Production de génétiquement Hamsters syriens dorés par Injection pronucléaire du complexe CRISPR/Cas9

Résumé

Pronucléaire injection (PN) du cluster régulièrement entrecoupées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) et le système CRISPR-associated protein-9 nucléase (CRISPR/Cas9) est une méthode très efficace pour produire génétiquement hamsters syriens dorés. Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé d’injection de PN pour la production des hamsters de knock-out du gène avec le système CRISPR/Cas9.

Résumé

La technique d’injection pronucléaire (PN) fut instituée chez les souris pour introduire le matériel génétique étranger dans les pronucléus des embryons au stade unicellulaire. Le matériel génétique introduit peut s’intégrer dans le génome embryonnaire et générer des animaux transgéniques avec des informations génétiques étrangers après le transfert des embryons injectées afin d’encourager les mères. Suite au succès à souris, injection PN a été appliquée avec succès dans beaucoup d’autres espèces animales. Récemment, injection PN a été avec succès employée pour introduire les réactifs avec les gènes modificateurs des activités, comme le système CRISPR/Cas9, de réaliser des modifications génétiques in sites dans plusieurs laboratoires et espèces animales de la ferme. En plus de maîtriser le spécial de microinjection compétences pour produire des animaux génétiquement modifiés par injection de PN, les chercheurs doivent comprendre la physiologie de la reproduction et le comportement de l’espèce cible, parce que chaque espèce présente unique défis. Par exemple, les embryons de hamster doré de Syrie ont unique manipulation conditions in vitro , tels que les techniques d’injection PN n’étaient pas possibles dans cette espèce jusqu'à récentes avancées par notre groupe. Avec notre protocole d’injection de PN espèces modifiées, nous avons réussi à produire plusieurs knock-out du gène (KO) et knockin hamsters (KI), qui ont été utilisés avec succès aux maladies humaines de modèle. Nous décrivons ici la procédure d’injection PN pour livrer le complexe CRISPR/Cas9 pour les zygotes du hamster, les conditions de manipulation des embryons, les procédures de transfert d’embryon, et élevage pour produire des organismes génétiquement modifiés hamsters.

Introduction

Le golden hamster syrien (Mesocricetus auratus) est l’un des rongeurs plus largement utilisés pour la recherche biomédicale. Selon le département américain de l’Agriculture, environ 100 000 hamsters ont été utilisés aux États-Unis en 2015, ce qui représente 13 % du total laboratoire animal son utilisation parmi les espèces couvertes par l’Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; consulté le 10 mars 2017).

Le hamster offre plusieurs avantages par rapport aux autres rongeurs dans l’étude d’un certain nombre de maladies humaines. Par exemple, les adénocarcinomes canalaire pancréatique histopathologie du N-nitrosobis(2-oxopropyl) amine (BOP) induit chez hamster est semblable à des tumeurs pancréatiques humaines, tandis que BOP traitement principalement induit des tumeurs de la glande thyroïde chez le rat et le poumon et les tumeurs du foie chez les ¹de souris. Les hamsters sont le seul petit rongeur trouvé à l’appui de la réplication des adénovirus, elles sont aussi le modèle de choix pour le dépistage des vecteurs de base adénovirus oncolytiques et drogues anti-Adénovirus^2,3,4. Un autre exemple dans lequel le modèle de hamster offre un avantage sur les rats et les souris est à l’étude de l’hyperlipidémie. Les humains et les hamsters présentent de grandes similitudes dans les voies métaboliques lipidiques et les deux espèces portent le gène codant cholesteryl ester transfert protéine (CETP), qui joue un rôle central dans les lipides métabolismes, tandis que CETP est absent chez les souris et les rats⁵. En outre, hamsters développent la maladie hémorragique plus représentative de la manifestation humaine après une exposition au virus Ebola virus⁶. Les hamsters sont également les modèles de choix pour l’étude de l’athérosclérose⁷, carcinomes orale⁸et myopathies inflammatoires⁹. Récemment, il a également été démontré que les hamsters sont très sensibles à l’infection par le virus Andes et développeront une maladie comme le syndrome pulmonaire hantavirus, fournissant le modèle seulement rongeur des Andes virus infection¹⁰.

Pour répondre aux besoins non satisfaits des nouveaux modèles animaux génétiques étudier les maladies humaines où n’existe aucun modèle de rongeur petit fiable, nous avons récemment ont réussi à appliquer le système CRISPR/Cas9 pour le hamster et ont produit plusieurs gammes de génétiquement Engineered hamsters¹¹. Les zygotes hamster sont très sensibles aux milieux environnementaux tels que les protocoles d’injection PN développés chez d’autres espèces ne conviennent pas. Par conséquent, nous avons développé un protocole d’injection de PN pour le hamster qui tienne compte des exigences particulières pour la manipulation de hamster embryons in vitro. Nous décrivons ici la procédure d’injection PN détaillée en utilisant le système CRISPR/Cas9 et les étapes qui l’accompagne, de la préparation du seul guide RNA (sgRNA) pour le transfert des embryons injectés dans les femmes bénéficiaires.

Protocole

Les procédures décrites dans le présent protocole a été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Utah State University (protocole IACUC : 2484). Les hamsters utilisés dans le présent protocole sont adultes (6 à 10 semaines d’âge) LVG souche hamsters syriens dorés. Tous les hamsters sont logés dans le vivarium au centre bio-innovation, Utah State University. Température de la pièce est fixée à 23 ° C, humidité est fixée à 40-50 % et cycle de lumière est défini 14:00 (lumière : obscurité). La mesure du possible, embryon manipulation et surugical procédures doivent être effectuées avec des techniques stériles.

1. sgRNA et préparation des ribonucléoprotéines (RNP) Cas9/sgRNA

1. Synthétiser les sgRNAs suivant la procédure transcription in vitro décrite dans le manuel du kit de synthèse (Table des matières, Supplément 1).
2. Pour assembler les ribonucléoprotéines, mélanger 2 µg de Cas9 avec 1 µg de sgRNA et incuber le mélange à température ambiante pendant 10-15 min. Pour injection de PN, préparer une solution de travail à une concentration de 100 ng/µL Cas9 et 50 ng/µL sgRNA avec un tampon TE 10 mM (RNase librement, Table des matières).

2. préparation de la vasectomie

NOTE : Vasectomie est réalisée sur des hamsters mâles à 6-8 semaines d’âge. La chirurgie doit être effectuée 10-14 jours avant le premier accouplement. La stérilité est confirmée par des grossesses ayant échouées d’accouplement avec des femelles fertiles. Les hommes vasectomisés utilisable normalement pendant un an avant qu’ils deviennent moins sexuellement actives.

1. Anesthésier les mâles par injection intrapéritonéale (i.p.) de kétamine/xylazine avec une dose de 40 mg/kg (kétamine) et 10 mg/kg (xylazine). Confirmer l’anesthésie par le manque d’un réflexe de pédale (pincement de l’orteil).
2. En décubitus dorsal, mettre le hamster sous sédation sur un papier de soie sèche. Rincer l’abdomen avec trois séries de traitements antiseptiques en alternant chirurgicale frotter solutions entre 70 % d’alcool et de povidone-iode.
3. Pratiquer une incision verticale avec des ciseaux chirurgicaux à partir de 1,5 cm crânien par rapport au prépuce qui s’étend de 1 cm de chaque côté de la ligne médiane (Figure 1 a). Inciser la peau et tissu sous-cutané linea alba d’accéder à l’espace péritonéal (Figure 1 b).
4. Appliquez une légère pression à l’aspect caudale du scrotum pour forcer les testicules et les tissus adipeux out. Saisir le canal déférent doucement avec une pince et soigneusement séparer le vaisseaux sanguins de SAV avec une deuxième série de pinces (Figure 1C).
5. Tenez le canal déférent avec une pince pour former une boucle. Chauffer la pointe d’un autre pince flamme jusqu'à ce qu’il est rouge et puis l’utiliser pour supprimer la boucle du canal déférent. Insérez le tissu adipeux et des testicules vers l’abdomen. Supprimer le canal déférent du côté adverse avec les mêmes procédures.
6. Suture de la musculature d’abord puis suture de la peau. Placez l’animal sur un coussin chaud dans une cage pendant 30 min jusqu'à ce que l’animal récupère. Observer l’animal jusqu'à ce qu’il reprenne une activité normale.

3. calendrier de préparation pour le Hamster donneur/receveur

1. Surveiller et enregistrer cycles oestraux.
   NOTE : Hamsters femelles ont un cycle oestral stable 4 jours qui est entretenu immédiatement après l’accouchement. Les femmes le premier jour de l’oestrus peuvent être identifiées par la décharge vaginale opaque, jaunâtre et collante (Figure 2 a). Les femelles sur 4 jour de œstrus peuvent être identifiées par la glaire transparente et collante (Figure 2 b).
2. Pour superovulation du hamster de donateurs, superovulate les femelles sexuellement matures (> 6 semaines) le premier jour du cycle oestral par injection Intrapéritonéale de la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG ; PBS dissous dans 50 IU/ml) (tableau 1) entre 9-12 h 00.
   Remarque : Le PMSG est pour induire la superovulation, mais pas pour la synchronisation de le œstrus.
3. 80 - 84 h après l’injection de PMSG (jour 4, 6-8 PM), placez les femelles dans des cages avec des mâles pour l’accouplement. Prises de hamster accouplements n’entraînent pas de copulation, assurer les accouplements réussis en regardant les accouplements.
4. Préparer les femelles pseudo-gravides en s’accouplant femelles sexuellement matures sur 4 jours de œstrus avec les hommes vasectomisés. Le calendrier pour la préparation des femelles donneur et receveur sont indiquées dans le tableau 2.
   Remarque : Les femelles gravides vraies également utilisable comme bénéficiaires, c'est-à-dire, les femmes avec une couche de couleur différente de la couleur dorée collée avec des mâles fertiles de même couleur. Chiots issus de transfert d’embryons peuvent être identifiés à l’issu des couleurs de la robe. Un avantage potentiel en utilisant les femelles gravides vraies est qu’embryons produits de façon endogène garantirait grossesses réussies et aider les embryons PN injecté de l’implant ; un inconvénient potentiel en utilisant les femelles gravides vraies comme destinataires est que PN injecté embryons nécessité de concurrencer de manière endogène produite pour l’implantation des embryons.

4. zygote isolement

1. Préparer le milieu de culture (PHC-9 ; recette est décrite dans le complément 2), comme décrit précédemment dans McKiernan et belmir¹².
2. Un jour avant l’injection de PN, préparer le zygote manutention plats (25 µL/drop) et une goutte d’injection de PN (100 µL) dans le couvercle d’un plat de 35 mm avec PHC-9. Puis recouvrir les gouttes moyens avec l’huile minérale. Moyen d’équilibre dans un incubateur pendant la nuit dans les conditions suivantes : 37,5 ° C, 10 % CO₂, 5 % O_2, 85 % N₂ et 100 % d’humidité.
3. Le jour prévu pour l’injection de PN, préparer des plats de chasse embryon (1 hamster de plat/donneur) avec PHC-9 et tous les plats se conservent dans l’incubateur jusqu'à utilisation.
4. Euthanasier superovulation hamsters en CO₂.
5. Isolement de l’oviducte
   1. Placez un hamster femelle euthanasié en décubitus dorsal sur un drapé chirurgicale ou un mouchoir en papier et préparer l’abdomen avec un spray d’éthanol 70 %.
   2. Bien tenir la peau et la couche musculaire abdominale à la ligne médiane et faites une incision. Inciser le péritoine pour exposer les organes abdominaux.
   3. Une des cornes utérines saisir avec une pince fine et rétracter le tissu de l’abdomen. Séparer l’utérus du tissu mesometrium et gras. Faites une coupe entre l’oviducte et ovaire et une deuxième coupe adjacentes à la jonction de l’oviducte et utérus (inclure une petite partie de l’utérus). Placer les deux oviductes dans le même plat de chasse.
6. Rincer et collecter des zygotes
   1. Sous le microscope à dissection, saisir la côté de la corne utérine avec une pince de Dumont #5 et insérer une aiguille fait maison (Figure 3) dans la lumière de l’oviducte de la fin infundibulaire et rincer l’oviducte avec 300-400 µL de milieu de PHC-9.
   2. Recueillir les zygotes immédiatement et laver deux fois avec moyen de PHC-9 dans le plat de manutention. À ce stade de développement, tous les zygotes doivent être dénudé de cellules du cumulus.
   3. Placez les zygotes dans un incubateur (37,5 ° C, 10 % CO₂, 5 % O_2, 85 % N₂ et 100 % d’humidité) immédiatement après le prélèvement pour minimiser l’exposition à la lumière.

5. PN Injection

1. Décongeler le RNP Cas9/sgRNA sur la glace et maintenir le complexe sur la glace pendant tout le processus d’injection de PN.
2. Charger les aiguilles à injection avec solution Cas9/sgRNA RNP immédiatement avant les expériences d’injection. Placez l’extrémité arrière de l’aiguille d’injection dans le tube contenant la solution de Cas9/sgRNA RNP et laissez agir la solution RNP Cas9/sgRNA remplir l’aiguille par capillarité.
3. Préparer le plat de l’injection et des aiguilles. Remplir la pipette titulaire avec l’huile minérale à ~ 3 mm de la courbure de l’aiguille de la titulaire. Placer le support dans le microinjector avec la pointe de l’aiguille horizontale jusqu’au fond du plat et remplir la pointe de l’aiguille moyenne par aspiration. Mettre l’aiguille d’injection à un angle de 10 à 15° en face de la porte.
4. Injection de PN
   1. Identifier un zygote et appliquez une aspiration très bien avec l’aiguille de la titulaire. Idéalement, les pronucléus mâles et femelles sont dans la même plage de focales et aligné parallèlement à la titulaire.
   2. Pénétrer le zona et le pronucléus mâles (03:00 poste) avec l’aiguille d’injection.
   3. Retirer l’aiguille d’injection rapidement une fois que le pronucléus gonfle pour empêcher le noyau n’adhère à l’aiguille et pour éviter d’endommager le pronucléus.

6. zygotes transfert aux Hamsters pseudo-gravides

1. Anesthésier un hamster pseudo-gravides (la même manière que décrit dans la section de vasectomie ci-dessus) et le poser sur un drapé chirurgicale ou un mouchoir en papier sec en décubitus ventral.
2. Appliquer des lubrifiants oculaires aux yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement de le œil et couvrir la tête avec un chiffon ou du papier pour protéger les yeux contre la lumière. Préparer la partie latérale du corps en se rasant une zone de peau environ 4 cm x 4 cm de chaque côté du corps suivie d’application 3 fois de povidone-iode scrubs et exfoliants de l’éthanol 70 % 3 fois. Faire une incision verticale de 2 cm 2 cm caudale de la dernière côte (tel qu’illustré dans les Figures 4 a, 4 b) de chaque côté du dos de l’animal.
3. Saisir la garniture avec une pince et tirer doucement jusqu'à ce que l’oviducte et utérus sont visibles. Fixer la garniture avec un hémostatique et reflètent le coussin de graisse sur le dos sur la colonne vertébrale (Figure 4C). Placez l’appareil reproducteur de telle sorte que le tube utérin peut être pénétré avec une aiguille de 30 calibre pour le transfert d’embryons (Figure 4D).
4. Laver les zygotes injectés avec PHC-9 dans une autre boite. Une nouvelle pipette de verre (diamètre : ~ 150-200 µm) pour charger des zygotes de 10-15. Organiser les zygotes comme une chaîne de perles, suivie par plusieurs bulles d’air. Insérer la pipette dans le tube ouvert pénétré de l’étape 6.3 et souffler doucement dans la pipette pour transférer les zygotes dans l’oviducte. Continuer à souffler jusqu’au relâchement de la première bulle d’air dans les voies de l’oviducte (Figure 4e).
5. Libérer les coussinets adipeux et retourner le tissu à l’abdomen. Transférer environ le même nombre (10-15) des embryons injectés à un autre tract oviducte par les mêmes procédés.
6. Suturer les muscles et la peau en 2 couches. Administrer la buprénorphine-HCL (0,5 mg/kg) par voie sous-cutanée dans l’analgésie post-opératoire. Retourner le hamster dans une cage et placer la cage sur un coussin chaud pour la récupération. Retourner la cage à l’animalerie quand l’animal est complètement remis de l’anesthésie. Analgésiques postopératoires sont donnés à nouveau six heures plus tard.

Résultats

L’efficacité du protocole décrit en produisant des hamsters génétiquement modifiés dépend des résultats des deux étapes essentielles suivantes : le taux de naissances vivantes des femmes bénéficiaires et le nombre de ratons vivants avec les modifications génétiques prévues. Le taux de naissance vivante est un résultat direct de la qualité de l’embryon et l’habileté de la personne effectuant l’injection de PN et les procédures de transfert d’embryon. Pour vous a...

Discussion

Pour mieux exploiter le potentiel des hamsters syriens dorés comme modèles de maladies humaines, nous avons développé un protocole d’injection de PN pour la livraison d’un complexe de CRISPR/Cas9 pour cibler le génome de hamster. Le protocole d’injection PN optimise plusieurs variables clés, y compris le milieu de culture des embryons, la température et longueur d’onde de lumière¹³. Il y a également plusieurs procédures gestion animaux hamster spécifique à suivre pour mener ave...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cas9	Invitrogen	B25640	1 ug/ul (~6.1 uM)
GeneArtTM Precision Synthesis Kit	Invitrogen	A29377	For sgRNA synthesis
Albumin from human serum	Sigma	A1653	For cultivation medium
Illuminator	Nikon	NI-150	For embryo transfer
Incubator	New Brunswick	Galaxy 14S	For embryo cultivation
Microforge	Narishige	PB-7	For making injection needles
Microscope	Nikon	ECLIPSE Ti-S	For microinjection
Microscope	invitrogen	SMZ745T	For embryo transfer
Mineral oil	Sigma	M1840	Keep in dark
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	For superovulation