Hidrodinamik Renal Pelvis enjeksiyon böbrek proteinlerin Non-viral ifade

Özet

Bu iletişim kuralı yoluyla renal pelvis transgene özellikle böbrek ifadede üretmek için fare böbrek içine plazmid DNA enjekte yöntemi açıklanır.

Özet

Hidrodinamik enjeksiyon plazmid DNA ve diğer maddeler ile çeşitli dokularda transfect için yerel, yüksek basınçlı bir ortam oluşturur. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon, örneğin, hangi karaciğer transfected iyi kurulmuş bir yöntemdir. Bu el yazması plazmid DNA için böbrek özel gen ekspresyonu ile doğrudan fare böbrek iğne ile bir uygulama hidrodinamik ilkeleri açıklar. Fareler anestezi ve böbrek renal pelvis doğrudan bir plazmid DNA içeren çözüm hızlı bir iğne ile takip bir kanat kesi tarafından yararlanılır. İğneyi yerinde on saniye tutulur ve kesi sitesi dikmiş. Ertesi gün, hayvan görüntüleme live, Western blot veya immünhistokimya gen ekspresyonu tahlil için kullanılabilir veya diğer deneyleri seçim transgene için uygun faiz protein tespiti için kullanılır. Gen ifadesinin uzatmak için yayımlanmış yöntemleri transgene için bağışıklık yanıtını inhibe transposon-aracılı transgene entegrasyon ve siklofosfamid tedavisi içerir.

Giriş

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon tekniği gen ekspresyonu fare karaciğer^1,2yüksek düzeylerine ulaşmak için yaygın olarak kullanılan bir yol haline gelmiştir. Böbrekler de bu tekniği çok daha alt bir düzeyde, yaklaşık 100-fold daha az³ile transfected. Burada açıklanan hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon organ ifade daha önce karaciğer⁴' te^{,5 kurulmuş aynı hidrodinamik ilkeleri kullanarak fiziksel yollarla özgüllük denetlemek için basit bir yol sağlar} , kas⁶ve diğer organları^7,8. Basınç kullanarak canlı hayvan vivo içinde hücrelerde bu yöntem transfects ve aynı anda hızlı bir şekilde organ hasar inducing sıvı içeren DNA hücre zorlamak için hız⁹çözüldü. Tarafından insülin şırınga ile birlikte tek bir enjeksiyon kanat kesi¹⁰ üzerinden böbrek görselleştirmek için köklü cerrahi teknikleri kullanarak, çeşitli böbrek hücre, interstisyel fibroblastlar esas olarak başarılı transfection bulduk, tübüllerin ve toplama kanal¹¹. Bu fareler diseksiyon diğer organ görüntüleme teknikleri¹¹luciferase tarafından görselleştirmek için yüksek düzeyde transfected değil göstermiştir. Teknik olmayan viral olduğu için plazmid DNA kullanımına transfection için enjeksiyon için gerekli reaktifler hızlı ve kolay hazırlanması izin verir.

Antioksidan glutatyon S-transferaz A4, insülin benzeri büyüme faktörü-1 reseptör ve böbrek beklenen biyolojik etkileri^11, ile tüm hormon Eritropoetin ifade için yerelleştirilmiş hidrodinamik iğneleri kullandık ^{12 , 13}. yönetim, enjeksiyon hacmi, DNA dozaj ve organizatörü seçim rotanın ayrıntılı değerlendirme gerçekleştirilen¹¹oldu. Ayrıca, bağışıklık reaksiyonu transgene için bastırmak için her iki piggyBac transposon sistemi ve/veya siklofosfamid tedavisi gösterilmiştir uzun vadeli gen ifadesi sonuçlar¹¹geliştirmek için. Diğer araştırmacılar renal ven yaklaşım saat bir ay¹⁴daha büyük bir süre için yüksek transfection verimliliği elde başarı, fareyle kullanmışlardır. Ancak, genetik insan hastalığı taklit fenotipleri düzeltilmesi genellikle yapılma farelerde ilk kanıtı-of-concept olarak en memeli genetik modellerini fare modelleri olduğundan. Renal ven enjeksiyon renal pelvis enjeksiyon için karşılaştırıldığında ve renal pelvis içine enjeksiyon renal ven gen ekspresyonu (yaklaşık on daha yüksek) ve hayatta kalma¹¹için daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. Renal pelvis idrar üretim dalgalanmalar tolere esnek olduğu için böbrek girdiği ideal bir yoldur ve sık sık ne zaman bile hydronephrosis sırasında genişlemiş, yapısal bütünlüğünü korumak yapabiliyor. Ayrıca, renal pelvis içine enjeksiyon böbrek böbrek kapsülü enjekte sıvı gözle görülür tarafından böbrek intraparenchymal enjeksiyon iyi korunabilmesi izin, piercing olmadan erişebileceğini. Diğer fare organlara girişinin damarlara dışında bir yol var mı ama bir ideal enjeksiyon izi böbrek idrar alanıdır. Ayrıca, renal ven içine enjeksiyon karın boşluğuna kan sızıntı sonuçlandı. Vahşi tipi fare böbrekler toplam böbrek hacmi yaklaşık 0.2 cm³, tek böbrek hacmi yaklaşık renal pelvis tarafından hidrodinamik enjekte sıvı miktarı eşittir olmak manyetik rezonans görüntüleme tarafından tahmin edilmektedir enjeksiyon (100 µL)¹⁵. Burada, tüm böbrek tekrarlanabilir transfection elde etmek için hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon protokolünün detaylı nüanslar mevcut yaptık.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUCs) Baylor College of Medicine ve Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. DNA çözüm enjeksiyon için hazırlayın

1. Dikkatle transfection etkinliği ve transgene ifade geliştirmek için arzu edilen özellikleri en üst düzeye çıkarmak için transgene(s) ifade etmek için plasmid(s) seçin.
   Not: Yukarıda açıklanan¹¹hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon plazmid floresan işaret TdTomato, hormonu Eritropoietin (Epo) ve ateş böceği luciferase ifade edilmiştir. Transfection verimlilik transgene için için iyi gelişmiş bir tahlil yoksa, luciferase canlı hayvan görüntüleme seyreltilmiş DNA enjeksiyon için luciferase ifade plazmid gelişmiş ateş böceği luciferase gibi 10 µg tanıtarak gerçekleştirin.
   1. Pratik uygulamaya en küçük plazmid seçin.
      Not: Küçük plazmid genellikle hücreleri büyük plazmid daha iyi transfect. Plazmid omurgasında bu unsurları kullanarak plazmid boyutu azalacak böylece örneğin, çoğaltma R6K kökeni ve zeomycin direnç gen, küçüktür.
   2. Bir memeli organizatörü üzerinden transgene hızlı.
      Not: transfected, böbrek hücre tipi gen ifade uzunluğunu ve gen ekspresyonu gücünü tüm organizatörü isteyerek etkilenecektir. Woodard ve arkgörmek. Sitomegalovirüs karşılaştırması için (CMV; bünye viral), uzama faktör-1 alfa (EF-1α; bünye endojen), gama-glutamil transferaz (γGT; tübül özgü) ve podocin (NPHS2; podocyte özgü)¹¹.
   3. Eğer uzun vadeli gen ifade katlara arzu edilen^11,16Transpozonlar gibi bir viral entegre sistemi kullanır. Erken sonuçlar 5 gün sonrası enjeksiyon daha az ile daha fazla çalışmalar için transgene gereksiz bütünleşmesidir.
2. Plazmid DNA bir endotoksin-Alerjik maxiprep kiti gibi ticari bir yöntemle enjeksiyon için hazır olun. Dikkatle endotoxins aygıtlar üzerinden tanıtan kaçının.
   Not: DNA çözüm endotoxins varlığı konu hayvan, şiddetli bir bağışıklık yanıtında deneme ödün ve muhtemelen hayvan öldürmek temin.
   1. Son DNA izolasyon yıkama adım tamamlandıktan sonra hiçbir etanol görsel muayene ve koku tarafından sol emin olun. Jel-yükleme ipuçları görünür damla kaldırmak için kullanın. DNA Pelet laboratuvar hassas görev silecek dokulara oda sıcaklığında veya sürekli izlenmesi ile 37-60 ° C fırında üzerinde baş aşağı içeren tüpler kuru. Sonra kalan etanol Pelet •kızılötesi önlemek için hemen buharlaşıp vardır Pelet resuspend.
      Not: Artık etanol DNA toplama Spektrofotometre okuma ile müdahale ve böbrek giriş arzu değil.
   2. Enjeksiyon (hidrodinamik teslim arabellek; 100-300 µL) DNA arabellek çözüm gruplar arasında kimyasal bileşimi varyasyon sınırlamak için kullanılan DNA Pelet aynı tampon resuspend.
      Not: kit ile geliyor, elüsyon arabellek çözümünde DNA Pelet resuspend değil. Şelat Ajan EDTA yaygın "TE" arabellek hazırlıkları içinde bulunan böbrek ve kardiyovasküler fonksiyonu etkileyebilir. Pelet boyutuna bağlı olarak, yüksek bir konsantrasyon ulaşmak için hidrodinamik teslim arabellek 100-300 µL içinde elute. Tamamen seyreltilmiş DNA'ın son toplama 100 ng/µL (10 µg/fare doz) ve 500 ng/µL (50 µg/fare doz) arasında olacak böylece stok DNA toplama bu aşmalıdır.
   3. Tam olarak DNA Pelet arabellekte resuspend. Pelet hidrodinamik teslim arabellekte özgün tüp, oda sıcaklığında en az bir saat için ya da bir gecede 4 ° C'de DNA tamamen çözülmüş emin olmak için bir steril microfuge tüp aktarma önce bırakın.
   4. Plazmid DNA toplama bir Spektrofotometre veya başka bir kurulan yöntemi ile okuyun.
      Not: Okuma ile ek çoğaltır yinelenen gerekirse yapılmalıdır. 260/280 oranı 1.8 ise hazırlık RNA ile kontamine veya başka bir madde Yani bunu atmak ve DNA'yı tekrar hazırlayın.
   5. Mağaza plazmid DNA enjeksiyon arabellekte bir kılavuzda kutu içinde-20 ° C'de resuspended DNA'ın yıkımı önlemek için dondurucu çözdürün.
      Not: Bu şekilde depolanan, DNA hazırlık uzun yıllar sürecek. Kısıtlama Özet ve özel Jel Elektroforez tarafından DNA bütünlüğünü denetleyin. Sokaktan aşağı sürülür DNA bozulmuş ve gevrek şeritler doğru boyutu üretir DNA-ebilmek var olmak kullanılmış için enjeksiyon sırasında kullanılamaz.
3. Seyreltilmiş plazmid DNA çözüm renal pelvis içine enjeksiyon için hazır olun.
   Not: Denetim düşünün dikkatli bir şekilde gruplandırır. Enjeksiyon kendisi hasara neden olur ve deneysel sonuç¹¹etkileyebilir çünkü birçok çalışma için saf ve tampon salt enjekte denetimleri dahil edilir.
   1. Hidrodinamik teslim arabelleği bankta oda sıcaklığında eluted endotoksin içermeyen DNA çözdürün.
   2. Enjeksiyonları yapmanız için gereken DNA miktarını hesaplamak ve seyreltilmiş DNA her grup için hazırlamak. 10-50 µg plazmid DNA fare başına hidrodinamik teslim arabellek ile 100 µL toplam hacmiyle getirdi, yönetmek.
      Not: Örneğin, 3 fareler 10 µg/fare ile 0,5 µg/µL konsantrasyonu vardır bir DNA plazmid enjekte etmek için hesaplamalarımız şu şekilde olacaktır.
      1. Yaklaşık %20 şırınga ve iğne içinde ölü boşluk yüklemek için ilave olması yeterli DNA çözüm hazırlamak. 3 fareler için bir karışım hazırlamak 3.5 x. DNA kitle çözümde olmalıdır µg içinde hesaplamak. Burada 3.5 = 35 x 10 µg olacağını µg.
      2. Çözüm için enjekte ederek 100 µL fare başına istenen toplam hacmini hesaplamak. Bu durumda, 3.5 = 350 x 100 µL olurdu µL Toplam hacim.
      3. Hisse senedi plazmid DNA ekleyin hacmi hesaplamak. Bu durumda, 35 µg olurdu / 0,5 µg/µL hisse senedi plazmid DNA 70 µL =.
      4. Arabellek istenen (Adım 1.3.2.2) seyreltilmiş DNA hacmi eklendi DNA (Adım 1.3.2.3) stoktan hacmi çıkararak seyreltilmiş DNA çözüm eklemek için hacmi hesaplamak. Bu durumda, 350 µL - 70 µL olurdu = 280 µL hidrodinamik teslim arabellek.
   3. Steril microfuge tüpler laboratuvar bankta steril tekniği ile piyasada bulunan filtre pipet ipuçlarını kullanarak çözümler hazırlamak.
      Not: DNA çözüm hazırlanan ve enjeksiyonları takdirde o gün ortaya çıkması için oda sıcaklığında saklanan. Fare ile soğuk bir çözüm bu onların vücut ısısını düşürür ama ısınma gereksiz olarak enjekte değil.

2. hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon ameliyat

1. Fareler ameliyat için dikkatli bir şekilde seçin.
   Not: Zorlanma özgü farklılıkları değil henüz gözlenmiştir ancak mümkün olabilir. Çoğu enjeksiyonları C57BL/6 veya FVB arka planlar üzerinde olmuştur. Renal pelvis enjeksiyonları en iyi 6-12 hafta yaşlı olan fareler çalışır. Fare 16 haftadan daha büyük, luciferase tarafından %50 başarısızlık oranı kadar görüntüleme belirsiz nedenlerden dolayı mümkündür. Bu hidrodinamik enjeksiyon prensibi ile ilgili genel bir sınırlaması olabilir bu yüzden aynı yaşa bağlı başarısızlık oranı hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonları karaciğere için gözlenmiştir. Aynı doğrultuda, diğerleri hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon içine fibrotik sıçan karaciğer böbrek fibrozis renal pelvis hidrodinamik enjeksiyon ayarlarında kadar etkili olmayacak mümkün olabilir bu yüzden sağlıklı karaciğer etkili değildir göstermiştir ama Bu olmadı doğrudan¹⁷test.
2. Fareler ve DNA şırınga ameliyat için hazırlayın.
   1. Ketamin ve xylazine ile fareler anestezi.
      1. Tek kullanımlık laboratuvar önlüğü, cerrahi yüz maskesi ve nitril eldiven gibi hayvan tesisi için gerekli doğru kişisel koruyucu ekipman koymak.
      2. 2-4 fare ile aynı anda çalışan, her fare bir 500 mL plastik Ölçek 0,1 için doğru bir ölçekte tartmak g. hesaplamak için her fare yönetmek için normal % 0,9 serum fizyolojik içinde mayi enjeksiyonu ile seyreltilmiş 24 mg/mL ketamin ve 2 mg/mL xylazine doğru miktarda (mayi enjeksiyon daha fazla bilgi için bkz: başvurulan video) ¹⁸. formülünü kullanın (50 µL + ((5 µL) x (ağırlığı (g))), veya alternatif olarak IACUC ve yerel veteriner ekibi ile görüştükten sonra başka bir formüle göre hesaplamak.
      3. Fare mayi enjeksiyonu ile standart tekniklerle enjekte et. Fare hareketsiz olduğunu kadar fareyi kağıt kovaya koyun.
         Not: ne zaman onlar artık ayak-çimdik testine yanıt fareler ameliyat için hazır. Toe-çimdik için yanıt vermeye devam vermek fareler 20-30 dk sonra ilk enjeksiyon 20-60 µL daha anestezik, yanıt gücünü bağlı olarak sınayın.
      4. Yer bir ısı su sirküle yastık üzerinde fareyi bir mavi yastık ve yer veteriner merhem kornea kuruma önlemek için her iki gözde ile kaplı.
   2. Evde beslenen hayvan damat için tasarlanmış bir tıraş makinesi ile fare kıç ve omurga için kanat arka omuz üzerinden sol tarafındaki tıraş. Çıkarmak bağsız kıl ve enkaz.
   3. Hava hava kabarcığı yok olduğundan emin yapma seyreltilmiş DNA imzalat her fare için 100 µL içeren ayrı bir şırınga hazırla.
      1. Bir emanet olmadan kalıcı olarak ekli bir iğne ile steril 29G x ½" 0.5 mL U-100 insülin şırınga kullanın.
         Not: Şırınga tipi kritik öneme sahiptir. Bu ölçüm için hızlı bir enjeksiyon sağlar. Kalıcı olarak ekli iğne, çözüm sızdırma engeller. Bir emanet varlığı renal pelvis erişim engel. Malzemeler tablosunda belirtilen şırıngaları daha eşit bir şekilde test diğer markalar daha enjeksiyon sırasında kayma.
      2. ~ 120 µL şırıngaya yük ve üst kısmında bir alan yaratmak için pistonu aşağı çekin. Tüm kabarcıklar yükselişi üst hava kadar kalemle dokunun. İğne dayanabiliyor, dikkatle iğne ucunda bir damlacık oluşturur kadar tüm havayı çıkarmak için dalgıç düşürmek. Orada olmamalı varsa görünür kabarcıkları bunlar hayvan öldürecek bir hava embolisi neden olabilir gibi.
      3. Kalmayıncaya kadar 100 µL şırıngada aşırı DNA çözüm orijinal microfuge tüp içine boşalma tarafından pistonu iç karartıcı bitirmek. Dikkatle gerekirse etiket ve iş gerçekleştirildiği tesis iğnelerden recapping izin vermiyorsa kısırlık korumak için steril bir örtüsü üzerinde yüklü şırıngaları yerleştirin.
3. Enjeksiyon ameliyat.
   1. Site ameliyat için hazırlayın. Steril bir örtüsü onlara dokunmadan ısı pad ve boş steril cerrahi araçlar steril örtü üzerine üzerine getirin. Fareyi kaldırıp ve görüş alanı içinde yerleştirin. Aydınlatma alanı aydınlatmak için ayarlama yapar.
   2. Üç % 3,15 klorheksidin glukonat ve % 70 izopropil alkol cilt antiseptik temizleme bezi gelen paketleri çıkarın ve hayvan yerleştirin.
   3. Steril cerrahi eldivenleri değiştirin. Bir dairesel hareket başlangıçta üç kez kesi yerinde, çubukla hayvan yeni bir klorheksidin/alkol bez ile çalışma.
   4. Şekil 1A' gösterildiği gibi kesi sitesini bulun. Cilt cımbızla pinching, makas cilt yaklaşık 1 cm omurga ve göğüs kafesi altındaki katman bir kesim yapmak için kullanın. Bir kez yaklaşık 1 cm uzunluğunda kesme sitedir, benzer bir kesim sitenin altında kas katmanda olun.
      Not: belgili tanımlık kesme böbrek zar zor belgili tanımlık kesme gelin ve sonra yerde belgili tanımlık kesme tarafından saklanmak izin vermek için doğru uzunluğu olun. Çok küçük bir kesi ve böbrek gösterilemez; çok büyük ve böbrek sürekli karın boşluğuna slip.
   5. Böbrek bulun.
      Not: Beyaz yağ dokusu arasında görülebilir. Dalak de hayvan sol tarafında yer alır. Dalak böbrek koyu kırmızı-turuncu ise koyu kestane rengi olduğu gibi Bu organların rengini görsel olarak, farklı. Kolayca rüptüre gibi dalak işlemek için arzu değil.
   6. Böbrek dokunmadan, yavaşça Karın boşluğundan parmak (şekil 2C) ile karın üzerinde sabit, nazik basınç koyarak maruz kalmaktadır. Yavaşça istenmeyen organları karın gerekirse ertelememi kapalı cımbız kullanın. Bu böbrek veya diğer organlara zarar verebilir açık forseps kullanmayın.
   7. Böbrek karın dışında olduğunda, yavaşça ayrı çevreleyen ondan şişman yeterli renal pelvis, küçük bir beyaz nokta (şekil 1B) görselleştirmek için. Aşırı yağ bir yana itme veya gerekirse kaldırın. Böbrek veya böbrek kapsülü üst Kutbu bulunan böbrek üstü bezi kaldırmak değil emin olun.
   8. Kullanarak böylece renal pelvis görünümde kalır böbrek sağ tarafında aşağı doğru itin, sağ eli ile yüklenen insülin şırınga kavramak için forseps kapalı ve renal pelvis (şekil 2E) sivri uçlu iğne ile paralel çalışma yüzeyi için basılı tutun. Şekil 1Badımında gösterildiği gibi iğne dikkatli immobilize böbrek renal pelvis yerleştirin.
   9. Üç s içinde hızlı bir şekilde çözüm enjekte. Böbrek yaklaşık üçte biri temizleyin ve beyaz rengini değiştirin.
      Not: Böbrek kapsül aşağıdaki enjeksiyon gibi bir hematom oluşumu içinde sıvı birikimi gözlemlemek için yaygındır. Hasar tespiti için DNA transfection yeterli düzeyde sağlamak gereklidir.
   10. İğne için yaklaşık 10 yerde tutmak geri çözüm önlemek için s. Dikkatli ve yavaş iğne kaldır. Yavaşça kesi sitesi uzanan ve kullanarak karın boşluğuna organ forseps kapalı dönmek.
   11. Dikiş hayvan kas tabakası ile 5-0 absorbe dikiş, 2-4 bağımsız deniz mili yerleştirerek.
   12. Dikiş hayvan deri tabakası ile 5-0 ya da 6-0 absorbe olmayan naylon dikiş, 2-4 bağımsız deniz mili yerleştirerek.
       Not: Cerrahi araçlar steril boncuk banyoda koyduktan sonra yeniden ve soğuduktan.

Şekil 1. Doğru kesi mevcuttur ve iğne yerleşim hidrodinamik renal pelvis enjeksiyonlar için. A) belgili tanımlık kesme (kırmızı çizgi)-meli var olmak yaklaşık 1 cm omurga ve göğüs kafesi fare yaklaşık 1 cm yer. B) sonra böbrek kanat kesi yararlanılır, renal pelvis küçük sarımsı açık/beyaz nokta midway böbrek aşağı olarak yerleştirilmemesi gerekir. Enjeksiyon renal ven, renal arter veya üreter rahatsız. İnsülin enjektörü iğne yaklaşık 0.5 cm derinliğe kadar gösterildiği gibi doğrudan renal pelvis eklenen ve hızlı bir şekilde 2-3 s. depresif Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Plazmid DNA renal pelvis hidrodinamik enjeksiyon uygulanacak cerrahi adımları. A) forseps cilt cerrah ~ 1 cm kanat kesi bir neşter ile ilk o zaman kas katmanı yoluyla cilt katmanı üzerinden yapmak izin vermek için çimdik. B) kullanma iki çift cerrahi yara, böbrek açmak için kapalı forseps görselleştirildiği karın içinde mümkünse. C) ile doğrudan, herhangi bir organ dokunmadan karın üzerinde hafif basınç böbrek kanat kesi yararlanılır. D) yağ-nazikçe disseke böbrek bu renal pelvis erişim elde etmek mümkün olduğunca az rahatsız edici. E) basarak sol böbrek daha iyi sağ tarafında renal pelvis görselleştirmek, depressor üzerinde başparmak şırınga düzenlenen ve iğne dikkatle ama sıkıca renal pelvis yerleştirilir. F) aşağıdaki < takas 3 s enjeksiyon enjeksiyon toplu alınan böbrek alanda gözlenen. G) steril mor vicryl absorbe dikişler 2-4 bağımsız deniz mili kas katmanı yapmak için kullanılır. H) steril mavi naylon absorbe olmayan dikişler 2-4 bağımsız deniz mili deri katmanının içinde yapmak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. Kurtarma ameliyatı ve ameliyat sonrası izleme.
   1. Fareler analjezik ağrı kontrolü kurumun IACUC gereksinimlerine göre sağlamak. NSAİİ ile ilgili böbrek hasarı çalışma için kaçınılması gereken ise örneğin, buprenorfin subkutan enjeksiyon tarafından her 8-12 h 48 h için post-operatively yönetmek için.
   2. Bir ısı fare yastık ve araştırmacı tarafından tam olarak mobil kadar sternal recumbency ile katıldı tutun. Ne zaman tamamen iyileşti, fareler yatak stresi azaltmak için ev onların kafes üzerinden küçük bir miktar içeren bir temiz kafes dönün. Değil ev cerrahi saf fareler ile tabi fareler var.
      Not: Fareler durumunu hızlı bir şekilde, normal bir davranış içinde 24-48 h varmış gibi görünmesine artıracaktır.
   3. Tuzlu sıvılar ve artan analjezi durumlarını iyileştirmek için stresli görünen fareler için ver. Fare hızlı bir şekilde kurtarmak değil, fare ağırlık ölçmek ve onların ilk vücut ağırlığının %20 daha fazla kaybetmiş fareler ötenazi. Üremik veya aksi takdirde can çekişen görülen fareler ötenazi. Olası sağlık sorunları Tablo 1' de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
      Not: Fare Bazen onların dış dikişleri kaldırmak veya dikiş yara kapatma önce gevşek gelmek. Zavallı bir bozulmamış deri tabakası ile kas tabakasının dikiş şişkin tarafından belirtilen kesi yerinde fıtık neden olabilir. Bu gibi durumlarda, anestezi altında fareyi getirin (isoflurane ketamin/xylazine hızlı) ve cerrahi sitesi yeni dikiş ile en kısa zamanda tamir. Absorbe olmayan deri dikiş 10-14 gün sonra kalırsa, bunları kaldırın. Zaman zaman fareler kafesi arkadaşları dikiş kaldırın veya mücadele. Saldırgan fareler onları en kısa zamanda böyle bir davranışı tanımlanan diğer farelerin zarar önlemek için zenginleştirme ile kendi kafes için kaldırın.
   4. Sağlık veya deneysel bitiş noktaları ulaşıldığında, karbon dioksit inhalasyon veya ötenazi standart işletim prosedürü göre servikal yerinden çıkması gibi bir ikincil yöntem ötenazi için ardından isoflurane aşırı doz tarafından fareler ötenazi kurum olarak yerleştirmek

Neden	Başlangıçlı	Etkilenen fareler sayısı	Belirtiler	Acil eylem		Uzun vadeli bir çözüm
Bulunan DNA endotoxins	6-40 h sonrası enjeksiyon.	Her fare kirlenmiş DNA hazırlık verilen etkilemesi muhtemel.	Solunum sorunları, şiddetli ağrı, organ yetmezliği, ölüm belirtileri.	Etkilenen fareler ötenazi. Test her bileşen için endotoxins Limulus Amebocyte Lysate ile enjekte.		Endotoksin-Alerjik maxiprep kitleri ve yalnızca steril ve yeni veya NaOH tedavi aygıtlar kullanın. DNA sulandırmak için ticari olarak satın alınan, endotoksin test bir arabellek kullanın.
Anestezi aşırı doz	Ameliyattan önce veya sonra DNA enjeksiyon sırasında.	Sadece daha genç, daha küçük veya daha küçük fareler etkileyebilir.	Solunum Isıtma yastık üzerinde iken, idrara çıkma bir son verin.	Anestezi kalan fareler için azaltın.		Hazırlık ve protokol dozu doğruluğunu bir kez daha denetleyin. Dışlamak "cüceler." Uygun dozda kullanıldığında veteriner danışın.
Hava kabarcığı enjeksiyon için kullanılan iğne ve şırınga	Hemen ardından renal pelvis enjeksiyon.	Sürece tüm şırınga dikkatsizce doluydu, bu sadece bir fare etkiler.	Nefes nefes nefese.	Hava kabarcıkları belirtileri için kalan şırıngaları kontrol edin.		Şırınga dikkatle, kabarcıklar alt kaldırmak için şırınga dokunarak hazırlayın. Kabarcıklar daha iyi görmek için aydınlatma koşullarını iyileştirmek.
Cerrahi sitesi açma	12-72 h sonrası enjeksiyon	Bir veya daha fazla fare. Bazen bütün kafesi.	Ağzı açık yara, genellikle diğer hiçbir sıkıntı	Dikiş yara steril tekniği ile isoflurane anestezi altında dikkatle onarmak için yineleyin. Serum sulamak veya makasla yara kenarlıkları kaldırmak gerekebilir.		Bütün fareler çok kısa ya da eksik dikişler varsa, tek bir fare fareler ayrılmış bu yüzden çıkardıktan olabilir. Dikiş tekniği geliştirmek. Bağımsız deniz mili kullanın.
Fıtık cerrahi sitesi	48 + s sonrası enjeksiyon	Bir veya daha fazla fare.	Höyüğün cerrahi sitesinde görünür.	Steril tekniği ile İsoflurane anestezi altında fıtık kas tabakasının ortaya çıkarmak için iyileşmiş deriyi kesme. Karın zarını organlarda yerine, kas katmanı absorbe dikiş ile onarım ve site kapatın.		Bu zavallı kas tabakası dikiş gösterir. Dikiş tekniği geliştirmek. Bağımsız deniz mili kullanın.
Böbrek yetmezliği	48 + s sonrası enjeksiyon	Bir veya daha fazla fare.	Kilo kaybı > % 20 olasılıkla üremik, olma, Kambur duruş	Serum sağlamak ve artırmak veya analjezi uzatmak. Hiçbir gelişme gözlem yapılırsa, etkilenen fareler kurban.		Daha hafif yapmak için hayvan hastalık durumunu değiştirin. Daha az güçlü ya da indüklenebilir olmak transgene alter. Fareler hastalık ilerleme bir önceki timepoint adlı enjekte.
Abcess ya da enfeksiyon	Gün ile ameliyatı takiben hafta	Bir veya daha fazla fare.	Palpabl abcess ya da kan zehirlenmesi belirtileri	Etkilenen fareler ötenazi. Nekropsi şüpheli enfeksiyon onaylamak için isteyin.		Enjeksiyonları ve cerrahi koşulları yeterince steril olmadığında oluşabilir. Gösterilen yordam normal bir bağışıklık sistemi ile fareler içindir ama daha fazla önlemler olanlar gibi immün hayvanların ortamda alınması gereken siklofosfamid ile tedavi.

Tablo 1. Tablo potansiyel sağlık sorunları renal pelvis enjeksiyon iletişim kuralı sırasında karşılaşılan. Listelenen sağlık sorunları yaygın olmamakla birlikte, yordam süresince oluşabilecek araştırmacı ile ilgili hataları bir dizi vardır. Bu tablo önleme ve tanı sağlık sorunlarının yanı sıra bu tür sorunların gelecekte oluşmasını engellemek için potansiyel ilaçlar uygulanması için yardımı olabilir. Uygulama ile müfettişler seyrek sağlık sorunları ve ölüm yordamı nedeniyle beklemelisiniz.

