Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9

Zusammenfassung

Man (PN) Injektion von den gruppierten dazwischen regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierten Protein-9 Nuklease (CRISPR/Cas9) System ist ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter syrischen Goldhamster. Hier beschreiben wir die detaillierte PN Injektion Protokoll zur Herstellung von gen-Knockout-Hamster mit dem CRISPR/Cas9-System.

Zusammenfassung

Die man (PN) Injektionstechnik entstand zuerst bei Mäusen, fremden genetischen Materials in die Vorkerne von einzelligen Embryonen einzuführen. Die eingebrachte genetische Material kann das embryonale Genom integrieren und transgene Tiere zu erzeugen, mit fremden genetischen Information nach der Übertragung der injizierten Embryonen um Mütter zu fördern. Nach dem Erfolg bei Mäusen hat PN Injektion erfolgreich bei vielen anderen Tierarten angewendet. Vor kurzem, PN Injektion erfolgreich eingesetzte Reagenzien mit gen-modifizierende einzuführen Aktivitäten wie das CRISPR/Cas9 System, ortsspezifische Genveränderungen in mehreren Labors und Tierarten auf dem Bauernhof. Neben der Beherrschung der Sonderserie der Mikroinjektion Fähigkeiten genetisch veränderter Tiere per PN Injektion zu produzieren, müssen Forscher die Reproduktion Physiologie und das Verhalten der Zielarten, verstehen, weil jede Art einzigartig präsentiert Herausforderungen. Z. B. syrischen Goldhamster Embryonen haben einzigartige Anforderungen in-vitro- Handhabung, so dass PN Injektionstechniken bis neue Durchbrüche von unserer Fraktion nicht möglich in dieser Art waren. Mit unserer Spezies modifiziert PN Injektion Protokoll ist es uns gelungen in der Produktion mehrere gen Knockout (KO) und Profi (KI) Hamster, die zu Modell menschlicher Krankheiten erfolgreich eingesetzt werden. Hier beschreiben wir die PN-Injektion für die Zustellung der CRISPR/Cas9-Komplex an die Zygoten der Hamster, der Embryo Handhabung, Embryo-Transfer-Verfahren und Tierhaltung müssen genetisch geändert Hamster.

Einleitung

Die syrischen Goldhamster (Mesocricetus Auratus) ist eines der am weitesten verbreitete Nagetiere für die biomedizinische Forschung. Nach dem US Department of Agriculture wurden ungefähr 100.000 Hamster in den Vereinigten Staaten im Jahr 2015, was 13 % der gesamten Labor tierische Nutzung unter dem Tierschutzgesetz (Http://www.aphis.usda.gov; zugegriffen fallenden Arten verwendet. 10. März 2017).

Der Hamster bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Nagetieren in der Studie eine Reihe von Krankheiten beim Menschen. Zum Beispiel die Histopathologie von N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) induzierte pankreatischen duktalen Adenokarzinome in Hamster ähnelt menschlichen Tumoren der Bauchspeicheldrüse, während BOP Behandlung vor allem Schilddrüse Tumoren bei Ratten und Lunge und Tumoren in der Leber induziert Mäuse-¹. Da Hamster das nur kleine Nagetier gefunden, um die Replikation von Adenoviren unterstützen, sind sie auch das Modell der Wahl zu Testzwecken onkolytische Adenoviren-basierte Vektoren und Anti-Adenovirus Drogen^2,3,4. Ein weiteres Beispiel, wobei das Hamster-Modell einen Vorteil gegenüber Mäusen und Ratten bietet, ist in der Studie von Hyperlipidämie. Menschen und Hamster weisen große Ähnlichkeiten in Lipid Stoffwechselwege und beide Arten tragen das Gen Kodierung Cholesteryl Ester-Transfer-Protein (CETP), das spielt eine zentrale Rolle in Lipid, Stoffwechsel, während CETP ist abwesend bei Mäusen und Ratten⁵. Darüber hinaus entwickeln Hamster repräsentativer für die menschliche Manifestation nach Exposition gegenüber Ebola-Virus⁶Hämorrhagische Krankheit. Hamster sind auch die Modelle der Wahl für Atherosklerose⁷, orale Karzinome⁸und entzündliche Myopathien⁹zu studieren. Vor kurzem wurde auch nachgewiesen, dass Hamster sehr anfällig für Virus-Infektion Anden sind und Hantavirus-Syndrom-ähnliche Lungenerkrankung, die nur Nagetier Modell der Anden Virus Infektion¹⁰zu entwickeln.

