uma vez que o pronucleus incha para impedir que o núcleo aderindo na agulha e para não danificar a pronucleus.

6. zigotos transferência para Hamsters Pseudopregnant

1. Anestesiar um hamster pseudopregnant (da mesma maneira que o descrito na seção vasectomia acima) e coloque-o em um pano cirúrgico ou papel tecido seco em prostração ventral.
2. Aplica lubrificantes de olho nos olhos do animal para evitar ressecamento do olho e cubra a cabeça com um pano ou papel para proteger os olhos da luz. Preparar o aspecto lateral do corpo cortando uma área de pele sobre 4 x 4 cm em cada lado do corpo seguiu aplicando 3 vezes de iodo-povidona esfrega e esfrega de etanol 70% 3 vezes. Fazer uma incisão vertical de 2 cm 2 cm caudal à última costela (como mostrado nas figuras 4a, 4b) em cada lado da parte traseira do animal.
3. Segure a almofada de gordura com a pinça e puxe suavemente até o oviduto e útero são visíveis. Fixar a almofada de gordura com um hemostatos e refletem a gordura almofada dorsalmente ao longo da coluna vertebral (Figura 4C). Posicione o trato reprodutivo, tal que a tuba uterina pode ser penetrada com uma agulha de 30 calibre para transferência de embriões (Figura 4D).
4. Lave os zigotos injetados com HECM-9 em um prato novo. Usar uma pipeta de vidro novo (diâmetro: ~ 150-200 µm) para carregar zigotos de 10-15. Organize os zigotos como uma corrente de pérolas seguido por várias bolhas de ar. Colocar a pipeta no tubo aberto penetrado da etapa 6.3 e soprar suavemente para a pipeta para transferir os zigotos para o oviduto. Continue soprando até a primeira bolha de ar é liberada para o trato do oviduto (Figura 4e).
5. Liberar a almofada de gordura e retornar o tecido no abdômen. Transferi aproximadamente o mesmo número (10-15) de embriões injetados para outro trato do oviduto pelos mesmos processos.
6. Suture a musculatura e a pele em 2 camadas. Administre a buprenorfina-HCL (0,5 mg/kg) por via subcutânea como analgesia pós-operatória. Voltar o hamster numa gaiola e coloque a gaiola em uma almofada quente para recuperação. Retorne a gaiola ao quarto animal quando o animal está totalmente recuperado da anestesia. Analgésicos no pós-operatório são dadas novamente seis horas mais tarde.

Resultados

A eficiência do protocolo descrito em produzir os hamsters geneticamente modificados depende dos resultados das etapas a seguir duas críticas: a taxa de natalidade live de fêmeas destinatários e o número de filhotes vivos com as modificações genéticas pretendidas. A taxa de natalidade live é um resultado direto da qualidade do embrião e a habilidade do indivíduo realizar a injeção de PN e procedimentos de transferência de embrião. Para garantir que o potencial do desenvolvi...

Discussão

Para melhor explorar o potencial de hamsters sírios dourados como modelos de doenças humanas, desenvolvemos um protocolo de injeção de PN para entregar um CRISPR/Cas9 complexo para direcionar o genoma de hamster. O protocolo de injeção PN otimiza diversas variáveis chaves, incluindo o meio de cultura de embrião, temperatura e comprimentos de onda de luz¹³. Existem também vários procedimentos de manipulação de animais específicos do hamster que precisam seguir para a realização com ?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation