Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

Resumen

Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.

Resumen

La técnica de inyección pronuclear (PN) fue establecida en ratones para introducir material genético extraño en los pronúcleos de embriones en estadío de una célula. El material genético introducido puede integrar en el genoma embrionario y generar animales transgénicos con información genética extranjera después de transferencia de los embriones inyectados para favorecer a las madres. Tras el éxito en ratones, inyección de PN se ha aplicado con éxito en muchas otras especies animales. Recientemente, inyección de PN se ha empleado con éxito para introducir reactivos gene-modificar actividades, tales como el sistema CRISPR/Cas9, para lograr modificaciones genéticas específicas en varios laboratorios y especies animales de la granja. Además de dominar el conjunto especial de microinyección habilidades para producir animales genéticamente modificados mediante la inyección de PN, los investigadores deben entender la fisiología de la reproducción y el comportamiento de las especies objetivo, debido a que cada especie presenta único desafíos. Por ejemplo, embriones de hámster sirio dorado tienen único manejo requisitos en vitro que técnicas de inyección de PN no fueron posibles en esta especie hasta descubrimientos recientes de nuestro grupo. Con nuestro protocolo de inyección de PN de especies modificadas, hemos tenido éxito en producir varios knockout del gen (KO) y knockin hámsteres (KI), que se han utilizado con éxito para enfermedades humanas modelo. Aquí describimos el procedimiento de inyección de PN para entregar el CRISPR/Cas9 complejo a los cigotos del hámster, condiciones de manejo de embriones, procedimientos de transferencia de embrión, y cría necesaria para producir genéticamente modificado hámsteres.

Introducción

El hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) es uno de los roedores más ampliamente utilizados para la investigación biomédica. Según el Departamento de agricultura de Estados Unidos, se utilizaron hámsters aproximadamente 100.000 en los Estados Unidos en 2015, representando el 13% de uso animal, laboratorio total entre las especies cubiertas por la ley de Bienestar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acceso 10 de marzo de 2017).

El hámster ofrece varias ventajas sobre otros roedores en el estudio de un número de enfermedades humanas. Por ejemplo, los adenocarcinomas ductal pancreático histopatología de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) inducida en hámster es similar a los tumores pancreáticos humanos, BOP tratamiento principalmente induce tumores de la glándula de tiroides en ratas y de pulmón y tumores del hígado en ratones¹. Porque los hámsteres son lo solamente pequeño roedor encontrado para apoyar la replicación del adenovirus, son también el modelo de elección para las pruebas de vectores basados en adenovirus oncolíticos y drogas contra adenovirus^2,3,4. Otro ejemplo en donde el modelo de hámster ofrece una ventaja sobre las ratas y ratones es en el estudio de la hiperlipidemia. Los seres humanos y hámsters presentan grandes semejanzas en vías metabólicas de lípidos y ambas especies llevan el gen que codifica la acumulación de colesteril éster transferencia proteína (CETP), que desempeña un papel central en lípido metabolismo, mientras que el CETP está ausente en los ratones y ratas⁵. Además, hámsteres desarrollan enfermedad hemorrágica más representativa de la manifestación humana después de la exposición al virus de Ebola⁶. Hámsters son también los modelos de elección para el estudio de ateroesclerosis⁷, carcinomas orales⁸y⁹de Miopatías inflamatorias. Recientemente, también ha sido demostrado que hámsteres son altamente susceptibles a la infección del virus Andes y hantavirus pulmonar síndrome-como enfermedad, proporcionando el modelo sólo roedor de los Andes virus infección¹⁰.

Para abordar la necesidad insatisfecha de novela genéticas modelos animales estudiar las enfermedades humanas donde no está disponible confiable modelo roedor pequeño, recientemente han tenido éxito en la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el hámster y han producido varias líneas de genética Ingeniería de hámsteres¹¹. Cigotos de hámster son muy sensibles a medios ambientales que los protocolos de inyección PN desarrollados en otras especies no son adecuados. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para el hámster que se adapta a los requisitos especiales para la manipulación de embriones de hámster in vitro. Aquí, describimos el procedimiento de inyección PN detallado utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y las medidas de acompañamiento, desde la preparación del guía solo RNA (sgRNA) para la transferencia de embriones inyectados en hembras receptoras.

Protocolo

Los procedimientos descritos en este protocolo fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Utah State University (protocolo IACUC: 2484). Hamsters en este protocolo son el adultos (6-10 semanas de edad) LVG cepa hámsters sirios dorados. Los hámsteres están alojados en el vivero en el centro de Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente se encuentra a 23 ° C, humedad se establece en 40-50%, y se establece el ciclo de luz 14:00 (luz: oscuridad). Siempre que sea posible, procedimientos de manipulación y surugical de embriones deben realizarse con técnicas estériles.

1. sgRNA y Cas9/sgRNA ribonucleoproteínas (RNP) preparación

1. Sintetizar sgRNAs siguiendo los procedimientos de transcripción en vitro descritos en el manual del kit de síntesis (tabla de materiales, suplemento 1).
2. Montar ribonucleoproteínas, mezclar 2 μg de Cas9 con 1 μg de sgRNA y incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Para la inyección de la PN, hacer una solución de trabajo en la concentración de 100 ng/μl Cas9 y 50 ng/μl sgRNA con 10 mM de tampón con TE (libre de Rnasa, Tabla de materiales).

2. vasectomía preparación

Nota: La vasectomía se realiza en hamsters macho a 6-8 semanas de edad. La cirugía debe realizarse 10-14 días antes del primer apareamiento. Esterilidad es confirmada por embarazos fallidos de apareamiento con las hembras fértiles. Machos vasectomizados pueden utilizarse normalmente para un año antes de que sean menos sexualmente activos.

1. Anestesiar los machos por inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina/xilacina con una dosis de 40 mg/kg (ketamina) y 10 mg/kg (xilacina). Confirmar la anestesia por la falta de un reflejo pedal (pellizco del dedo del pie).
2. Pone el hámster sedado en recumbency dorsal sobre un papel seco. Enjuague el abdomen con tres rondas de tratamientos antisépticos alternando quirúrgico friegue soluciones entre alcohol al 70% y povidona yodada.
3. Haga una incisión vertical con tijeras quirúrgicas a partir de 1,5 cm craneal al prepucio que se extiende 1 cm a cada lado de la línea media (Figura 1a). Haga una incisión en la piel, tejido subcutáneo y linea alba para acceder el espacio peritoneal (Figura 1b).
4. Aplique presión suave sobre el aspecto caudal del escroto a la fuerza los testículos y el tejido graso hacia fuera. Sujete el conducto deferente suavemente con unas pinzas y con cuidado separar los vasos sanguíneos del conducto deferente con un segundo juego de fórceps (figura 1C).
5. Mantenga los conductos deferentes con el fórceps para formar un bucle. Calentar la punta del otro fórceps en la llama hasta que esté rojo y luego lo use para quitar el lazo de los conductos deferentes. Inserte el tejido graso y los testículos hacia el abdomen. Quite el conducto deferente en el lado opuesto con los mismos procedimientos.
6. Sutura de la musculatura del primero seguida de sutura de la piel. Coloque el animal en una almohadilla caliente en una jaula durante 30 minutos hasta que el animal se recupere. Observar al animal hasta que reanude la actividad normal.

3. programa de preparación de hámster donante/receptor

1. Monitor y registro de ciclos estruales.
   Nota: Hamsters hembra tienen un ciclo estral de 4-días estable que se mantiene inmediatamente después del parto. Las mujeres en el primer día del estro pueden identificarse por la opaca, amarillenta y pegajosa descarga vaginal (Figura 2a). Las hembras en el día 4 del estro pueden identificarse por el moco transparente y pegajoso (figura 2b).
2. Para la superovulación de hámster de donantes, superovulate las hembras sexualmente maduras (> 6 semanas) en el primer día del ciclo estral por la inyección del IP de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG, disuelta en PBS como 50 IU/mL) (tabla 1) entre 9-12 AM.
   Nota: PMSG es para inducir la superovulación pero no para la sincronización del ciclo estral.
3. 80 - 84 h después de la inyección de PMSG (día 4, 6-8 PM), colocar las hembras en jaulas con los machos para el apareamiento. Como hámster apareamientos no resultan en cópula enchufes, asegúrese de apareamientos exitosos observando los apareamientos.
4. Preparar las hembras seudopreñadas apareamiento las hembras sexualmente maduras en el día 4 de estro con machos vasectomizados. El calendario para la preparación de las hembras donantes y receptores se muestran en la tabla 2.
   Nota: Verdaderas hembras preñadas pueden utilizarse también como destinatarios, es decir, las hembras con un color de capa distinguible del color de oro mate con el mismo color fértiles los machos. Cachorros derivados de la transferencia de embriones pueden ser identificados basado en colores de capa. Una ventaja potencial en el uso de verdaderas hembras preñadas es que embriones producidos endógenamente asegurar embarazos exitosos y ayudar a embriones PN inyectado implantar; una desventaja potencial en el uso de verdaderas hembras preñadas como destinatarios es que PN inyectado embriones deban competir con endógeno producido embriones para su implantación.

4. cigoto aislamiento

1. Preparar medio de cultivo (HECM-9; receta se describe en el suplemento 2), como se describe anteriormente en McKiernan y Bavister¹².
2. Un día antes de la inyección de la PN, preparar cigoto manejo de platos (25 μl/gota) y una gota de la inyección del PN (100 μL) de la tapa de una placa de 35 mm con HECM-9. Luego cubrir las gotas medianas con aceite mineral. Medio de equilibrio en una incubadora durante la noche bajo las siguientes condiciones: 37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O_2, 85% N₂ y 100% de humedad.
3. En el día programado para la inyección de PN, preparar platos lavado de embriones (1 hámster de plato o donante) con HECM-9 y guardar todos los platos en la incubadora hasta su uso.
4. Eutanasia a hámsteres superovuladas con CO₂.
5. Aislamiento de oviducto
   1. Coloque un hámster hembra eutanasia en recumbency dorsal en un papel tejido o paño quirúrgico y preparar el abdomen con un spray de etanol 70%.
   2. Con firmeza mantener piel y capa muscular abdominal en la línea media y haga una incisión. Haga una incisión en el peritoneo para exponer los órganos abdominales.
   3. Tome uno de los cuernos uterinos con una pinza fina y retire el tejido del abdomen. Separar el útero el tejido mesometrium y grasa. Hacer un corte entre el oviducto y ovario y un segundo corte adyacente a la ensambladura del oviducto y útero (incluye una pequeña parte del útero). Coloque los dos oviductos en el mismo recipiente al ras.
6. Ras y recoger cigotos
   1. Bajo el microscopio de disección, sujete el lado del cuerno uterino con una pinza de Dumont #5 Inserte una aguja casera (figura 3) en el lumen del oviducto del extremo infundibuliforme y lave el oviducto con 300-400 μL de medio de HECM-9.
   2. Recoger inmediatamente los cigotos y lavar dos veces con medio de HECM-9 en el plato de manejo. En esta etapa de desarrollo, todos los cigotos deben ser denudados de células del cúmulo.
   3. Coloque los cigotos en una incubadora (37,5 ° C, 10% CO₂, 5% O de_2, 85% N₂ y 100% humedad) inmediatamente después de su obtención para minimizar la exposición a la luz.