Bewältigung der ungedeckten Bedarf für neuartige genetische Tiermodellen, die Krankheiten des Menschen zu studieren, wo keine zuverlässige kleines Nagetier-Modell zur Verfügung steht, die wir vor kurzem gelungen, das CRISPR/Cas9 System anwenden, um den Hamster und haben mehrere Linien der gentechnisch hergestellt Hamster-¹¹entwickelt. Hamster Zygoten reagieren empfindlich auf ökologischen Milieus, so dass die PN Injektion Protokolle entwickelt, bei anderen Spezies nicht geeignet sind. Daher entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Hamster, der die speziellen Anforderungen für den Umgang mit Hamster Embryonen in Vitrobeherbergt. Hier beschreiben wir die detaillierte PN-Injektion mit der CRISPR/Cas9-System und die dazugehörigen Schritte, von der Vorbereitung der einzelnen Führer RNA (SgRNA) zum Transfer von Embryonen injiziert in Empfänger Weibchen.

Protokoll

In diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Utah State University (IACUC Protokoll: 2484). Hamster in diesem Protokoll verwendeten sind Erwachsene (6-10 Wochen alt) LVG belasten syrischen Goldhamster. Alle Hamster sind in das Vivarium im Bioinnovation Center, Utah State University untergebracht. Raumtemperatur bei 23 ° C, Luftfeuchtigkeit bei 40-50 % eingestellt ist, und Licht-Zyklus ist festgelegt 14:00 (Licht: dunkel). Wann immer möglich, sollte Embryo Manipulation und Surugical Verfahren mit sterile Techniken durchgeführt werden.

(1) SgRNA und Cas9/SgRNA Ribonucleoproteins (RNP) Vorbereitung

1. SgRNAs nach der in-vitro- Transkription beschriebenen Verfahren in der Bedienungsanleitung des Synthese-Kit (Materialtabelle, Supplement 1) zu synthetisieren.
2. Ribonucleoproteins zusammensetzen, 2 µg Cas9 mit 1 µg der SgRNA mischen und die Mischung bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubieren. Injektionslösung PN machen Sie eine funktionierende Lösung bei der Konzentration von 100 ng/µL Cas9 und 50 ng/µL SgRNA mit 10 mM-TE-Puffer (RNase frei, Materialtabelle).

(2) Vasektomie Vorbereitung

Hinweis: Vasektomie erfolgt auf männliche Hamster im Alter 6-8 Wochen. Die Operation sollte 10-14 Tage vor der ersten Paarung durchgeführt werden. Sterilität wird durch fehlgeschlagene Schwangerschaften aus Verpaarung mit fruchtbaren Frauen bestätigt. Vasektomierten Männer können normalerweise verwendet werden, für ein Jahr, bevor sie weniger sexuell aktiv werden.

1. Männchen von intraperitoneal (i.p.) Injektion von Ketamin/Xylazin mit einer Dosis von 40 mg/kg (Ketamin) und 10 mg/kg (Xylazin) zu betäuben. Betäubung durch Mangel an einem Pedal Reflex (Zehe Prise) bestätigen.
2. Legen Sie sedierten Hamster im dorsalen liegen auf einem trockenen Papiertuch. Spülen Sie den Bauch mit drei Runden der antiseptischen Behandlungen durch abwechselnde chirurgische schrubben Lösungen zwischen 70 % Alkohol und Povidon-Jod.
3. Machen Sie einen vertikalen Schnitt mit Chirurgische Scheren ab 1,5 cm kranial an der Vorhaut reicht 1 cm an jeder Seite von Mittellinie (Abbildung 1a). Einschneiden der Haut, Unterhaut und Linea Alba auf den peritonealen Raum (Abbildung 1 b) zugreifen.
4. Üben Sie sanften Druck auf den kaudalen Aspekt der Hodensack die Hoden und Fettgewebe heraus zu zwingen. Greifen Sie die Samenleiter vorsichtig mit einer Pinzette und trennen Sie vorsichtig das Blutgefäß aus der Vas mit einer zweiten Zange (Abb. 1 c).
5. Halten Sie die Samenleiter mit Zange, eine Schleife zu bilden. Erhitzen Sie die Spitze des anderen Zangen in Flamme, bis er rot ist, und dann verwenden Sie, um die Schleife der Samenleiter zu entfernen. Einfügen von Fettgewebe und Hoden zurück zum Bauch. Der Samenleiter auf der gegenüberliegenden Seite mit dem gleichen Verfahren zu entfernen.
6. Naht der Muskulatur zunächst gefolgt durch Vernähen der Haut. Legen Sie das Tier auf einer warmen Unterlage in einem Käfig für 30 min, bis das Tier erholt sich. Beobachten Sie das Tier, bis es normalen Aktivität wieder aufnimmt.

(3) Empfängerin/Hamster Vorbereitung Zeitplan

1. Überwachen und aufzeichnen Estrous Zyklen.
   Hinweis: Weibliche Hamster haben einen stabile 4-Tage Estrous Zyklus, der sofort nach der Entbindung erhalten bleibt. Frauen am ersten Tag des estrous können durch die undurchsichtig, gelblich und klebrigen Ausfluss (Abbildung 2a) identifiziert werden. Weibchen am 4. Tag des estrous können durch den durchsichtigen, klebrigen Schleim (Abb. 2 b) identifiziert werden.
2. Für Superovulation Spender Hamster, superovulate die geschlechtsreifen Weibchen (> 6 Wochen) am ersten Tag des Estrous Zyklus durch IP-Injektion von trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG; aufgelöst in PBS als 50 IU/mL) (Tabelle 1) zwischen 9 und 12 Uhr.
   Hinweis: PMSG ist zur Induktion Superovulation aber nicht für die Synchronisierung Estrous Zyklus.
3. 80 - 84 h nach Injektion von PMSG (Tag 4, 6-8 Uhr), legen die Weibchen in Käfigen mit Männchen zur Paarung. Gewährleisten Sie Hamster, die Paarungen nicht Kopulation führen Stecker, erfolgreiche Paarungen durch die Beobachtung der Paarungen.
4. Bereiten Sie pseudopregnant Weibchen bei der Paarung geschlechtsreifen Weibchen am 4. Tag des estrous mit vasektomierten Männer vor. Der Zeitplan für die Zubereitung von Spender und Empfänger Weibchen sind in Tabelle 2dargestellt.
   Hinweis: Wahre trächtige Weibchen können auch verwendet werden, als Empfänger, d. h., Weibchen mit einer Fellfarbe von der goldenen Farbe mattiert mit der gleichen Farbe fruchtbaren Männchen zu unterscheiden. Welpen aus Embryotransfer abgeleitet können anhand der Fellfarbe identifiziert werden. Ein potenzieller Vorteil bei der Verwendung echter trächtige Weibchen ist, dass endogen produzierte Embryonen erfolgreiche Schwangerschaften gewährleisten und PN injiziert Embryonen zu implantieren helfen würde; ein potenzieller Nachteil wahre trächtige Weibchen als Empfänger zu verwenden ist, dass PN injiziert Embryonen mit endogen konkurrieren müssen Embryonen produziert.

