قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Summary

إنفلونزا تحييد الأجسام المضادة ترتبط بحماية عدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي قياس تحييد الأجسام المضادة في الأمصال البشرية، وغالباً ما تستخدم للأنفلونزا البشرية علم الأمصال. يصف لنا الإنزيم درياقي استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس تحييد الأجسام المضادة التتر المعاصرة فيروسات A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a عقب التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى.

Abstract

تحييد الأجسام المضادة ضد هيماغلوتينين (هكتار) من فيروسات الإنفلونزا تعتبر الآلية المناعية الرئيسية التي ترتبط بحماية لعدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي (مينيسوتا) كثيرا ما تستخدم لقياس استجابات جسم تحييد في الأمصال البشرية بعد التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى. خلايا الكلي داربي الكلاب مدين (مدك) هي الركيزة الخلية المستخدمة عادة لفحوصات دقيقة. ومع ذلك، المتداولة حاليا قد اكتسبت فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a تبديل مستقبلات ملزم خصوصية. ثبت خط الخلية مدك-SIAT1 مع زيادة 2، 6 α سيليك اللبن مويتيس على السطح توفر العدوى محسنة وتكرار أكثر إخﻻصا من الخلايا مدك التقليدية لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. هنا، نحن تصف مقايسة MN استخدام الخلايا مدك-SIAT1 التي تم الأمثل للتحديد الكمي لتحييد التتر الأجسام المضادة لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. في هذا البروتوكول، الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 100₅₀/جيدا من فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروسات. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ للسماح A(H3N2) الفيروسات تصيب خلايا مدك-SIAT1. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، لوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل جيدا قبل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) المضادة الإنفلونزا باستخدام الأجسام مضادة البروتين النووي (NP). ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يقضي على تثبيط % إيه فايف زيرو من فيروس العدوى.

Introduction

تواصل فيروسات الإنفلونزا تتسبب في معدلات الاعتلال والوفيات في البشر كل سنة. ها هو بروتين سكري السطحية الرئيسية من فيروسات الإنفلونزا. تحييد الأجسام المضادة التي تستهدف ها هي الآلية المناعية الرئيسية الذي يرتبط بالحماية من الإصابة بالإنفلونزا^1،2. هيماجلوتينيشن تثبيط (مرحبا) فحوصات وفحوصات دقيقة هي نوعان من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لقياس استجابات جسم الإنسان سيرا بعد العدوى أو التطعيم ضد الإنفلونزا³. المقايسة مرحبا تدابير تثبيط الأضداد hemagglutination الفيروس من خلايا الدم الحمراء، ويعتبر تحليل مركب. على عكس مرحبا، مقايسة MN مباشرة قياس مستويات الأجسام المضادة في الأمصال البشرية التي تحييد عدوى الإنفلونزا في الثقافات الخلية. مدك الخلايا غالباً ما تستخدم في عزل فيروس الإنفلونزا وفحوصات MN⁴.