3. enjeksiyon verimlilik ve transgene etkileri değerlendirmek

1. İyi gelişmiş bir tahlil için istenen transgene transfection etkinliğini değerlendirmek için kullanın. Pozitif ve negatif denetimleri dikkatle tahlil belirli olduğundan emin olmak için kullanın.
   Not: organizatörü seçime bağlı olarak, fareler büyük olasılıkla en güçlü transgene deyim gün 1 üzerinde olacak; enjeksiyon her zaman ilk hafta içinde.
2. Luciferase canlı hayvan görüntüleme seyreltilmiş DNA enjeksiyon için luciferase ifade plazmid gelişmiş ateş böceği luciferase gibi 10 µg tanıtarak gerçekleştirin.
   1. Fareler için maruz yüzeylerin temiz. Fareler, ilk kafes odası ve kapalı mühür yerleştirin. Deney için yeterli isoflurane gage kontrol ederek olduğundan emin olun; Eğer değilse, "max" line seviyesi ulaşır kadar isoflurane ekleyin. 3.5 isoflurane arama ve oksijen 2 kapatarak isoflurane akışını başlat.
   2. Her fare çözülmüş 30 mg/mL biyoluminesans ile 100 µL mayi enjeksiyonu ile enjekte. Yazmak zaman.
   3. Turuncu ve sarı renkli fare ikonuna tıklayarak görüntüleme makine kontrol yazılımını açın. "Select/Ekle kullanıcı kimliği altında" doğru baş harfleri "Kullanıcı adı" yanındaki açılır menüden seçin "Tamam" ı tıklayın. Üst menü çubuğunda "Satın alma" tıklatın ve "Otomatik kaydetme için..." açılır menüsünden seçin. Klasörü seçin veya verileri kaydetmek için yeni bir klasör oluşturun.
   4. Alt sağ köşesinde resim toplama kutusuna gidin. Onay otomatik ayarlar şunlardır: Binning, orta; F/Stop, 1 için Işıksaçan, 8 için fotoğraf; Emisyon filtre, açık; Görüntüleme modu, Luminescent, fotoğraf, bindirme ve hizalama yanında yalnızca denetler. "Sistem başlatmak ve bitirmek başlatma için beklemesi, sonra"Görüş alanı"değiştirmek"E beş fareler görüntü için"Başlat"'ı tıklatın.
   5. Öyle ki nosecones makine içinde isoflurane yönetmekte olduğunuz için anestezi boru vanası açmak. Hayvanların ruhuna görüntüleme makine istenen sıraya mideleri üzerinde sırtlarına böbrek görselleştirmek için yukarıdaki kameradan bakan yerleştirin. Birden fazla kafes yansıması ise, sonraki kafes isoflurane odasına koyun.
   6. 5-10 dk biyoluminesans enjeksiyon, aşağıdaki görüntü almak için "al" tuşuna basın.
   7. "Görüntü ayarla." "araç paleti üzerinde" sağ tarafta'yı tıklatın İfade her fare böbrek üzerinde mor görüntülenir tüm beklenen farelerde belirgin olana "Renk ölçek'in altında" "Min" Bar azaltın. Herhangi bir fare ifade gösterme, fareler biyoluminesans 100 µL ile kanlarını ve doğrularsa önce en az 3 dakika bekleyin.
      1. Görüntü piksel doymuş olan, çekim hızı azaltmak ve gibi doymuş piksel varlığı transfection verimliliği küçümseyen sonuçlanır nicel bir görüntü elde etmek için yeniden edinin. En düşük olası pozlama süresi 0,5 olarak s.
      2. Görüntü sadece zayıf gen ifadesinin ilk çekim hızı, gösteriyorsa, pozlama süresi 2 dk ve yeniden almak kadar artırın. Bu yüzden tüm görüntüleri daha sonra daha ayrıntılı bir çözümleme için mevcuttur görüntü tekrar girmesi, her zaman kaydedilmiş seçilen klasördeki verileri vardır.
   8. Fareler sonraki kafesleri için görüntüleme adımları yineleyin.
   9. Fareler görüntüleme makineden çıkarın. Gaz kapalı dön. Odası, nosecones ve görüntüleme sahne temiz. Bilgisayar programı kapatın.
      Not:-Ecek sormak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı "Veri kümesi kurtarmak." Bu veri, veri kendisi için yapılan işlemler ifade eder.
      1. Ölçek ve faiz (ROIs) bölgelerinde yapılan değişiklikleri kaydetmek için "Evet"'i tıklatın. Görüntüler için özgün ayarları geri dönmek için "Hayır"'ı tıklatın.
   10. Veri analizi için yazılımını açın. "Araç paleti" "ROI." Araçlar Daire simgesini tıklatın ve bir kırmızı oval etrafında dört kareler ile gösterildiği gibi görüntü penceresinde yeni bir yatırım Getirisi yerleştirmek için açılan menüde "1"'i tıklatın. ROI boyutunu fare imlecini kırmızı bir kare yerleştirerek ve enjekte böbrek overlaying mor alanı içine sürükleyerek ayarlayın.
       1. İmleci üzerine yatırım Getirisi üzerinde kırmızı bir kare ile sağ tıklatın sonra "Yinelenen görüntü penceresinde yeni bir yatırım Getirisi oluşturmak ve sonraki fareyi hareket ettirin için yatırım Getirisi" seçin. Görüntüdeki tüm fareler üzerinde enjekte böbrek bir yatırım Getirisi elde edene kadar yordamı yineleyin.
       2. Doğrudan görüntü yukarıdaki menüde "Birimini" "Sayıları" "Parlaklık (fotonlar)" için değiştirme ROI vermek için veri, "Aracı paletinde", "Yatırım Getirisi araçları" ardından ölçümlerin bir elektronik tablo oluşturmak için kalem/cetvel simgesine tıklatın. "Avg ışıltı" ölçüm seçim veri analizi ve istatistik programına daha fazla çözümleme kullanın.
3. Bölümleri açıklanan¹¹boyama gerçekleştirmek.
   Not: farklı bölümlerde farklı transfection verimliliği¹¹yakalayacaktır böylece enjeksiyon tüm böbrek eşit transfect değil. Boncuk floresan lateks mikroküreler bölgeleri belirlemek yardımcı olabilir gibi ortak enjeksiyon transgene pozitif (şekil 3D)¹¹olması bekleniyor. Boyama Protokolü duruma getirilmesi son derece önemlidir.
4. Gen transfected böbrek ilgi tanımlamak için Western blot gerçekleştirin.
   Not: Hasat organların proteini özleri için buza yapılmalıdır. Yine, bu bölge de transfected değil organ küçük bir dilim kullanmayın. Transfection düzensiz organ dağıtılan çok farklı alanlarda birleştirir ve onları Havuzu. Salgılanan transgene ürün dolaşım¹¹' bulundu ki beklenmektedir böylece renal pelvis hidrodinamik enjeksiyon hormonu Eritropoietin üreten bir plazmid Hematokrit, mütevazı bir artış sonuçlandı.
5. Transgenes uzun vadeli üst düzey ifade için entegre bir vektör sistemi immünsüpresif ajanlar siklofosfamid gibi ile birleştirin. Transgene bağışıklık yanıtı ilk önce birkaç hafta takip enjeksiyon oluşur ve sağlam¹¹yaşında.

Sonuçlar

Cerrahi ve enjeksiyon tekniği gerçekleştirmek basit bir kez hakim, hiçbir büyük ekipman veya pahalı malzemeler gerektiren. Yeni Eğer kanat-kesi böbrek ameliyatı, birkaç fare ötenazi için zamanlanmış bir eğitim gün bu ameliyatı ilk denemesinde normalden daha uzun sürebilir çünkü fareler kurtarılan aşağıdaki ameliyat olan değil izin verilmelidir. Alternatif olarak, müfettişler benzer teknikleri ile tanıdık daha çok basit gelebilir. Şekil...

Tartışmalar

Bu protokol için tekrarlanabilir gen ekspresyonu özellikle böbrek de ulaşmak için sağlam bir yöntemi açıklanmıştır. Orta derecede deneyimli bir cerrah elinde transgene okuma duyarlılığını ve 50-%100, fare yaş bağlı olarak çeşitli olması için bu tekniği tarafından transfected fareler yüzdesi bulduk. Luciferase gen ekspresyonu düzeyini arka plan üstüne piggyBac Transpozonlar alma farelerde birkaç ay oldu ve tamamen aynı Transpozonlar¹¹alma immün farelerde bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947	Anesthetic - Not controlled substance
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch	Cardinal Health	309306	Required syringes
Buprenex	Pharmacist/Veterinarian		Analgesia - Controlled Substance
Dynarex Disposable Towel Drape	Thermo Fisher Scientific	19-310-671	Place over heat pad
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Use only endotoxin-free plasmid DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control	Charles River	PC200	Positive control for endotoxin test
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial	Charles River	R13500	Endotoxin test
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5882	Surgical tool
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9"	Thermo Fisher Scientific	01-812-51	For autoclaving surgical tools
Gaymar Heat Pump	Paragon Medical	TP-700	Water-circulating heat pump
Germinator 500	Roboz Surgical Instrument	DS-401	To reuse surgical tools during surgery
Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5136	Surgical tool
Graefe Tissue Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5153	Surgical tool
Halsey Needle Holder, 5" Length	Roboz Surgical Instrument	RS-7841	Surgical tool
Heat pads - 15" x 21" - need at least 3	Paragon Medical	TP22G	For use with Gaymar Heat Pump
IsoFlo (Isoflurane, USP)	Abbott Animal Health	5260-04-05	For imaging and euthanasia
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor	Smiths Medical	VCT3K2	For imaging and euthanasia
Ketamine	Pharmacist/Veterinarian		Anesthetic - Controlled Substance
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Laboratory tissues
Living Image software	Caliper Life Sciences		For live animal imaging
Luciferin	Perkin Elmer	122796	For live animal imaging
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000-US-CAN	Spectrophotometer for DNA measurement
Prevantics Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-100-110	For skin surgery prep
Prolene 5-0 sutures Taper 30"	Thermo Fisher Scientific	NC0256891	Non-absorbable sutures for skin
Puralube Brand Opthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	To keep eyes moist during surgery
Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution	Mirus Bio	MIR-5240	Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA
Vicryl 5-0 Sutures J303H	Thermo Fisher Scientific	NC9816710	Absorbable sutures for muscle layer
Wahl Mini Arco Clipper	Med-Vet International	8787-1550	Shaver for skin prep
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences		For live animal imaging