(4) Zygote Isolation

1. Bereiten Sie Kulturmedium (HECM-9; Rezept wird in Ergänzung 2 beschrieben), bereits in McKiernan und Bavister¹²beschrieben.
2. Bereiten Sie einen Tag vor der PN Injektion Zygote Umgang mit Gerichten (25 µL/Drop) und ein PN Injektion Tropfen (100 µL) auf den Deckel einer 35 mm-Teller mit HECM-9 vor. Dann decken Sie die mittlere Tropfen mit Mineralöl. Balance-Medium in einem Inkubator über Nacht unter den folgenden Bedingungen: 37,5 ° C, 10 % CO₂, 5 % O_2, 85 % N₂ und 100 % Luftfeuchtigkeit.
3. Am Tag für die PN-Injektion Embryo Spülung Gerichte (1 Teller/Spender Hamster) mit HECM-9 und alle Gerichte im Inkubator bis zu seiner Verwendung zu speichern.
4. Einzuschläfern Sie superovulated Hamstern mit CO₂.
5. Eileiter Isolation
   1. Legen Sie einen euthanasierten weibliche Hamster in dorsal liegen auf einem chirurgischen drapieren oder Seidenpapier und bereiten Sie den Bauch mit einem 70 % Ethanol Spray.
   2. Fest halten Sie Haut und Bauchmuskulatur Schicht an der Mittellinie und machen Sie einen Einschnitt. Einzuschneiden Sie das Bauchfell, die Bauchorgane aussetzen.
   3. Erfassen Sie eines uterinen Hörner mit einer feinen Pinzette aus- und einfahren Sie des Gewebes aus dem Bauch. Trennen Sie die Gebärmutter aus dem Gewebe handelt und Fett. Machen Sie einen Schnitt zwischen Eileiter und Eierstock und einen zweiten Schnitt angrenzend an der Kreuzung der Eileiter und Gebärmutter (enthalten einen kleinen Teil der Gebärmutter). Platzieren Sie die beiden Eileiter in der Tonschüssel bündig.
6. Spülen und sammeln von Zygoten
   1. Unter dem Mikroskop Dissektion die Seite des uterinen Horn mit einem #5 Dumont Pinzetten erfassen und hausgemachte Nadel (Abbildung 3) in das Lumen des Eileiters aus dem infundibular Ende und spülen die Eileiter mit 300-400 µL Medium HECM-9.
   2. Sammeln Sie die Zygoten sofort und waschen Sie sie zweimal mit HECM-9 Medium in der Handhabung-Schale. In diesem Stadium der Entwicklung sollten alle die Zygoten von Kumuluszellen entblößt.
   3. Legen Sie die Zygoten in einem Inkubator (37,5 ° C, 10 % CO₂, 5 % O_2, 85 % N₂ und 100 % Luftfeuchtigkeit) sofort nach der Entnahme, Lichteinfall zu minimieren.

(5) PN Injektion

1. Tauen Sie Cas9/SgRNA RNP auf Eis auf und pflegen Sie die Anlage auf dem Eis während des gesamten Prozesses der PN-Injektion.
2. Laden Sie die Injektionsnadeln mit Cas9/SgRNA RNP Lösung unmittelbar vor der Injektion Experimente. Legen Sie das hintere Ende der Injektionsnadeln in das Rohr mit der Cas9/SgRNA RNP-Lösung und lassen Sie die Cas9/SgRNA RNP-Lösung, die Nadel durch Kapillarwirkung zu füllen.
3. Bereiten Sie die Injektion Gericht und Nadeln. Füllen Sie die Inhaber-Pipette mit Mineralöl, ~ 3 mm vor der Kurve der Halter Nadel. Bringen Sie die Halterung in die Microinjector mit der Spitze der Nadel horizontal zum Boden der Schale und füllen Sie die Spitze der Nadel mit Medium durch Absaugen. Legen Sie die Injektionsnadel in einem Winkel von 10-15° gegenüber Halter.
4. PN-Injektion
   1. Eine Zygote zu identifizieren und eine feine Absaugung mit der Halterung Nadel anwenden. Idealerweise sind die männlichen und weiblichen Vorkerne innerhalb der gleichen Brennweitenbereich und Parallel ausgerichteten Inhaber.
   2. Dringen Sie in die Zona und männliche Vorkerne (03:00-Position) mit der Injektionsnadel.
   3. Zurückzuziehen Sie die Injektionsnadel schnell, sobald die Vorkern zu verhindern, dass den Kern festhalten an der Nadel und zur Vermeidung von Schäden die Pronukleus schwillt.