5. PN inyección

1. Descongelar el RNP Cas9/sgRNA en hielo y mantener el complejo en el hielo durante todo el proceso de inyección de la PN.
2. Las agujas de inyección con solución Cas9/sgRNA RNP inmediatamente antes de los experimentos de inyección de la carga. Coloque el extremo posterior de las agujas de inyección en el tubo que contiene la solución Cas9/sgRNA RNP y deje que la solución de Cas9/sgRNA RNP llenar la aguja por la acción capilar.
3. Preparar el plato de inyección y las agujas. Llenar la pipeta del porta con aceite mineral dentro de ~ 3 m m de la curva de la aguja de titular. Coloque el soporte en la microinyectora con la punta de la aguja horizontal en la parte inferior del plato y llenar la punta de la aguja con medio por succión. Ponga la aguja de inyección en un ángulo de 10-15 º frente al titular.
4. Inyección de PN
   1. Identificar un cigoto y succione bien con la aguja de titular. Idealmente, los pronúcleos masculinos y femeninos están dentro del mismo rango focal y alineado paralelo al soporte.
   2. Penetrar en la zona y pronúcleos masculinos (posición 3:00) con la aguja de inyección.
   3. Retirar rápidamente la aguja de inyección una vez que el pronúcleo se hincha para impedir que el núcleo adherido a la aguja y para evitar dañar el pronúcleo.

6. cigotos transferir a hámsteres seudopreñadas

1. Anestesiar un hámster seudopreñado (la misma forma que se describe en la sección vasectomía) y colocarlos sobre un paño quirúrgico o papel seco en recumbency ventral.
2. Aplicar lubricantes de ojo en los ojos del animal para evitar la sequedad de ojos y cubre la cabeza con un paño o papel para proteger los ojos de la luz. Preparar el aspecto lateral del cuerpo de afeitar por un área de piel de 4 cm x 4 cm sobre cada lado del cuerpo seguido de 3 veces la aplicación de povidona-iodada y peelings de etanol 70% 3 veces. Haga una incisión vertical de 2 cm 2 cm caudal a la última costilla (como se muestra en las figuras 4a, 4b) a cada lado de la espalda del animal.
3. Sujete la almohadilla de grasa con fórceps y tirar suavemente hasta que el oviducto y el útero son accesibles. Fije la almohadilla de grasa con una pinzas hemostáticas y reflejar la almohadilla de grasa dorsal en la columna vertebral (figura 4C). La posición del tracto reproductivo tal que el tubo uterino puede ser penetrado con una aguja de 30 calibre para transferencia de embriones (figura 4 d).
4. Lave los cigotos inyectados con HECM-9 en un plato nuevo. Utilice una nueva pipeta de vidrio (diámetro: ~ 150-200 μm) para cargar cigotos de 10-15. Arreglar los cigotos como una cadena de perlas seguido por varias burbujas de aire. Introduzca la pipeta en el tubo abierto penetrado de paso 6.3 y sople suavemente en la pipeta de transferencia de los cigotos en el oviducto. Siguen soplando hasta que se libera la primera burbuja de aire en la zona del oviducto (Figura 4e).
5. Suelte la almohadilla de grasa y retomar el tejido del abdomen. Aproximadamente el mismo número (10-15) la transferencia de embriones inyectados a otra zona del oviducto por los mismos procesos.
6. La sutura de la musculatura y la piel en 2 capas. Administre buprenorfina-HCL (0.5 mg/kg) por vía subcutánea como analgesia post-operatoria. Retomar el hámster en una jaula y poner la jaula en una almohadilla caliente para la recuperación. Volver a la jaula a la sala de animales cuando el animal está totalmente recuperado de la anestesia. Analgésicos después de la operación se dan otra vez seis horas más tarde.

Resultados

La eficiencia del protocolo descrito en la producción de transgénicos hamsters depende de los resultados de los siguientes dos pasos críticos: la tasa de nacidos vivos de hembras receptoras y del número de cachorros vivos con el previsto modificaciones genéticas. La tasa de nacidos vivos es resultado directo de la calidad del embrión y la habilidad de la persona realizando la inyección de PN y procedimientos de transferencia de embrión. Para asegurarse de que no se comprometa el p...

Discusión

Para aprovechar mejor el potencial de hámsters sirios dorados como modelos de enfermedades humanas, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para entregar un CRISPR/Cas9 complejo para el genoma de hámster. El protocolo de inyección PN optimiza varias variables claves, incluyendo el medio de cultivo de embriones, la temperatura y longitudes de onda de luz¹³. También existen varios procedimientos de manejo de animales hamster específicos que deben seguir para la realización con éxi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation