حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي للتعبير غير الفيروسية من البروتينات في الكلي

Summary

ويصف هذا البروتوكول طريقة لحقن بلازميد الحمض النووي الكلي الماوس عبر الحوض الكلوي لإنتاج التعبير التحوير على وجه التحديد في الكلي.

Abstract

حقن هيدرودينامية يخلق بيئة محلية، والضغط ترانسفيكت الأنسجة المختلفة مع بلازميد الحمض النووي وغيرها من المواد. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل، على سبيل المثال، هو أسلوب راسخة التي يمكن ترانسفيكتيد في الكبد. ويصف هذه المخطوطة تطبيق المبادئ هيدرودينامية بالحقن الكلي الماوس مباشرة مع بلازميد الحمض النووي للتعبير الجيني الخاصة بالكلى. تم تخديره من الفئران والكلى يتم كشفها بواسطة شق الجناح متبوعاً حقن سريعة بلازميد الحل التي تحتوي على الحمض النووي مباشرة في الحوض الكلوي. ويحتفظ الإبرة في مكان لمدة عشر ثوان وهو خياطة شق الموقع. يعيش في اليوم التالي، تصوير الحيوان أو لطخة غربية، أو immunohistochemistry قد تستعمل للاعتداء التعبير الجيني أو فحوصات أخرى مناسبة للتحوير لخيار تستخدم للكشف عن البروتين للفائدة. أساليب المنشورة لإطالة أمد التعبير الجيني تشمل المعاملة التكامل والسيكلوفوسفاميد التحوير بوساطة ينقول تكبح الاستجابة المناعية للتحوير.

Introduction

تقنية حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبحت وسيلة شائعة لتحقيق مستويات عالية من التعبير الجيني في الماوس الكبد^1،2. هي أيضا transfected الكلي بهذا الأسلوب على مستوى أقل بكثير، حوالي 100-fold أقل³. حقن الحوض الكلوي هيدرودينامية الموصوفة هنا يوفر طريقة بسيطة للتحكم في خصوصية التعبير الجهاز من خلال الوسائل المادية باستخدام نفس المبادئ هيدرودينامية التي وضعت سابقا في الكبد^4،5 ، العضلات⁶و^7،أجهزة أخرى⁸. هذا الأسلوب ترانسفيكتس الخلايا في الحيوانات الحية في فيفو باستخدام الضغط والسرعة لإجبار السوائل المحتوية على الحمض الخلوي الصبغي في الخلايا، في نفس الوقت الذي يحفز الضرر للجهاز الذي يتم بسرعة حل⁹. باستخدام التقنيات الجراحية الراسخة لتصور الكلي عن طريق شق الجناح¹⁰ جنبا إلى جنب مع حقنه واحدة بحقنه الأنسولين، وقد وجدنا تعداء الناجح لأنواع مختلفة من خلايا الكلي، أساسا من خلالي الليفية، الأنابيب، وجمع القناة¹¹. تشريح لهذه الفئران أظهرت أن الأجهزة الأخرى هي عدم transfected على مستويات عالية بما يكفي لتصور طريق لوسيفراس¹¹من تقنيات التصوير. نظراً للتقنية غير الفيروسية، يسمح استخدام بلازميد الحمض النووي تعداء إعداد سريع وسهل من الكواشف اللازمة للحقن.

وقد استخدمنا حقن هيدرودينامية المترجمة للتعبير عن الجلوتاثيون المضادة للأكسدة A4 S-ترانسفيراز ومستقبلات عامل النمو-1 مثل الأنسولين، وهرمون ارثروبويتين في الكلي، مع كل من الآثار البيولوجية المتوقعة^{11، 12 , 13}-تقييم مفصل لتوجيه الإدارة وحجم الحقن، وجرعة الحمض النووي، واختيار المروج قد أجرى¹¹. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت كلا بيجيباك ينقول النظام و/أو السيكلوفوسفاميد علاج لقمع رد الفعل المناعي للتحوير لتحسين نتائج التعبير الجيني طويلة الأجل¹¹. واستخدمت محققون آخرون نهجاً الوريد كلوي في الفئران بالنجاح، وتحقيق كفاءة عالية تعداء لفترات من الوقت أكثر من شهر واحد من¹⁴. بيد التصحيح الوراثي لتعمل محاكاة الأمراض البشرية عادة ما تتم في الفئران أولاً كإثبات لمفهوم منذ النماذج الوراثية معظم الثدييات نماذج الماوس. مقارنة حقن الوريد الكلوي إلى حقن الحوض الكلوي، ووجد أن حقن في الحوض الكلوي متفوقة السياق الكلي للتعبير الجيني (حوالي عشرة إضعاف أعلى) وبقاء¹¹. الحوض الكلوي هو طريقا مثاليا للدخول إلى الكلي لأنها مرنة بما يكفي لتحمل التقلبات في إنتاج البول، وقادرة على الحفاظ على سلامتها الهيكلية حتى عندما المتوسعة خلال هيدرونيفروسيس في كثير من الأحيان. بالإضافة إلى ذلك، يسمح حقن في الحوض الكلوي الوصول إلى الكلي دون ثقب كبسولة الكلي، يسمح للسائل المحقون واضح الاحتفاظ بالكلى أفضل من حقن intraparenchymal. أجهزة الماوس الأخرى لم يكن طريقا لدخول خلاف المفرج، ولكن المساحة البولي الكلي موقع حقن مثالية. بالإضافة إلى ذلك، أدى الحقن الوريد الكلوي تسرب الدم في تجويف البطن. وقدرت حجم الكلي الإجمالي الكلي البرية من نوع الماوس بالتصوير بالرنين المغناطيسي تكون حوالي 0.2 سم³من حيث حجم الكلي واحد مساو تقريبا لكمية السوائل التي تحقن بالحوض الكلوي هيدرودينامية حقن (100 ميليلتر)¹⁵. وهنا، قد وفرنا جميع الفروق الدقيقة المفصلة البروتوكول حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي لتحقيق تعداء قابل لإعادة الإنتاج الكلي.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان (إياكوكس) من كلية بايلور للطب والمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. إعداد الحل الحمض النووي لحقن

1. حدد plasmid(s) للتعبير عن transgene(s) بعناية لتحقيق أقصى قدر من الخصائص المرغوبة لتحسين كفاءة تعداء والتعبير التحوير.
   ملاحظة: تم حقن الحوض الكلوي هيدرودينامية والبلازميدات للتعبير عن علامة نيون تدتوماتو وهرمون الاريثروبويتين (Epo) لوسيفراس اليراع هو موضح سابقا¹¹. إذا لم يكن هناك مقايسة متطور لكفاءة تعداء للتحوير، إجراء تصوير الحيوانات الحية من لوسيفراس بإدخال 10 ميكروغرام من بلازميد معربا عن لوسيفراس مثل لوسيفراس اليراع المعززة للحمض المخفف للحقن.
   1. اختر بلازميد أصغر هو من التطبيق العملي.
      ملاحظة: ترانسفيكت والبلازميدات الصغيرة عموما أفضل من البلازميدات كبيرة الخلايا. على سبيل المثال، أن الجينات المقاومة زيوميسين والأصل R6K للنسخ المتماثل الصغيرة، حيث تستخدم هذه العناصر في العمود الفقري بلازميد سينخفض حجم بلازميد.
   2. التعبير عن التحوير من مروج الثدييات.
      ملاحظة: الكلي نوع الخلية transfected، طول التعبير الجيني، وقوة التعبير الجيني كلها ستتأثر باختيار المروج. انظر ودارد وآخرون. لمقارنة للفيروس المضخم للخلايا (CMV; التأسيسي الفيروسية)، استطالة عامل-1 ألفا (EF-1α؛ والتأسيسية الذاتية)، جاما جلوتامايل ترانسفيراز (γGT; أنبوب على حدة)، وبودسين (NPHS2؛ بودوسيتي على حدة)¹¹.
   3. تستخدم نظام تكامل غير فيروسية مثل ترانسبوزونات إذا كانت مستويات التعبير الجيني طويلة الأجل أعلى مرغوب فيه^11،16. الدراسات مع قراءات المبكر أقل من 5 أيام بعد الحقن، التكامل التحوير غير ضرورية.
2. إعداد بلازميد الحمض النووي للحقن باستخدام أسلوب تجاري مثل مجموعة ماكسيبريب خالية من الذيفان. عناية تجنب إدخال endotoxins عن طريق المختبرات الطبية.
   ملاحظة: وجود اندوتوكسينس في الحل الحمض النووي سوف تثير استجابة المناعة شديدة في الحيوان، وهذا الموضوع المساس بالتجربة وربما قتل الحيوان.
   1. بعد الانتهاء من الخطوة الأخيرة يغسل عزل الحمض النووي، تأكد من ترك لا الإيثانول بالفحص البصري ورائحة. استخدم هلام-تحميل نصائح لإزالة قطرات مرئية. الجاف للأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي بيليه رأسا على عقب في مختبر الأنسجة ممسحة المهمة الحساسة في درجة حرارة الغرفة أو في فرن 37-60 درجة مئوية مع الرصد المستمر. ريسوسبيند بيليه مباشرة بعد قد تبخرت الإيثانول المتبقي لمنع أوفيردريينج من بيليه.
      ملاحظة: الإيثانول المتبقية يتداخل مع قراءة جهاز المطياف الضوئي تركيز الحمض النووي ومقدمة للكلى غير مرغوب فيه.
   2. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في المخزن المؤقت لنفسه كما سيتم استخدامها لحقن (التسليم هيدرودينامية المخزن المؤقت؛ 100-300 ميليلتر) للحد من التباين في التركيب الكيميائي للحل المخزن المؤقت للحمض النووي بين المجموعات.
      ملاحظة: لا ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في شطف المخزن المؤقت الحل الذي يأتي مع عدة. وكيل شيلاتينغ يدتا شائع في الشركة "المصرية للاتصالات" المخزن المؤقت للأعمال التحضيرية قد يؤثر على وظيفة القلب والأوعية الدموية والكلى. اعتماداً على حجم بيليه، الوت في 100-300 ميليلتر التسليم هيدرودينامية المخزن المؤقت لتحقيق تركيز عال. سوف يكون تركيز الحمض النووي الكامل المخفف النهائي بين 100 نانوغرام/ميليلتر (10 ميكروغرام/الماوس الجرعة) و 500 نانوغرام/ميليلتر (50 ميكروغرام/الماوس الجرعة) وبتركيز الحمض النووي الأسهم ينبغي أن يتجاوز هذا.
   3. تماما ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في المخزن المؤقت. اترك بيليه في إيصال هيدرودينامية المخزن المؤقت في الأنبوب الأصلي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية قبل نقل إلى أنبوب معقم [ميكروفوج] لضمان أن الحمض النووي هو حل تماما.
   4. قراءة تركيز الحمض النووي بلازميد جهاز المطياف الضوئي أو بطريقة أخرى.
      ملاحظة: ينبغي أن ذلك قراءات في تكرار مع replicates إضافية إذا لزم الأمر. إذا كان أقل من 1.8 نسبة 260/280، الإعداد ملوثة بالحمض النووي الريبي أو مادة أخرى لذا تخلص منه وإعداد الحمض النووي مرة أخرى.
   5. مخزن بلازميد الحمض النووي حراكه في المخزن المؤقت للحقن في-20 درجة مئوية داخل مربع في دليل تذويب الثلاجة لتجنب تدهور للحمض النووي.
      ملاحظة: المخزنة بهذه الطريقة، سوف تستمر إعداد الحمض النووي لسنوات عديدة. التحقق من سلامة الحمض النووي بتقييد ملخص و [اغروس] هلام التفريد. الحمض النووي أن تلطيخ أسفل الممر قد تحللت ولا يمكن استخدامه في حين يمكن استخدام الحمض النووي الذي ينتج عصابات هش من الحجم الصحيح لحقن.
3. إعداد الحل الحمض النووي بلازميد المخفف لحقن في الحوض الكلوي.
   ملاحظة: النظر في مراقبة المجموعات بعناية. للعديد من الدراسات، ترد ضوابط حقن فقط السذاجة والمخزن المؤقت لأنه يتسبب في أضرار حقن نفسه وقد تؤثر على نتائج تجريبية¹¹.
   1. تذويب الحمض النووي خالية من الذيفان التيد في المخزن المؤقت لإيصال هيدرودينامية في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء.
   2. حساب كمية الحمض اللازمة للحقن وتحضير الحمض المخفف لكل مجموعة. إدارة 10-50 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي إلى إجمالي حجم 100 ميليلتر مع المخزن المؤقت هيدرودينامية تسليم كل ماوس.
      ملاحظة: على سبيل مثال العمليات الحسابية لحقن الفئران 3 مع 10 ميكروغرام/الماوس من بلازميد الحمض النووي يحتوي على تركيز من 0.5 ميكروغرام/ميليلتر فيما يلي.
      1. إعداد ما يكفي حلاً على الحمض النووي لحوالي 20% إضافية لتحميل بالفضاء الميت في الإبرة والمحاقن. للفئران 3، إعداد مزيج في 3.5 x. حساب كتلة الحمض النووي في ميكروغرام أنه ينبغي في الحل. وسيكون هنا ميكروغرام 10 × 3.5 = 35 ميكروغرام.
      2. حساب الحجم الإجمالي للحل المنشود للحقن ميليلتر 100 في الماوس. وفي هذه الحالة، سيكون من 100 ميليلتر × 3.5 = 350 ميليلتر الحجم الإجمالي.
      3. حساب حجم الأسهم بلازميد الحمض النووي إضافة إلى الحل. وفي هذه الحالة، سيكون من 35 ميكروغرام/0.5 ميكروغرام/ميليلتر = ميليلتر 70 من الأسهم بلازميد الحمض النووي.
      4. حساب حجم المخزن المؤقت لإضافة إلى الحل الحمض المخفف بطرح حجم المخزون الحمض النووي وأضاف (الخطوة 1.3.2.3) من الحجم الإجمالي للحمض المخفف هو المطلوب (الخطوة 1.3.2.2). وفي هذه الحالة، سيكون من 350 ميليلتر-ميليلتر 70 = ميليلتر 280 التسليم هيدرودينامية المخزن المؤقت.
   3. إعداد الحلول في أنابيب معقمة [ميكروفوج] باستخدام عوامل التصفية المتوفرة تجارياً ماصة نصائح مع تقنية العقيمة على مقاعد البدلاء المختبر.
      ملاحظة: قد أعد الحلول الحمض النووي وتخزينها في درجة حرارة الغرفة للحقن ليحدث ذلك اليوم. لا حقن الفئران بحل البرد هذا سوف يخفض درجة حرارة الجسم، ولكن الاحترار لا لزوم لها.

2-إجراء عملية جراحية حقن الحوض الكلوي هيدرودينامية

1. حدد الفئران بعناية لإجراء عملية جراحية.
   ملاحظة: الاختلافات الخاصة بالسلالة لم تحترم حتى الآن ولكن قد يكون من الممكن. وكانت معظم الحقن C57BL/6 أو الخلفيات ففب. حقن الحوض الكلوي تعمل بشكل أفضل في الفئران التي أسابيع 6-12 من العمر. في الفئران أكبر من 16 أسبوعا، معدل فشل 50% من لوسيفراس يصل إلى تصوير من الممكن لأسباب غير واضحة. وقد لوحظ معدل الفشل المرتبطة بالسن نفسه لحقن الوريد الذيل الهيدروديناميكية للكبد حيث قد يكون هذا القيد عامة المتعلقة بمبدأ حقن هيدرودينامية. وعلى نفس المنوال، آخرين قد أظهرت أن حقن الوريد هيدرودينامية الذيل في كبد الفئران تليفية ليست فعالة كالكبد السليم، ولذلك قد يكون من الممكن أن في إعدادات التليف الكلوي حقن هيدرودينامية الحوض الكلوي لن تكون فعالة، ولكن لم يكن هذا اختبار مباشرة¹⁷.
2. إعداد الفئران والمحاقن الحمض النووي لإجراء عملية جراحية.
   1. تخدير الفئران مع الكيتامين وإكسيلازيني.
      1. وضع معدات الوقاية الشخصية الصحيحة المطلوبة من مرفق الحيوان، مثل مختبر المتاح المئزر وقناع الوجه الجراحي وقفازات النتريل.
      2. العمل مع الفئران 2-4 في وقت واحد، تزن كل الماوس في كوب بلاستيك 500 مل على نطاق ودقة إلى 0.1 غ. حساب المبلغ الصحيح من 24 ملغ/مل xylazine الكيتامين و 2 ملغ/مل مخففة في العادية المالحة 0.9% بإدارة كل الماوس عن طريق الحقن داخل (انظر الفيديو المشار إليه لمزيد من المعلومات حول الحقن داخل) ¹⁸-استخدام الصيغة (50 ميليلتر + ((5 µL) × (الوزن (ز)))، أو بدلاً من ذلك حساب وفقا لصيغة أخرى بعد التشاور مع فريق بيطري محلي وإياكوك.
      3. حقن الماوس عن طريق الحقن داخل بالتقنيات القياسية. ضع الماوس في دلو ورق حتى الماوس غير متحرك.
         ملاحظة: الفئران على استعداد لإجراء عملية جراحية عندما لم تعد تستجيب لاختبار تو-رشة. اختبار إعطاء الفئران التي تواصل الاستجابة لتو-رشة 20-30 دقيقة بعد حقن الأولى 20-60 ميليلتر أكثر مخدر، اعتماداً على قوة الاستجابة.
      4. مكان الماوس على لوحة توزيع المياه حرارة مغطاة لوحة زرقاء ومرهم vet مكان في كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
   2. يحلق الجانب الأيسر من الجزء الخلفي الماوس من الكتف إلى الردف والجناح للعمود الفقري مع ماكينة حلاقة تصميم للحيوانات الأليفة الاستمالة. إزالة الشعر فضفاضة والحطام.
   3. إعداد حقنه منفصلة تحتوي على 100 ميليلتر من الحمض المخفف لكل الماوس أنيسثيتيزيد، مع التأكد من وجود لا فقاعات الهواء.
      1. استخدام حقنه الأنسولين 29 عقيمة x ½ "0.5 مل U-100 بإبرة مرفقة بصفة دائمة دون سلامة.
         ملاحظة: نوع المحاقن ذات أهمية حاسمة. يسمح هذا المقياس لحقنه بسرعة. إبرة المرفقة بشكل دائم يمنع تسرب الحل. وجود للسلامة سوف تعوق الوصول إلى الحوض الكلوي. المحاقن المحددة في "الجدول المواد" تنزلق أكثر بالتساوي خلال الحقن من الماركات الأخرى اختبار.
      2. تحميل المحاقن ميليلتر ~ 120 وسحب المكبس إلى أسفل خلق فراغ في الجزء العلوي. اضغط بقلم حتى جميع الهواء فقاعات صعود إلى الأعلى. بدقة يمسك الإبرة، كساد المكبس لإزالة جميع الهواء حتى أشكال المعالجة تجميعية في غيض الإبرة. لا ينبغي أي فقاعات المرئية الحالية، كهذه قد يسبب انسداد جوية التي سوف يقتل الحيوان.
      3. الانتهاء من الاكتئاب المكبس حتى يكون هناك 100 ميليلتر في المحاقن بإفراغ الزائد الحمض النووي حل إلى [ميكروفوج] أنابيب الأصلي. التسمية إذا لزم الأمر ومكان الحقن المحمل على ثني عقيمة للحفاظ على العقم إذا كان مرفق حيث يتم تنفيذ العمل لا تسمح باجمال للابر بعناية.
3. إجراء عمليات جراحية حقن.
   1. إعداد الموقع لعملية جراحية. مكان ثني عقيمة على لوحة الحرارة والأدوات الجراحية العقيمة فارغة إلى ثني العقيمة دون لمسها. التقاط الماوس، ثم ضعه في مجال الرؤية. ضبط الإضاءة لإلقاء الضوء على المنطقة.
   2. إزالة ثلاثة الكلورهيكسيدين 3.15 في المائة غلوكونات و 70% كحول الأيزوبروبيل الجلد مطهر مسحات من الحزم والقرب من الحيوان.
   3. تغيير القفازات الجراحية المعقمة. العمل في بداية حركة دائرية في موقع شق، مسحه الحيوان مع مسحه الكلورهيكسيدين/الكحول جديد ثلاث مرات.
   4. موقع شق كما هو مبين في الشكل 1 ألف. معسر الجلد بملاقط، استخدام مقص لجعل قطع الجلد طبقة حوالي 1 سم من العمود الفقري، وأدناه في القفص الصدري. مرة واحدة موقع قطع طولها حوالي 1 سم، جعل موقع قطع مماثلة أدناه، في طبقة العضلات.
      ملاحظة: جعل الشق الطول الصحيح للسماح الكلي بالكاد تأتي من خلال الشق وثم توضع في مكان بشق نفسها. لا يمكن أن تتعرض شق صغير جداً والكلى؛ كبير جداً وسوف تنزلق الكلي باستمرار العودة إلى تجويف البطن.
   5. قم بتحديد موقع الكلي.
      ملاحظة: قد يكون تظهر بين الأنسجة الدهنية البيضاء. كما يقع الطحال في الجانب الأيسر من الحيوان. اللون من هذه الأجهزة يمكن أن تكون بصريا متباينة، كما الطحال مارون الظلام بينما الكلي أحمر-برتقالي داكن. ليس من المرغوب فيه للتلاعب في الطحال كما أنه يمكن أن يتمزق بسهولة.
   6. دون لمس الكلي، بلطف يعرض عليه من تجويف البطن بالضغط المطرد، ولطيف على البطن بالاصابع (الشكل 2). استخدام الملقط مغلقة بلطف دفع الأجهزة غير مرغوب فيه مرة أخرى في البطن إذا لزم الأمر. عدم استخدام الملقط مفتوحة كهذه قد تضر الكلي أو الأجهزة الأخرى.
   7. بمجرد الخروج من البطن الكلي، منفصلة بلطف من المناطق المحيطة الدهون ما يكفي لتصور الحوض الكلوي، نقطة بيضاء صغيرة (الشكل 1B). دفع الدهون الزائدة إلى جانب واحد أو إزالتها إذا لزم الأمر. تأكد من عدم إزالة الغدة الكظرية، يقع بالقرب من القطب العلوي للكلى، أو كبسولة الكلي.
   8. استخدام مغلقة الملقط لدفع أسفل الجانب الأيمن من الكلي حتى يظل الحوض الكلوي في العرض، فهم حقنه الأنسولين محملة باليد اليمنى وإجراء موازيا للسطح العامل مع الإبرة وأشار في الحوض الكلوي (الشكل 2E). أدخل الإبرة بعناية في الحوض الكلوي الكلي المعطل تداولها كما هو مبين في الشكل 1 باء.
   9. حقن الحل بسرعة داخل s الثلاثة. قد مسح حوالي ثلث الكلي وتغيير اللون إلى الأبيض.
      ملاحظة: من الشائع ملاحظة تراكم السوائل في حقن التالية كبسولة الكلي، فضلا عن تشكيل ورم دموي. اللازمة لتحقيق مستوى كاف من تعداء الحمض النووي للكشف عن بعض الأضرار.
   10. الاحتفاظ الإبرة في المكان لحوالي 10 ثانية لمنع الدفق الحل. ثم إزالة بعناية وبطء الإبرة. العودة أغلقت الجهاز تجويف البطن التي تمتد في موقع شق بلطف واستخدام الملقط.
   11. خياطة طبقة العضلات الحيوان بخيوط قابلة للامتصاص 5-0، وضع عقده مستقلة 2-4.
   12. خياطة طبقة الجلد من الحيوان مع خيوط النايلون غير امتصاص 5-0 أو 6-0، وضع عقده مستقلة 2-4.
       ملاحظة: يمكن إعادة استخدامها بعد وضع في حمام حبة معقمة الأدوات الجراحية وتبريده.

رقم 1. الموضع الصحيح شق الموقع وابرة لحقن الحوض الكلوي هيدرودينامية. A) ينبغي أن تكون الشق (الخط الأحمر) يقع حوالي 1 سم من العمود الفقري، وحوالي 1 سم تحت القفص الصدري الماوس. ب) بعد تعرض الكلي عن طريق شق الجناح، ينبغي أن يكون الحوض الكلوي يقع ميدواي نقطة واضحة/أبيض مصفر صغيرة أسفل الكلي. ينبغي عدم الإزعاج الحقن في الوريد الكلوي أو الشريان الكلوي أو الحالب. الإبرة لحقنه الأنسولين يتم إدراجها مباشرة في الحوض الكلوي كما هو موضح بعمق حوالي 0.5 سم والاكتئاب بسرعة في 2-3 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. الخطوات الجراحية لإجراء حقن بلازميد الحمض النووي هيدرودينامية الحوض الكلوي. A) الملقط قرصه الجلد لتسمح للجراح لجعل شق الجناح ~ 1 سم مع مشرط، أولاً من خلال طبقة الجلد، ثم من خلال طبقة العضلات. ب) استخدام اثنين من أزواج من الملقط مغلقة لفتح الجرح الجراحي، الكلي هي تصور داخل البطن إذا كان ذلك ممكناً. ج) مع ضغط لطيف على البطن، دون لمس أي الأجهزة مباشرة، يتعرض الكلي من خلال شق الجناح. د) يتم تشريح الدهون بلطف من الكلي، تحريكه أقل قدر ممكن لتحقيق الوصول إلى الحوض الكلوي. ﻫ) الضغط على الجانب الأيمن من الكلية اليسرى بشكل أفضل تصور الحوض الكلوي، يعقد المحاقن مع الإبهام على خافضة ويتم وضع الإبرة بعناية ولكن بثبات إلى الحوض الكلوي. و) التالية < يمكن ملاحظة 3 حقن s، مسح في مجالات الكلي التي تلقت الجزء الأكبر الحقن. ز) وتستخدم خيوط قابلة للامتصاص فيكريل الأرجواني العقيمة جعل عقده مستقلة 2-4 في طبقة العضلات. ح) وتستخدم خيوط النايلون أزرق العقيمة غير الامتصاص جعل عقده مستقلة 2-4 في طبقة الجلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4. الشفاء من عملية جراحية والرصد بعد العمليات الجراحية.
   1. تزويد الفئران بمسكن وفقا لمتطلبات المؤسسة IACUC للسيطرة على الألم. على سبيل المثال، إدارة البوبرينورفين بالحقن تحت الجلد كل 8-12 ساعة في حالة ح 48 قد إذا كان الضرر الكلي ذات الصلة بالأدوية المضادة للالتهاب التي ينبغي تجنبها للدراسة.
   2. الحفاظ على الفئران في حرارة وسادة وحضره المحقق حتى الجوال تماما مع ريكومبينسي القصية. عندما تسترد بالكامل، تعود الفئران إلى قفص نظيفة تحتوي على كمية صغيرة من الفراش من على القفص المنزلية للحد من التوتر. هل الفئران البيت لا تخضع لعملية جراحية مع الفئران ساذجة.
      ملاحظة: حالة الفئران ستتحسن بسرعة، التي تظهر أن يكون السلوك العادي داخل ح 24-48.
   3. إعطاء السوائل الملحية وزيادة التسكين للفئران التي تظهر شدد على تحسين حالتهم. في حالة عدم استعادة الفئران بسرعة، قياس وزن الماوس، و euthanize الفئران التي فقدت أكثر من 20% وزن الجسم الأولية. Euthanize الفئران التي تظهر يوريمي أو خلاف ذلك تحتضر. وترد في الجدول 1المشاكل الصحية المحتملة.
      ملاحظة: إزالة الفئران أحياناً خيوط الخارجي أو تأتي فضفاضة قبل إغلاق الجرح خياطة الجروح. يمكن أن يؤدي فتق في موقع شق، يتبين من انتفاخ خياطة الفقراء طبقة العضلات مع طبقة جلد سليمة. وفي مثل هذه الحالات، ضع الماوس تحت التخدير (isoflurane أسرع من الكيتامين/إكسيلازيني) وإصلاح الموقع الجراحي بخيوط جديدة في أقرب وقت ممكن. إذا بقيت خيوط غير امتصاص الجلد بعد 10-14 يوما، بإزالتها. أحياناً قد الفئران إزالة خيوط القفص أقرانهم أو القتال. إزالة الفئران المعتدي إلى القفص الخاصة بهم مع الإثراء لمنعهم من إيذاء الفئران الأخرى حالما يتم التعرف على مثل هذا السلوك.
   4. عندما يتم التوصل إلى الصحة أو نقاط النهاية التجريبية، euthanize الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون أو جرعة isoflurane متبوعاً بطريقة ثانوية للقتل الرحيم مثل التفكك عنق الرحم وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للقتل الرحيم في مكان في المؤسسة

السبب	بداية	عدد الفئران المتأثرة	أعراض	اتخاذ إجراءات فورية		الحل الطويل الأجل
اندوتوكسينس الحمض النووي الواردة	6-40 ح بعد انتهاء الحقن.	يحتمل أن تؤثر على كل الماوس نظراً لإعداد الحمض النووي الملوثة.	مشاكل في التنفس، علامات الألم الشديد، وفشل الجهاز، والموت.	Euthanize الفئران المتأثرة. اختبار كل مكون من مكونات حقن ل endotoxins مع "ليمولوس أميبوسيتي ليستي".		استخدام مجموعات ماكسيبريب خالية من الذيفان والمختبرات الطبية فقط العقيمة وجديدة أو معاملة هيدروكسيد الصوديوم. استخدام المخزن مؤقت تجارياً التي تم شراؤها، واختبار الذيفان إلى تمييع الحمض النووي.
جرعة زائدة من التخدير	أثناء الجراحة، سواء قبل أو بعد حقن الحمض النووي.	قد تؤثر على الفئران الأصغر سنا أو أصغر حجماً فقط.	توقف التنفس بينما في pad تدفئة، التبول.	إنقاص التخدير للفئران المتبقية.		التحقق من صحة إعداد وبروتوكول لدقة الجرعة. استبعاد "رونتس." استشر البيطري إذا استخدمت الجرعة المناسبة.
فقاعة هواء في المحاقن أو الإبر المستخدمة للحقن	مباشرة بعد حقن الحوض الكلوي.	إلا إذا تم تحميل جميع المحاقن بلا مبالاة، وهذا يؤثر على الماوس واحد فقط.	يلهث للتنفس.	تحقق من المحاقن المتبقية لعلامات فقاعات الهواء.		يعد الحقن بعناية، التنصت المحاقن لإزالة الفقاعات في الجزء السفلي. تحسين ظروف الإضاءة شكل أفضل تصور فقاعات.
افتتاح موقع الجراحية	12-72 ح بعد الحقن	واحد أو أكثر من الفئران. في بعض الأحيان القفص كامل.	خطيئة الجرح، عادة لا محنة أخرى	كرر خياطة لإصلاح الجرح بعناية تحت التخدير إيسوفلوراني مع تقنية العقيمة. قد تحتاج إلى ري مع المالحة أو إزالة حدود الجرح مع المقص.		إذا كان لدى الفئران كل خيوط قصيرة جداً أو مفقودة، قد يكون هناك واحد الماوس إزالتها، حيث يمكن فصلها الفئران. تحسين تقنية خياطة. استخدم عقده مستقلة.
فتق في موقع العمليات الجراحية	48 + حقن بعد ح	واحد أو أكثر من الفئران.	التلة مرئياً في موقع الجراحية.	تحت التخدير إيسوفلوراني مع تقنية العقيمة، قطع الجلد تلتئم لتكشف عن فتق طبقة العضلات. استبدال الأجهزة في الصفاق وإصلاح طبقة العضلات مع خيوط قابلة للامتصاص وإغلاق الموقع.		يشير هذا إلى ضعف خياطة طبقة العضلات. تحسين تقنية خياطة. استخدم عقده مستقلة.
الفشل الكلوي	48 + حقن بعد ح	واحد أو أكثر من الفئران.	فقدان للوزن > متحدب 20%، ربما تصبح يوريمي، الموقف	توفر المياه المالحة وزيادة أو إطالة التسكين. إذا لوحظ أي تحسن، التضحية الفئران المتأثرة.		تغيير حالة المرض من الحيوان لجعله أقل حدة. تغيير التحوير لتكون أقل قوية أو إيندوسيبلي. حقن الفئران في تيميبوينت سابقة في تطور المرض.
Abcess أو الإصابة	أيام إلى أسابيع بعد الجراحة	واحد أو أكثر من الفئران.	أبسيس ملموس أو علامات الانتان	Euthanize الفئران المتأثرة. طلب نيكروبسي لتأكيد الإصابة المشتبه فيها.		قد يحدث هذا عندما لا تكون الظروف الجراحية والحقن المعقمة بما فيه الكفاية. الإجراء الموضح للفئران مع جهاز مناعة طبيعية ولكن يجب اتخاذ المزيد من الاحتياطات في إعداد الحيوانات المناعة مثل تلك تعامل مع السيكلوفوسفاميد.

الجدول 1. جدول مشاكل الصحية المحتملة أثناء البروتوكول حقن الحوض الكلوي. على الرغم من المشاكل الصحية المذكورة ليست شائعة، وهناك عدد من الأخطاء المتعلقة بالمحقق الذي يمكن أن يحدث أثناء سير الإجراءات. قد يكون هذا الجدول للمساعدة في منع وتشخيص المشاكل الصحية، وكذلك لتنفيذ العلاجات الممكنة لمنع هذه المشاكل من الحدوث في المستقبل. مع الممارسة، يجب أن نتوقع المحققين المشاكل الصحية الشائعة والوفيات بسبب هذا الإجراء.

3-تقييم آثار حقن الكفاءة والتحوير

1. استخدام مقايسة متطورة للتحوير المرغوب لتقييم كفاءة تعداء. استخدام عناصر تحكم الإيجابية والسلبية بعناية للتأكد من المقايسة محددة.
   ملاحظة: اعتماداً على اختيار المروج، الفئران المحتمل سيكون أقوى تعبير التحوير "يوم واحد"؛ دائماً خلال الأسبوع الأول بعد الحقن.
2. القيام بتصوير الحيوانات الحية من لوسيفراس بإدخال 10 ميكروغرام من بلازميد معربا عن لوسيفراس مثل لوسيفراس اليراع المعززة للحمض المخفف للحقن.
   1. قم بتنظيف جميع الأسطح المعرضة للفئران. ضع القفص أول من الفئران في الغرفة وختم أنها أغلقت. ضمان وجود ما يكفي إيسوفلوراني للتجربة عن طريق التحقق من سعة؛ إذا لم يكن الأمر كذلك، إضافة إيسوفلوراني حتى تصل إلى المستوى خط "كحد أقصى". بدء تدفق إيسوفلوراني بتشغيل الاتصال الهاتفي isoflurane إلى 3.5 والأكسجين إلى 2.
   2. حقن كل الماوس عن طريق الحقن داخل مع 100 ميليلتر من لوسيفرين المذابة 30 ملغ/مل. تسجيل الوقت.
   3. قم بفتح البرنامج للسيطرة على آلة التصوير بالنقر فوق رمز الماوس البرتقالي والأصفر. ضمن حدد/إضافة "معرف المستخدم"، اختر الأحرف الأولى الصحيحة من القائمة المنسدلة بجوار "معرف المستخدم". انقر فوق "موافق". على شريط القوائم في الأعلى، انقر فوق "شراء" وحدد "حفظ تلقائي للبريد إلى..." من القائمة المنسدلة. حدد المجلد أو قم بإنشاء مجلد جديد لحفظ البيانات إلى.
   4. انتقل إلى مربع اقتناء الصورة في الزاوية السفلي اليسرى. تأكد من أن الإعدادات التلقائية كما يلي: Binning، والمتوسط؛ و/إيقاف، 1 للإنارة، 8 للصورة؛ تصفية الانبعاثات، مفتوحة؛ تصوير الوضع، يتحقق بجوار الإنارة وصورة فوتوغرافية وتراكب والمحاذاة فقط. انقر فوق "تهيئة" لتهيئة النظام والانتظار للتهيئة لإنهاء، ثم تغيير "مجال الرؤية" إلى "هاء" صورة الفئران خمسة.
   5. تشغيل الصمام لأنابيب التخدير أن نوسيكونيس داخل الجهاز بإدارة إيسوفلوراني. مكان الحيوانات داخل آلة التصوير في الترتيب المطلوب على بطونهم بظهورهم التي تواجه الكاميرا المذكورة أعلاه لتصور الكلي. إذا كان قفص واحد أو أكثر تصويرها، ضع القفص القادم في قاعة إيسوفلوراني.
   6. 5-10 دقيقة بعد حقن لوسيفرين، اضغط "اكتساب" أخذ الصورة.
   7. على "لوح أداة" على الجانب الأيمن، انقر فوق "ضبط الصورة." تحت "مقياس اللون،" تقليل شريط "دقيقة" حتى التعبير الواضح في جميع الفئران المتوقعة، تصور الأرجواني على كل الكلي الماوس. إذا كان لا تظهر أي الفئران التعبير، نحثهما الفئران مع 100 ميليلتر من لوسيفرين والانتظار على الأقل 3 دقيقة قبل ريككويرينج.
      1. إذا كانت الصورة قد المشبعة بكسل، تقليل زمن التعرض والحصول مرة أخرى للحصول على صورة كمية كما سيؤدي إلى التقليل من كفاءة تعداء وجود مشبعة بكسل. أقل من زمن التعرض المحتمل هو 0.5 s.
      2. إذا كانت الصورة تظهر فقط التعبير الجيني باهتة في التعرض للمرة الأولى، زيادة وقت التعرض ما يصل إلى 2 دقيقة وحيازة. في كل مرة يتم استعادتها الصورة، هي البيانات تم الحفظ في المجلد الذي تم اختياره حتى جميع الصور متاحة لمزيد من التحليل في وقت لاحق.
   8. كرر الخطوات من التصوير أقفاص اللاحقة من الفئران.
   9. إزالة الفئران من آلة التصوير. إيقاف الغاز. تنظيف الغرفة، نوسيكونيس، ومرحلة التصوير. قم بإغلاق البرنامج الحاسوبي.
      ملاحظة: البرنامج سوف يطلب إلى "حفظ البيانات". وهذا يشير إلى تلاعب إلى dataset، وليس البيانات نفسها.
      1. انقر فوق "نعم" لحفظ التغييرات إلى الجدول والمناطق ذات الاهتمام (رويس). انقر فوق "لا" للعودة إلى الإعدادات الأصلية للصور.
   10. لتحليل البيانات، قم بفتح البرنامج. في لوحة "أداة" انقر فوق "أدوات العائد على الاستثمار". انقر على أيقونة دائرة، وانقر فوق "1" في القائمة المنسدلة إلى مكان عائد جديدة في نافذة الصورة كما هو مبين بشكل بيضاوي أحمر مع المربعات الأربعة حوله. قم بضبط حجم العائد على الاستثمار بوضع مؤشر الماوس فوق مربع أحمر وسحب لإحاطة منطقة الأرجواني وتتراكب الكلي حقن.
       1. مع المؤشر فوق مربع أحمر في العائد على الاستثمار، انقر بالزر الأيمن ثم اختر "تكرار ROI" لإنشاء عائد جديدة في نافذة الصورة وتحريكه بالماوس القادم. كرر الإجراء حتى يكون جميع الفئران في الصورة العائد على الاستثمار الكلي حقن.
       2. في القائمة أعلاه الصورة مباشرة، بتغيير "وحدات" من "التهم" إلى "التألق (الفوتونات)." لتصدير البيانات العائد على الاستثمار، في "لوح ألوان أداة"، انقر فوق "أدوات العائد على الاستثمار" ثم انقر على أيقونة قلم رصاص/المسطرة لإنشاء جدول بيانات القياسات. استخدام قياس "متوسط الإشراق" في مزيد من التحليل في برنامج التحليل والإحصاءات بيانات الاختيار.
3. القيام بتلوين الأقسام ك وصف¹¹.
   ملاحظة: الحقن لا ترانسفيكت الكلي الكامل على قدم المساواة حتى الأقسام المختلفة سيتم التقاط تعداء مختلف الكفاءات¹¹. حقن المشارك من الخرز مثل مطاط الفلورسنت الجزئي المجالات الخرز الصغير قد تساعد في تحديد المناطق التي يتوقع أن يكون التحوير-إيجابية (الشكل 3D)¹¹. الأمثل للبروتوكول المصبوغة مهم للغاية.
4. أداء وصمة عار الغربية لتحديد جينات الفائدة في الكلي transfected.
   ملاحظة: يجب أن يتم حصاد أجهزة لمستخلصات البروتين على الجليد. مرة أخرى، لا تستخدم شريحة صغيرة من الجهاز كهذا المجال قد لا يكون تم transfected جيدا. تعداء موزعة في جميع أنحاء الجهاز حتى الجمع بين مختلف المناطق وتجمع لهم. حقن بلازميد إنتاج ارثروبويتين هرمون هيدرودينامية الحوض الكلوي أدى ارتفاعا متواضعا في الهيماتوكريت، ولذلك فمن المتوقع أنه ينبغي إيجاد منتجات التحوير يفرز في تداول¹¹.
5. للتعبير الرفيع المستوى طويل الأجل المتسلسلات، الجمع بين نظام ناقل إدماج العوامل المثبطة للمناعة مثل السيكلوفوسفاميد. الاستجابة المناعية للتحوير يحدث خلال الأول عدة أسابيع بعد الحقن و قوية¹¹.

النتائج

تقنية الجراحة وحقن بسيطة لأداء يتقن مرة واحدة، تتطلب لا معدات رئيسية أو مواد مكلفة. يوم واحد من التدريب على الفئران عدة المقرر للقتل الرحيم إذا جديدة إلى جراحة الكلي شق الجناح، ينبغي أن يسمح فيها الفئران ليست الجراحة التالية تم استردادها لأن المحاولة الأولى في هذه العمل?...

Discussion

ويرد في هذا البروتوكول وسيلة قوية لتحقيق التعبير الجيني استنساخه على وجه التحديد في الكلي. في أيدي جراح معتدلة من ذوي الخبرة وجدنا النسبة المئوية للفئران ترانسفيكتيد بهذا الأسلوب في نطاق 50-100 ٪، تبعاً للعمر الماوس وحساسية قراءات للتحوير. مستوى التعبير الجيني لوسيفراس فوق الخلفية لعدة أشه...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947	Anesthetic - Not controlled substance
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch	Cardinal Health	309306	Required syringes
Buprenex	Pharmacist/Veterinarian		Analgesia - Controlled Substance
Dynarex Disposable Towel Drape	Thermo Fisher Scientific	19-310-671	Place over heat pad
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Use only endotoxin-free plasmid DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control	Charles River	PC200	Positive control for endotoxin test
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial	Charles River	R13500	Endotoxin test
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5882	Surgical tool
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9"	Thermo Fisher Scientific	01-812-51	For autoclaving surgical tools
Gaymar Heat Pump	Paragon Medical	TP-700	Water-circulating heat pump
Germinator 500	Roboz Surgical Instrument	DS-401	To reuse surgical tools during surgery
Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5136	Surgical tool
Graefe Tissue Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5153	Surgical tool
Halsey Needle Holder, 5" Length	Roboz Surgical Instrument	RS-7841	Surgical tool
Heat pads - 15" x 21" - need at least 3	Paragon Medical	TP22G	For use with Gaymar Heat Pump
IsoFlo (Isoflurane, USP)	Abbott Animal Health	5260-04-05	For imaging and euthanasia
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor	Smiths Medical	VCT3K2	For imaging and euthanasia
Ketamine	Pharmacist/Veterinarian		Anesthetic - Controlled Substance
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Laboratory tissues
Living Image software	Caliper Life Sciences		For live animal imaging
Luciferin	Perkin Elmer	122796	For live animal imaging
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000-US-CAN	Spectrophotometer for DNA measurement
Prevantics Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-100-110	For skin surgery prep
Prolene 5-0 sutures Taper 30"	Thermo Fisher Scientific	NC0256891	Non-absorbable sutures for skin
Puralube Brand Opthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	To keep eyes moist during surgery
Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution	Mirus Bio	MIR-5240	Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA
Vicryl 5-0 Sutures J303H	Thermo Fisher Scientific	NC9816710	Absorbable sutures for muscle layer
Wahl Mini Arco Clipper	Med-Vet International	8787-1550	Shaver for skin prep
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences		For live animal imaging