6. Zygoten-Transfer zum Pseudopregnant Hamster

1. Betäuben Sie einen pseudopregnant Hamster (die gleiche Art und Weise, wie beschrieben im Abschnitt Vasektomie) zu, und legen Sie ihn auf eine chirurgische drapieren oder trockene Seidenpapier im ventralen liegen.
2. Gelten Sie Auge Schmierstoffe für die Augen des Tieres zu verhindern Augentrockenheit und bedecken den Kopf mit einem Tuch oder Papier, die Augen vor Licht zu schützen. Vorbereiten der lateralen Seite des Körpers durch das Rasieren ein ca. 4 cm x 4 cm Hautareal auf jeder Seite des Körpers, gefolgt von 3 Mal von Povidon-Jod-Peelings und 3 mal 70 % Ethanol Peelings anwenden. Nehmen Sie einen 2 cm vertikalen Schnitt 2 cm kaudalen an der letzten Rippe (siehe Abbildungen 4a, 4 b) auf jeder Seite des Rückens des Tieres.
3. Greifen Sie die Fettpolster mit Zange und ziehen Sie, bis die Eileiter und Gebärmutter sichtbar sind. Klemmen Sie die Fettpolster mit einer Futterzange und reflektieren Sie die Fettlappen dorsal über der Wirbelsäule (Abb. 4 c). Positionieren Sie die Fortpflanzungsorgane so, dass die Gebärmutter Röhre mit einem 30 Gauge-Nadel für den Embryotransfer (Abbildung 4D) durchdrungen werden kann.
4. Waschen Sie die injizierten Zygoten mit HECM-9 in ein neues Gericht. Verwenden Sie eine neue Glaspipette (Durchmesser: ~ 150-200 µm), 10-15 Zygoten zu laden. Ordnen Sie die Zygoten, als eine Kette von Perlen, gefolgt von mehreren Luftblasen. Legen Sie die Pipette in die offene eingedrungen Röhre aus Schritt 6.3 und sanft pusten in die Pipette die Zygoten in die Eileiter übertragen. Weiter bläst, bis die erste Luftblase in den Eileiter Trakt (Abb. 4e) freigesetzt wird.
5. Lassen Sie die Fettpolster und das Gewebe auf den Bauch zurück. Übertragen Sie ungefähr die gleiche Anzahl (10-15) injizierten Embryonen zu einem anderen Eileiter-Darm-Trakt durch die gleichen Prozesse.
6. Naht der Muskulatur und der Haut in 2 Schichten. Buprenorphin-HCL (0,5 mg/kg) subkutan als postoperative Analgesie zu verwalten. Den Hamster in einen Käfig zurück und legen Sie den Käfig auf einer warmen Unterlage für die Wiederherstellung. Den Käfig den Tierraum zurück, wenn das Tier aus der Narkose vollständig wiederhergestellt ist. Post-Op Analgetika sind wieder sechs Stunden später gegeben.

Ergebnisse

Die Effizienz des beschriebenen Protokolls in der Herstellung genetisch veränderter Hamster hängt die Ergebnisse der folgenden zwei kritische Schritte: die Live Geburtenrate der Empfänger Weibchen und die Zahl der live Welpen mit der beabsichtigten gentechnische Veränderungen. Die Live-Geburtenrate ist eine direkte Ergebnisse der Embryo Qualität und die Fähigkeit des Individuums, die Durchführung der PN-Injektion und Embryo-Transfer-Verfahren. Um sicherzustellen, dass das Entwicklu...

Diskussion

Um das Potenzial der syrischen Goldhamster als Modelle für menschliche Krankheiten besser zu nutzen, entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Bereitstellung einer CRISPR/Cas9 Komplex um das Genom Hamster ausgerichtet. Das PN-Injektion-Protokoll optimiert mehrere entscheidende Variablen einschließlich der Embryo Kulturmedium, Temperatur und Wellenlängen von Licht¹³. Auch gibt es mehrere Hamster-spezifischen tierischen Umgang mit Verfahren, die für erfolgreiche Umsetzung gen gezielt ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation