유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한

요약

이 프로토콜에는 신장에 특히 transgene 식 생산 하 신 골반을 통해 마우스 신장에 플라스 미드 DNA를 주입 하는 방법을 설명 합니다.

초록

유체역학 주입 transfect 다양 한 조직 플라스 미드 DNA와 다른 물질을 지역, 고압 환경을 만듭니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입, 예를 들어 간 페 될 수 있는 잘 설립 방법입니다. 이 원고는 신장 관련 유전자 발현에 대 한 플라스 미드 DNA와 직접 마우스 신장의 주입에 의해 유체역학 원리의 응용을 프로그램을 설명합니다. 쥐 취 고 신장 신장 골반에 직접 플라스 미드 DNA를 포함 하는 솔루션의 빠른 주입 다음 측면 절 개 하 여 노출 됩니다. 바늘은 10 초에 대 한 장소에 보관 하 고 절 개 사이트 봉합. 다음 날, 라이브 동물 영상, 서쪽 오 점 또는 immunohistochemistry 유전자 발현 분석 결과를 사용할 수 있습니다 또는 관심사의 단백질의 검출에 사용 되는 선택의 transgene에 적합 한 다른 분석 실험. 유전자 발현을 연장 하기 위해 게시 방법은 transgene 면역 반응을 억제 하 중재 하는 transposon transgene 통합과 cyclophosphamide 치료를 포함 합니다.

서문

유체역학 꼬리 정 맥 주입 기술은 마우스 간^1,2유전자 발현의 높은 수준을 달성 하기 위해 일반적으로 사용 되는 되고있다. 신장은 또한 훨씬 더 낮은 수준, 약 100 적은³에서이 기술에 의해 페. 여기에 설명 된 유체역학 신장 골반 사출 간^{4,5 이전 설립 되었습니다 동일한 유체역학 원리를 사용 하 여 물리적 수단을 통해 장기 식의 특이성을 제어 하는 간단한 방법 제공} ,⁶, 근육 및 다른 기관^7,8. 이 메서드는 압력을 사용 하 여 셀 vivo에서 동물에 transfects와 동시에 신속 하 게 기관에 손상을 유발 셀에 액체 포함 DNA를 강제로 속도 해결⁹. 인슐린 주사기에 의해 단일 주사 함께 측면 절 개¹⁰ 통해 신장 시각화 확고 외과 기술을 사용 하 여, 우리는 다양 한 종류의 신장 세포, 주로 간 질 성 섬유 아 세포의 성공적인 transfection 발견 tubules, 그리고 모으는 덕트¹¹. 이러한 쥐의 해 부 다른 장기 luciferase 이미징 기법¹¹여 시각화 충분히 높은 수준에서 페 하지는 보이고 있다. 기술은 아닌 바이러스 이기 때문에, transfection에 대 한 플라스 미드 DNA의 사용 사출에 필요한 시 약의 빠르고 쉬운 준비를 허용 합니다.

우리 항 산화 glutathione S-전이 효소 A4, 인슐린 같은 성장 인자 1 수용 체 모두 예상된 생물학적 효과^11, 와 함께 신장에서 호르몬 리스로 표현 하는 지역화 된 유체역학 주사를 사용 ^{12 , 13}. 경로 관리, 주입 량, DNA 복용량, 및 발기인 선택의 상세한 평가 수행된¹¹되었습니다. 또한, 두 piggyBac transposon 시스템 또는 cyclophosphamide 치료는 transgene 면역 반응 억제를 장기 진 식 결과¹¹을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. 다른 조사 성공, 한 달¹⁴보다 큰 시간 동안 높은 transfection 효율을 달성 쥐에서 신장 정 맥 접근을 사용 했습니다. 그러나, 인간의 질병을 흉내 낸 고기의 유전 수정 일반적으로 수행 됩니다 마우스 처음 개념 증명으로 이후 가장 포유류 유전자 모델은 마우스 모델. 우리 신장 골반 주입에 신장 정 맥 주입을 비교 하 고 신장 골반에 주입 (약 10 배 더 높은) 유전자 발현 및 생존¹¹신장 정 맥에 우수한 발견. 신장 골반 신장에 항목의 이상적인 경로 때문에 용납 소변 생산에 변동에 유연 이며 종종 hydronephrosis 동안 넓힐 경우에 그것의 구조적 무결성을 유지할 수 있습니다. 또한, 신장 골반에 주입 주입된 유체 가시 intraparenchymal 주입 보다는 더 나은 신장에 의해 유지 될 수 있도록 신장 캡슐을 관통 하지 않고 신장에 대 한 액세스를 허용 합니다. 다른 마우스 장기 맥 관 구조, 다른 항목의 경로 필요가 없습니다 하지만 신장 비뇨 기 공간 이상적인 사출 사이트입니다. 또한, 신장 정 맥에 주사는 복 부 구멍으로 혈액의 누설에 결과. 야생-타입 마우스 신장의 총 신장 볼륨 단일 신장의 볼륨은 약 신장 골반 유체에 의해 주입 액체의 양을에 약 0.2 c m³를 자기 공명 영상으로 추정 되었다 주입 (100 µ L)¹⁵. 여기, 우리는 가능 신장 재현할 transfection를 달성 하기 위해 유체역학 신장 골반 주입 프로토콜의 자세한 뉘앙스의 모든.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUCs) 베일 러 의과대학의 Vanderbilt 대학 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.

1. 주입을 위한 DNA 솔루션 준비

1. Transfection 효율과 transgene 식 향상에 바람직한 특성을 극대화 하기 위해 신중 하 게 transgene(s)을 표현 하는 plasmid(s)를 선택 합니다.
   참고: 형광 마커 TdTomato, 호르몬 erythropoietin (Epo), 반딧불 luciferase을 표현 하는 플라스 미드의 유체역학 신장 골반 주입 되어 앞에서 설명한¹¹. transgene의 transfection 효율에 대 한 분석 결과 개발된 하지 경우 향상 된 반딧불 luciferase 같은 luciferase 표현 플라스 미드의 10 µ g 주입에 대 한 희석된 DNA를 도입 하 여 luciferase의 라이브 동물 이미지를 수행 합니다.
   1. 실용적인 응용 프로그램에는 작은 플라스 미드를 선택 합니다.
      참고: 작은 플라스 미드는 일반적으로 큰 플라스 미드 보다는 더 나은 셀 transfect. 예를 들어 zeomycin 저항 유전자와 복제의 R6K 근원 되므로 작은, 플라스 미드 등뼈에 이러한 요소를 활용 하 여 플라스 미드 크기 줄일 것 이다.
   2. 포유류 발기인에서 transgene를 표현 한다.
      참고: 신장 세포 유형 페, 유전자 발현의 길이 및 유전자 발현의 강도 모두 영향을 받을 발기인 선택. Woodard 외를 참조 하십시오. 세포의 비교 (CMV 제정, 바이러스), 신장 요인 1 알파 (EF-1α; 제정 생), 감마 glutamyl 전이 효소 (γGT; 관 전용), 및 podocin (NPHS2; podocyte 전용)¹¹.
   3. 장기 진 식 상부는 바람직한^11,16transposons 같은 비 바이러스 성 통합 시스템을 사용 합니다. 5 일 후 주입 보다는 더 적은 초기 해독과 연구,는 transgene의 통합 필요 하지 않습니다.
2. 내 무료 maxiprep 키트 같은 상업적인 방법을 사용 하 여 주입에 대 한 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 신중 하 게 소개 하는 기구를 통해 부유 하지 마십시오.
   참고: DNA 솔루션에서 독의 존재는 실험을 손상 하 고 가능 하 게 동물을 죽이 주제 동물에 심각한 면역 응답을 이끌어내는 것입니다.
   1. 마지막 DNA 분리 세척 단계 완료 되 면 아무 에탄올 육안 검사 및 냄새 남아 있는지 확인 합니다. 젤 로드 팁을 사용 하 여 볼 수 방울을 제거. 건조 한 실험실 섬세 한 작업 퍼 조직 지속적인 모니터링으로 37-60 ° C 오븐에서 또는 실내 온도에 거꾸로 DNA 펠 릿을 포함 하는 튜브. 잔여 에탄올은 펠 릿의 overdrying를 방지 하기 위해 증발 한 후에 바로 펠 릿을 resuspend.
      참고: 잔여 에탄올 DNA 농도의 분 광 광도 계 읽기와 방해 하 고 신장에 소개 하는 것은 바람직하지 않다.
   2. Resuspend 같은 버퍼에 DNA 펠 릿으로 사출 (유체 전달 버퍼, 100-300 µ L) 그룹 간의 DNA 버퍼 솔루션의 화학 성분에 변화를 제한 하는 데 사용 됩니다.
      참고: 키트와 함께 제공 되는 차입 버퍼 솔루션에 DNA 펠 릿을 resuspend 하지 않습니다. Chelating 에이전트 "TE" 버퍼 준비에서 일반적으로 있다 EDTA 신장 및 심장 혈관 기능에 영향을 수 있습니다. 펠 릿 크기에 따라 높은 농도 달성 하기 위해 유체 전달 버퍼의 100-300 µ L에 elute. 완전히 희석된 DNA의 최종 농도가 100 ng / µ L (10 µ g/마우스 복용량)와 500 ng / µ L (50 µ g/마우스 복용량) 사이 있을 것 이다 주식 DNA 농도 이것을 초과 한다.
   3. 완전 버퍼에 DNA 펠 릿 resuspend. 유체역학 배달 버퍼 적어도 1 시간 동안 실내 온도에 또는 하룻밤 DNA는 완전히 용 해 되도록 살 균 microfuge 관에 전송 하기 전에 4 ° C에서 원래 튜브에에서 펠 릿을 둡니다.
   4. 플라스 미드 DNA 농도 분 광 광도 계 또는 다른 설립된 방법으로 읽기.
      참고: 판독 할 수 추가 복제와 복제에 필요한 경우. 260/280 비율이 1.8이 하 있는 경우에, 준비는 RNA와 오염 또는 다른 물질 그래서 그것을 삭제 하 고 다시 DNA를 준비.
   5. 냉장고는 DNA의 저하를 방지 하 게 플라스 미드 DNA 주입 버퍼 수동에서 상자 안에-20 ° C에서 resuspended에 서 리 없애다.
      참고:이 방식으로 저장, DNA 준비는 몇 년 동안 지속 됩니다. 제한 다이제스트 및 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 DNA의 무결성을 확인 합니다. 더듬어 얼룩져 DNA는 저하 하 고 정확한 크기의 선명한 밴드를 생산 하는 DNA 주입을 위해 사용할 수 있지만 사용할 수 없습니다.
3. 신장 골반에 주입을 위한 희석된 플라스 미드 DNA 솔루션을 준비 합니다.
   참고: 고려 컨트롤 그룹을 신중 하 게. 많은 연구에 대 한 순진한 및 버퍼 주입 전용 컨트롤 주입 자체 손상을 원인과¹¹실험 결과 영향을 미칠 수 있기 때문에 포함 됩니다.
   1. 내 무료 DNA 벤치에 실 온에서 유체 전달 버퍼에 eluted 없애다
   2. 주사에 필요한 DNA의 양을 계산 하 고 각 그룹에 대 한 희석된 DNA를 준비. 플라스 미드 DNA 유체 전달 버퍼 마우스 당 100 µ L의 총 볼륨을 가져의 10-50 µ g를 관리 합니다.
      참고: 예, 10 µ g/0.5 µ g / µ L의 농도 DNA 플라스 미드의 마우스와 함께 3 마우스를 삽입 계산은 다음과 같습니다.
      1. 주사기와 바늘에 죽은 공간 로드에 대 한 추가 약 20%가 충분 한 DNA 솔루션을 준비 합니다. 3 마우스, 3.5에서 혼합 준비 x. 솔루션에 있어야 µ g의 DNA의 질량을 계산 합니다. 여기 것이 10 µ g x 3.5 = 35 µ g.
      2. 원하는 마우스 당 100 µ L를 주입에 대 한 솔루션의 전체 볼륨을 계산 합니다. 이 경우에, 그것은 3.5 = 350 x 100 µ L 것 µ L 총 볼륨.
      3. 재고 플라스 미드 DNA 솔루션에 추가의 볼륨을 계산 합니다. 이 경우에, 그것은 35 µ g 것 / 0.5 µ g / µ L 재고 플라스 미드 DNA의 70 µ L =.
      4. 버퍼 재고 DNA 추가 (1.3.2.3 단계) 원하는 (1.3.2.2 단계) 희석된 DNA의 총 볼륨에서의 볼륨을 빼서 희석된 DNA 솔루션에 추가를 볼륨을 계산 합니다. 이 경우에, 그것은 350 µ L-70 µ L 것 = 280 µ L 유체역학 배달 버퍼.
   3. 살 균 microfuge 관 상용 필터 피 펫 팁을 사용 하 여 실험실 벤치에 살 균 기술 솔루션을 준비 합니다.
      참고: DNA 솔루션 준비 및 주사를 준비가 되어 발생 하는 그 날에 대 한 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 이 그들의 체온을 낮출 것 이다 하지만 온난화는 필요 하지 않습니다 차가운 솔루션으로 쥐를 주사 하지 마십시오.

2. 유체역학 신장 골반 주입 수술을 수행

1. 신중 하 게 수술에 대 한 마우스를 선택 합니다.
   참고: 스트레인 차이점 아직 관찰 하지는 하지만 가능한 수 있습니다. 대부분 주사 C57BL/6 또는 FVB 배경에서 왔다. 신장 골반 주사 6-12 주 오래 되 쥐에 적합 합니다. 16 주 보다 더 큰 쥐, luciferase에 의해 50% 고장율까지 영상 가능 하다 명확 하지 않은 이유로. 그래서이 유체 주입의 원리에 관련 된 일반적인 제한 될 수 있습니다 같은 연령과 관련 된 실패율 간 유체역학 꼬리 정 맥 주사에 대 한 관찰 되었습니다. 같은 라인을 따라 다른 거리 쥐 간으로 유체역학 꼬리 정 맥 주입 가능한 신장 섬유 증 신장 골반 유체 주입의 설정으로 적용 되지 것입니다 수 있습니다 그래서 건강 한 간으로 효과적이 지 않습니다 나타났습니다 하지만 이것은 되지¹⁷직접 테스트.
2. 수술에 대 한 쥐 및 DNA 주사기를 준비 합니다.
   1. 마 취 제와 xylazine 마우스 anesthetize
      1. 일회용 랩 앞치마, 외과 얼굴 마스크, 니트 릴 장갑 등 동물 시설에 필요한 올바른 개인 보호 장비에 넣어.
      2. 한 번에 2-4 마우스 사용, 무게 0.1에 그 규모에 500ml 플라스틱 비 커에 각 마우스 g. 24 mg/mL의 마 취 제 및 2 mg/mL xylazine 복 주입 하 여 각 마우스 수 관리할 수 정상 0.9% 식 염 수에 희석의 정확한 금액을 계산 (복 주입에 대 한 자세한 참조 비디오 참조) ¹⁸. 수식을 사용 하 여 (50 µ L + ((5 µL) (중량 (g)) x), 또는 양자 택일로 현지 수 의사 팀과 IACUC 협의 후 다른 수식에 따라 계산.
      3. 표준 기술로 마우스 복 주사로 주입. 마우스 이동 때까지 종이 양동이에 마우스를 놓습니다.
         참고: 마우스 이상 발가락 꼬 집 음 시험에 대처할 때 수술 준비 되어 있다. 계속 발가락-핀치에 대응 하는 게 쥐 20-60 µ L 더 마 취, 응답의 강도 따라 초기 주입 후 20-30 분을 테스트 합니다.
      4. 장소는 물 순환 열 패드에 마우스 블루 패드와 장소 수 의사 연 고 각 막 건조 방지 하기 위해 양쪽 눈에 덮여 있다.
   2. 애완 동물 손질을 위한 면도기 쉐이브 돌아가기 마우스의 어깨에서 엉덩이 척추에 측면의 왼쪽. 느슨한 머리카락과 파편을 제거 합니다.
   3. 없는 기포는 확인 하 고 각 마 취 마우스에 대 한 희석된 DNA의 100 µ L를 포함 하는 별도 주사기를 준비 합니다.
      1. 살 균 29G x ½"0.5 mL U-100 인슐린 주사기를 사용 하 여 안전 없이 영구적으로 연결 된 바늘.
         참고: 주사기 유형은 매우 중요입니다. 이 계기는 빠른 주입 수 있습니다. 영구적으로 연결 된 바늘 밖으로 누출에서 솔루션을 수 없습니다. 존재는 안전의 신장 골반에 대 한 액세스를 방해 합니다. 자료 테이블에 지정 된 주사기 보다 균등 하 게 주입 테스트 다른 브랜드 보다 중 활강.
      2. ~ 120 µ L 주사기를 로드 하 고 상단에는 공간을 만들려고 플런저를 당겨. 때까지 모든 공기 거품 상승 상단에 펜으로 누릅니다. 드롭릿 바늘의 끝에 형성 될 때까지 모든 공기를 제거 하는 플런저를 우울 하 게 신중 하 게 바늘을 들고. 거기 해서는 안됩니다 어떤 보이는 거품 존재, 이러한 동물을 죽 일 것을 공기 색 전 증을 일으킬 수 없습니다.
      3. 완료 될 때까지 100 µ L 주사기에 원래 microfuge 관으로 초과 DNA 솔루션을 비우는 의해 플런저를 우울 합니다. 신중 하 게 필요한 경우 레이블 하 고 작업이 수행 되 고 시설 바늘의 recapping을 허용 하지 않는 경우 불 임을 유지 하기 위해 무 균 드 레이프에 로드 된 주사기를 놓습니다.
3. 주입 수술을 수행 합니다.
   1. 수술에 대 한 사이트를 준비 합니다. 열 패드 및 그들을 건드리지 않고 살 균 드 레이프에 빈 메 마른 외과 도구 살 균 드 레이프 장소. 마우스를 선택 하 고 보기의 필드에. 조명 조명 영역을 조정 합니다.
   2. 패키지에서 3 3.15% 액체 글 루 콘 산 및 70% 이소프로필 알코올 피부 살 균 면봉을 제거 하 고 동물 근처 장소.
   3. 무 균 수술 장갑으로 변경 합니다. 일하고 원형 모션 처음에 절 개 사이트, 새로운 액체/알코올 면봉으로 면봉 동물에 세 번.
   4. 그림 1A와 같이 절 개 사이트를 찾습니다. 핀셋으로 피부를 곤란, 피부에 약 1 cm에서 척추 및 흉 곽 아래 레이어 컷을가 위를 사용 합니다. 일단 컷된 사이트는 약 1 ㎝ 길이, 근육 층에 아래, 비슷한 컷된 사이트를 확인 합니다.
      참고: 절 개 자체 절 개 하 여 장소에 보관 후와 절 개를 통해 서 겨우 신장 수 있도록 오른쪽 길이 확인 합니다. 너무 작은 절 개 하 고 신장 노출 될 수 없습니다; 너무 큰 및 신장 지속적으로 복 부 구멍에 다시 풀 것 이다.
   5. 신장을 찾습니다.
      참고: 그것은 백색 지방 조직 사이 볼 수 있습니다. 비장은 또한 동물의 왼쪽에 위치 해 있습니다. 이러한 장기의 색상 수 있습니다 시각적으로 분화 될, 비장은 어두운 적갈색 신장은 어두운 레드 오렌지로. 그건 쉽게 파열 될 수 있다 비장을 조작 하는 것이 좋습니다.
   6. 신장, 건드리지 않고 부드럽게 노출 복 부 구멍에서 손가락 (그림 2C)와 복 부에 지속적으로 살짝 힘을 넣어. 닫힌된 족집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 원치 않는 장기 다시 복 부로 필요한 경우. 이 신장 이나 다른 장기 손상 될 수 있습니다으로 오픈 집게를 사용 하지 마십시오.
   7. 신장은 복 부가, 일단 부드럽게 별도 주변에서 지방 충분히 신장 골반, 작은 흰색 점 (그림 1B)를 시각화. 1 개의 측에 지방을 밀어 하거나 필요한 경우 제거 합니다. 하지 부 신 동맥, 신장, 또는 신장 캡슐의 최고 극 근처를 해야 합니다.
   8. 사용 하 여 폐쇄 되도록 신장 골반 보기에서 오른쪽 신장에 밀어, 로드 인슐린 주사기는 오른손으로 잡고 집게를 신장 골반 (그림 2E)에서 지적 하는 바늘 작업 표면에 평행 하 게 잡고. 삽입 바늘 신중 하 게 고정 신장 신장 골반 그림 1B와 같이.
   9. 3 s 이내 신속 하 게 솔루션을 주입. 신장의 약 1 / 3 명확 하 고 흰색으로 색상을 변경할 수 있습니다.
      참고: 혈의 형성 뿐만 아니라 신장 캡슐 다음 주입 액체 형성을 관찰 하는 것이 일반적입니다. 일부 손상 탐지에 대 한 DNA transfection의 충분 한 수준을 달성 하기 위해 필요 하다.
   10. 약 10 자리에 바늘을 유지 솔루션의 역류를 방지 하는 s. 다음 신중 하 고 천천히 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 절 개 사이트를 스트레칭 하 고 사용 하 여 복 부 구멍을 기관 폐쇄 집게를 반환 합니다.
   11. 2-4 독립 노트 배치 5-0 흡수 봉합 봉합 동물의 근육 레이어.
   12. 2-4 독립 노트를 배치 하는 5-0 또는 6-0 비 흡수 나일론 봉합 봉합은 피부 층을 동물의.
       참고: 수술 도구 살 균 비드 욕조에 배치 후 다시 고 냉각 될 수 있습니다.

그림 1입니다. 유체역학 신장 골반 주사에 대 한 정확한 절 개 사이트 및 바늘 배치. A) 절 개 (레드 라인) 해야 있으며 약 1 cm 척추에서 마우스의 흉 곽 아래 약 1 cm. B) 후 신장 측면 절 개를 통해 노출, 신장 골반 신장 아래 작은 노란 클리어/화이트 도트 중간으로 위치 해야 합니다. 신장 정 맥, 신장 동맥, 또는 ureter 주입 방해 하지 해야 합니다. 인슐린 주사기의 바늘은 약 0.5 c m의 깊이 같이 신장 골반에 직접 삽입 하 고 신속 하 게 2-3 미에 우울 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 플라스 미드 DNA의 신장 골반 유체 주입을 수행 하는 외과 단계. A) 겸 피부 층 근육 층을 통해 다음을 통해 먼저 메스와 ~ 1 cm 측면 절 개를 만들기 위해 외과 의사 수 있도록 피부를 꼬집어. 수술 상처, 신장 여 닫힌된 집게의 B) 사용 하 여 두 쌍 가능 하면 복 부 내 시각 이다. C) 어떤 장기를 직접 건드리지 않고 복 부에 부드러운 압력으로 신장 측면 절 개를 통해 노출 됩니다. D) 지방 질은 부드럽게 해 부는 신장에서 신장 골반에 대 한 액세스를 달성 하기 위해 가능한 한 조금 방해. E) 누르면 오른쪽을 왼쪽된 신장에 신장 골반 시각화, 주사기는 억압 물에 손가락을 개최 하 고 바늘은 신중 하 게 하지만 확고 하 게 신장 골반에 배치. F) 다음은 < 지우기 3 s 주입 주사의 대량을 받은 신장 지역에서 관찰 될 수 있습니다. G) 살 균 보라색 vicryl 흡수 봉합 근육 층에 2-4 독립 매듭을 만드는 데 사용 됩니다. H) 살 균 블루 나일론 비 흡수 봉합은 피부 층에 2-4 독립 노트를 만들기 위해 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 수술 및 수술 모니터링에서 복구입니다.
   1. 통증 제어를 위한 기관의 IACUC 요구에 따라 진통제와 마우스를 제공 합니다. 예를 들어 관리 buprenorphine 피하 주입에 의해 매 8-12 h 48 h에 대 한 post-operatively 경우에 NSAID 관련 신장 손상 연구에 대 한 피해 야 하는 것입니다.
   2. 계속 열에 마우스 패드 및 sternal recumbency까지 완벽 하 게 모바일 조사에 의해 참석 했다. 완전히 복구 하는 경우 스트레스를 줄이기 위해 그들의 홈 장에서 침구의 작은 금액을 포함 하는 깨끗 한 케이지를 쥐를 반환 합니다. 순진한 쥐와 수술 대상이 집 쥐 하지 마십시오.
      참고: 쥐의 조건 향상 됩니다 신속 하 게, 24-48 시간 내에 정상적인 동작을 게재.
   3. 그들의 상태를 개선 하기 위해 강조 표시 되는 마우스에 게 염 분 액체와 증가 진통. 마우스 신속 하 게 복구할 수 없습니다, 마우스 무게를 측정 하 고 그들의 초기 체중의 20% 이상 잃어버린 마우스를 안락사. 나타나는 신부전 또는 그렇지 않으면 죽어가는 쥐 안락사 가능한 건강 문제 표 1에 자세히 나와 있습니다.
      참고: 마우스 때로는 그들의 외부 봉합을 제거 또는 봉합 상처 폐쇄 이전 느슨한. 그대로 피부 층과 근육 층의 불 쌍 한 봉합 하는 것은 불 룩 하 여 표시 된 절 개 사이트에 탈 귀 착될 수 있다. 이러한 경우에 장소 마우스 마 취 (isoflurane 보다 빠릅니다 케 타 민/xylazine) 새로운 봉합 수술 사이트를 최대한 빨리 복구 하 고. 10-14 일 후에 비 흡수 피부 봉합 남아 있으면 그들을 제거 합니다. 가끔 마우스는 그들의 감 금 소 동료 ' 봉합을 제거 또는 싸울 수 있습니다. 그런 행동을 확인 하자마자 다른 마우스를 상처에서 그들을 방지 하기 위해 농축과 새 장에 그들의 자신의 가상 마우스를 제거 합니다.
   4. 건강 또는 실험적인 끝점에 도달 하면, 이산화탄소 흡입 또는 isoflurane 과다 복용에서 안락사에 대 한 표준 운영 절차에 따라 자 궁 경부 전위 등 안락사의 보조 방법 뒤 마우스를 안락사 교육 기관에

원인	발병	영향을 받는 쥐의 수	증상	즉각적인 조치		장기 솔루션
포함 하는 DNA 독	6-40 h 후 주입입니다.	오염 된 DNA 준비를 주어진 모든 마우스에 영향을 미칠 가능성이 높습니다.	호흡 문제, 심한 통증, 기관 실패, 죽음의 흔적.	영향을 받는 마우스 안락사 Limulus Amebocyte Lysate와 독에 대 한 각 삽입 된 구성 요소를 테스트 합니다.		내 무료 maxiprep 키트만 살 균 하 고 새로운 또는 NaOH 처리 기구를 사용 합니다. 상업적으로 구입, 내 테스트 버퍼를 사용 하 여 DNA를 희석.
마 취 과다	동안 수술, 전 또는 DNA 주입 후.	수만 젊은, 더 작은, 또는 적어 쥐를 영향을 줍니다.	생리대, 배 뇨를 하는 동안에 호흡을 중단.	나머지 마우스에 대 한 마 취를 감소.		준비 및 복용량 정확도 대 한 프로토콜을 다시 확인 합니다. "런"을 제외 적절 한 복용량을 사용 하는 경우 수 의사를 참조 하십시오.
공기 방울이 주사기 또는 주입을 위해 사용 하는 바늘	바로 신장 골반 주입 다음.	하지 않는 한 모든 주사기는 부주의 하 게 로드 된,이 한 마우스를 적용 됩니다.	숨을 헐 떡이 고.	공기 방울의 흔적 남아 있는 주사기를 확인 하십시오.		준비 주사기 신중 하 게, 하단에는 거품을 제거 하는 주사기를 활용 합니다. 조명 조건 더 거품을 시각화를 향상 시킵니다.
수술 사이트 오픈	12-72 h 후 주입	하나 이상의 쥐입니다. 때로는 전체 케이지.	벌어진 상처, 일반적으로 아무런 다른 고민	반복 신중 하 게 살 균 기술로 isoflurane 마 취에서 상처를 복구 봉합 합니다. 식 염 수로 관개 또는 위 상처 테두리를 제거 해야 합니다.		모든 마우스는 매우 짧거나 없는 봉합, 마우스를 분리 될 수 있습니다 그래서 그들을 제거 하는 하나의 마우스 있을 수 있습니다. 봉합 기술을 향상 시킵니다. 독립적인 매듭을 사용 합니다.
탈 장 수술 사이트에서	48 + h 포스트 주입	하나 이상의 쥐입니다.	마운드는 외과 사이트에 표시 됩니다.	살 균 기술로 isoflurane 마 취, 근육 층의 탈을 치료 피부를 잘라. 복 막에 장기 대체, 흡수 봉합 근육 층을 복구 하 고 사이트를 닫습니다.		이 불 쌍 한 근육 층의 봉합을 나타냅니다. 봉합 기술을 향상 시킵니다. 독립적인 매듭을 사용 합니다.
신장 장애	48 + h 포스트 주입	하나 이상의 쥐입니다.	체중의 감소 > 20%, 가능 하 게 되는 신부전, hunched 자세	증가 또는 연장 진통 및 염 분을 제공 합니다. 개선을 관찰 하는 경우 영향을 받는 쥐를 희생.		덜 심각한 수 있도록 동물의 질병 상태를 변경 합니다. 덜 강한 또는 유도할 수 있는 transgene를 변경 합니다. 질병의 진행에 이전 timepoint에 쥐를 주입.
Abcess 또는 감염	수술 후 주 일	하나 이상의 쥐입니다.	만져 서 abcess 또는 패 혈 증의 징후	영향을 받는 마우스 안락사 의심 스러운된 감염을 확인 하는 검 시를 요청 합니다.		이 수술 조건 및 주사 충분히 살 균 하지 않은 경우에 발생할 수 있습니다. 표시 된 절차는 정상적인 면역 체계와 쥐에 대 한 하지만 추가 해야 합니다 주의 immunocompromised 동물 등의 설정에서 cyclophosphamide 치료.

표 1입니다. 신장 골반 주입 프로토콜 중에 발생 하는 잠재적인 건강 문제 표. 나열 된 건강 문제는 일반적인, 탐정 관련 오류는 절차의 과정에서 발생할 수 있는 여러 가지가 있습니다. 이 테이블은 예방 및 건강 문제 뿐만 아니라 미래에 발생에서 이러한 문제를 방지 하기 위해 잠재적인 구제의 구현에 대 한 진단에 있는 원조의 있을 수 있습니다. 연습, 조사자 드문 건강 문제 및 절차도 인 한 사망률을 기대 해야 한다.

3. 주입 효율과 transgene 효과 평가

1. 원하는 transgene의 잘 발달 된 분석 결과 사용 하 여 transfection 효율을 평가 하기 위해. 분석 결과 특정 되도록 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 신중 하 게 사용 합니다.
   주: 발기인 선택에 따라 마우스 있을 것 이다 가능성이 강한 transgene 식 주 1; 항상 첫 번째 주 주입 다음 내.
2. 향상 된 반딧불 luciferase 같은 luciferase 표현 플라스 미드의 10 µ g 주입에 대 한 희석된 DNA를 도입 하 여 luciferase의 라이브 동물 이미지를 수행 합니다.
   1. 마우스에 노출 하는 모든 표면 청소. 챔버와 물개 그것 종료에 쥐의 첫 번째 케이지를 놓습니다. 실험에 대 한 충분 한 isoflurane; 게이지를 확인 하 여 있는지 확인 그렇지 않다면 isoflurane 수준을 "최대" 라인에 도달할 때까지 추가. 3.5 isoflurane 다이얼 및 2 산소 여 isoflurane의 흐름을 시작 합니다.
   2. 해 동된 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 주사로 각 마우스를 주사. 시간을 기록 합니다.
   3. 오렌지와 노란색 마우스 아이콘을 클릭 하 여 이미징 시스템을 제어 하는 소프트웨어를 엽니다. "선택/추가 사용자 ID,"에서 "사용자." 옆에 있는 드롭 다운 메뉴에서 올바른 이니셜을 선택 "확인"을 클릭 합니다 상단 메뉴 모음에서 "수집"를 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 "자동 저장..."을 선택 합니다. 폴더를 선택 하거나 데이터를 저장 하려면 새 폴더를 만듭니다.
   4. 오른쪽 하단 모서리에 이미지 수집 상자로 이동 합니다. 자동 설정은 다음과 같은 확인: Binning, 매체; F/정지, 1 사진; 발광, 8 배기 필터, 오픈; 만 Luminescent, 사진, 오버레이, 및 정렬 확인 모드를 이미징 합니다. 시스템 초기화 및 초기화 완료 대기 다음 5 쥐 이미지를 "E"로 "시야" 변경 "초기화"를 클릭 합니다.
   5. 컴퓨터 내부 nosecones isoflurane 관리 하는 그런 마 취 튜브에 대 한 밸브를 설정 합니다. 시각화는 신장 위의 카메라를 직면 하 고 그들의 뒤와 그들의 위장에 원하는 순서로 이미징 시스템 안에 동물을 놓습니다. 하나 이상의 새 장 수 이미지를 경우 isoflurane 챔버로 다음 케이지를 놓습니다.
   6. 소 주입, 다음 5-10 분 "취득" 이미지를 누르십시오.
   7. 클릭 "이미지 조절 패널" "도구 팔레트에" 오른쪽 사이드에서 "색조," 아래 "분" 바 감소까지 식 각 마우스 신장에 보라색으로 시각화 모든 예상된 쥐에서 분명 하다. 어떤 쥐 팬 들은 식의 정보를 표시 하지 않습니다, 소의 100 µ L로 쥐를 reinject 하 고 reacquiring 하기 전에 3 분 이상 기다립니다.
      1. 이미지는 픽셀을 포화, 노출 시간을 단축 하 고 포화 된 픽셀의 존재 transfection 효율을 과소 평가에 발생 양적 이미지를 다시. 가장 낮은 가능한 노출 시간은 0.5 s.
      2. 이미지가 표시 첫 번째 노출 시간에만 희미 한 유전자 발현, 증가 노출 시간 2 분 및 다시. 이미지 탈환 때마다 데이터 되므로 선택한 폴더에서 설정한 모든 이미지는 나중에 추가 분석에 사용할 수 있는.
   8. 쥐의 후속 연습장에 대 한 이미징 단계를 반복 합니다.
   9. 이미징 시스템에서 쥐를 제거 합니다. 가스를 해제 합니다. 챔버, nosecones, 및 이미징 단계 청소. 컴퓨터 프로그램을 닫습니다.
      참고: 소프트웨어 "데이터 집합을 저장"을 물어볼 것입니다. 이 데이터 집합, 데이터 자체에 조작을 말합니다.
      1. 규모와 관심사 (ROIs)의 영역에 변경 사항을 저장 하려면 "예"를 클릭 합니다. 이미지에 대 한 원래 설정으로 다시 돌아가려면 "아니오"를 클릭 합니다.
   10. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. "도구 팔레트" 클릭 "ROI 도구." 동그라미 아이콘을 클릭 하 고 주위 4 개의 사각형으로 빨간색 타원으로 표시 이미지 창에서 새로운 투자 수익을 드롭 다운 메뉴에서 "1"을 클릭 합니다. 빨간색 사각형 위에 마우스 커서를 배치 하 고 주입된 신장 overlaying 보라색 영역을 묶는 데 드래그 하 여 투자 수익의 크기를 조정 합니다.
       1. ROI에 빨간색 사각형 위에 커서를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 다음 이미지 창에서 새로운 투자 수익을 만들고 마우스 이동 "ROI 복제"를 선택 합니다. 이미지에 마우스를 모두 확인해 ROI 주입된 신장 이상 때까지 절차를 반복 합니다.
       2. 이미지 바로 위에 메뉴에서 "단위"에서 변경 "카운트" "빛 (광자)." "도구 팔레트"에서 투자 수익 데이터를 내보내려면 "ROI 도구"를 클릭 한 다음 측정의 스프레드시트를 만들려고 연필/눈금자 아이콘을 클릭 하십시오. "Avg 빛남" 측정을 사용 하 여 선택의 데이터 분석 및 통계 프로그램에 추가 분석에.
3. 설명된¹¹으로 섹션의 얼룩을 수행 합니다.
   참고: 주입은 하지 transfect 전체 신장 동등 하 게 그래서 다른 섹션 다른 transfection 효율¹¹을 사로잡을 것입니다. 형광 라텍스 스피어 지역 식별할 수 있습니다 같은 구슬의 공동 주입 transgene 양성 (그림 3D)¹¹것으로 예상. 얼룩 프로토콜의 최적화는 매우 중요 하다.
4. 서쪽 오 점 transfected 신장에 관심사의 유전자를 식별 하기 위해 수행 합니다.
   참고: 단백질 추출에 대 한 장기의 수확은 얼음에 수행 되어야 합니다. 다시,이 지역 수 없습니다가 되어 페 잘으로 장기의 작은 조각을 사용 하지 마십시오. Transfection는 장기에 걸쳐 고르게 분포 되어 너무 다른 영역을 결합 하 고 그들을 풀. 은닉 transgene 제품 순환¹¹에서 찾을 수 있어야 예상 된다 그래서 신장 골반 유체 주입 생산 호르몬 리스로 플라스 미드의가, 겸손 상승 결과.
5. Transgenes의 장기 고급 식, cyclophosphamide 같은 면역 작용 통합 벡터 시스템을 결합. transgene에 면역 반응을 주 주사를 다음과 같은 몇 가지는 처음에 발생 하 고 강력한¹¹.

결과

수술 및 주입 기술 하 게 수행 하기 위해 한번 마스터, 주요 장비 또는 비싼 물자를 요구 있습니다. 새로운 측면 절 개 신장 수술을 하는 경우 1 훈련 일 안락사 예정 여러 쥐에 있는 쥐 복구 된 다음 수술 때문에 하지 않습니다이 수술에서 첫 번째 시도 보다 훨씬 더 오래 걸릴 수 있습니다 허용 되어야 한다. 또는, 유사한 기술을 익힐 수 사관 간단 하 찾을 수 있습니다.

토론

이 프로토콜에서 신장에 특히 재현 유전자 발현을 달성 하기 위한 강력한 메서드를 설명 합니다. 적당히 경험 있는 외과 의사의 손에 우리 쥐 마우스 나이 따라 50-100%의 범위와는 transgene의 판독의 감도에이 기술에 의해 페의 비율을 발견 했다. Luciferase 유전자 발현의 수준 배경 위에서 마우스 piggyBac transposons 수신에 몇 달 동안 되었고 완전히 immunocompromised 쥐 같은 transposons¹¹

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947	Anesthetic - Not controlled substance
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch	Cardinal Health	309306	Required syringes
Buprenex	Pharmacist/Veterinarian		Analgesia - Controlled Substance
Dynarex Disposable Towel Drape	Thermo Fisher Scientific	19-310-671	Place over heat pad
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Use only endotoxin-free plasmid DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control	Charles River	PC200	Positive control for endotoxin test
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial	Charles River	R13500	Endotoxin test
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5882	Surgical tool
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9"	Thermo Fisher Scientific	01-812-51	For autoclaving surgical tools
Gaymar Heat Pump	Paragon Medical	TP-700	Water-circulating heat pump
Germinator 500	Roboz Surgical Instrument	DS-401	To reuse surgical tools during surgery
Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5136	Surgical tool
Graefe Tissue Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5153	Surgical tool
Halsey Needle Holder, 5" Length	Roboz Surgical Instrument	RS-7841	Surgical tool
Heat pads - 15" x 21" - need at least 3	Paragon Medical	TP22G	For use with Gaymar Heat Pump
IsoFlo (Isoflurane, USP)	Abbott Animal Health	5260-04-05	For imaging and euthanasia
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor	Smiths Medical	VCT3K2	For imaging and euthanasia
Ketamine	Pharmacist/Veterinarian		Anesthetic - Controlled Substance
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Laboratory tissues
Living Image software	Caliper Life Sciences		For live animal imaging
Luciferin	Perkin Elmer	122796	For live animal imaging
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000-US-CAN	Spectrophotometer for DNA measurement
Prevantics Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-100-110	For skin surgery prep
Prolene 5-0 sutures Taper 30"	Thermo Fisher Scientific	NC0256891	Non-absorbable sutures for skin
Puralube Brand Opthalmic Ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572	To keep eyes moist during surgery
Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution	Mirus Bio	MIR-5240	Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA
Vicryl 5-0 Sutures J303H	Thermo Fisher Scientific	NC9816710	Absorbable sutures for muscle layer
Wahl Mini Arco Clipper	Med-Vet International	8787-1550	Shaver for skin prep
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences		For live animal imaging