فيروسات الإنفلونزا باستمرار الخضوع للانجراف مستضدي والتحول، والحصول على طفرات في البروتينات هكتار التي يمكن أن تغير من خصوصية ملزم مستقبلات لفيروسات. منذ عام 2014، ظهرت مجموعات جديدة من الفيروسات A(H3N2) وواصل أن يعمم حتى الموسم الحالي. أن غالبية هذه الفيروسات تنتمي إلى المجموعة الوراثية 3C.2a و 3C.3a على أساس تحليل النشوء والتطور من البروتينات هكتار. العديد من الفيروسات 3C.2a المتداولة قد قللت من قدرة على هيماجلوتيناتي خلايا الدم الحمراء و ولذلك لا يمكن أن توصف ب فحوصات مرحبا⁵. يجب استخدام تحييد فحوصات لقياس استجابات الأجسام المضادة لهذه الفيروسات التي لا هيماجلوتيناتي⁶. وعلاوة على ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن هذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة غيرت خصائص ربط مستقبلات مقارنة مع سابق A(H3N2) الفيروسات، وتميل إلى أن تتراكم الطفرات الثقافة تكييفها وتعدد الأشكال عند باساجيد في الخلايا في المختبر الثقافات^7،،من⁸⁹. بالمقارنة مع التقليدية مدكك الخلايا، مدكك-SIAT1 وخط خلية وضعتها ماتروسوفيتش et al. من خلال مستقرة من تعداء الخلايا مدك مع كدنا للبشرية α2، 6-سيالترانسفيراسي (SIAT1). هذا خط الخلية تعرب عن زيادة كميات من α2، مويتيس 6-سيليك اللبن وانخفاض كميات من α2، مويتيس حمض 3-سيليك من الأصل مدك الخلايا¹⁰. وقد أظهرت الخلايا مدك-SIAT1 لتحسين معدلات العزل للفيروسات A(H3N2) مقارنة مدك الخلايا¹¹. ومؤخرا، لين et al. وذكرت أن للنشأة 3C.2a و 3C.3a البشرية A(H3N2) فيروسات الإنفلونزا، تحققت تكرار الفيروس أكثر إخﻻصا وأفضل فيروس العدوى عندما كانت فيروسات المستزرعة في خطوط الخلايا مدك-SIAT1 مقارنة مع مدك الخلايا⁷. وهكذا، الخلايا مدك-SIAT1 هي أفضل في فحوصات دقيقة لوصف استجابات الأجسام المضادة للمجموعات الأخيرة من الفيروسات A(H3N2).

هنا يصف لنا مقايسة مينيسوتا استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس استجابات جسم 3C.2a المعاصرة وفيروسات A(H3N2) 3C.3a في الأمصال البشرية. فيروسات تزرع في البيض أو خلايا يمكن استخدامها في هذا التحليل. الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 100₅₀/جيدا من إنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروس. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ للسماح للفيروس A(H3N2) تصيب خلايا مدك-SIAT1، وتكرار. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، اللوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل بئر بإليزا استخدام المضادة الإنفلونزا "التي أرستها" الأجسام المضادة. الكشف عن الحزب الوطني يشير إلى وجود الإصابة بالفيروس وعدم تحييد الأجسام المضادة. ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يوفر ≥ 50 ٪ تثبيط فيروس العدوى.

Protocol

ينبغي أن تعالج جميع فيروسات الإنفلونزا وفقا لمتطلبات مستوى السلامة المناسبة (BSL-2 أو أعلى) كما هو معرف في السلامة الأحيائية على الأحياء المجهرية والمختبرات الطبية الحيوية (بمبل)¹².

1-إعداد الكواشف وانطلاق المواد

1. إعداد الخلايا مدك-SIAT1 وخلية العقيمة الثقافة المتوسطة
   1. إعداد مدك-SIAT1 خلية الثقافة المتوسطة باستخدام 500 مل من النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو) مع ارتفاع الجلوكوز، 10% v/v الحرارة إبطال المصل البقري الجنين (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، سلفات 1 ملغ/مل G418 (مثلاً، جينيتيسين)، و 100 يو/مليلتر البنسلين مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (اختياري). تعقيم بترشيح من خلال غشاء حجم مسام 0.2 ميكرون. تتم إضافة كبريتات G418 لضمان الاستقرار بلازميد في الخلايا مدكك-SIAT1.
   2. إعداد خط الخلية مدك-SIAT1 . في 162 سم²-زراعة الأنسجة flask(s) تحتوي على 30 مل وسائط الثقافة الخلية العقيمة، البذور قوارير مع 2-2.5 × 10⁶ مدك-SIAT1 الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO₂ لمدة يومين؛ وسوف يستخدم هذا لتحديد الجرعة المعدية (تسيد) زراعة الأنسجة والمنغنيز فحوصات.
      ملاحظة: يرجى قدمت الخلايا مدك-SIAT1 د. م. ماتروسوفيتش، ماربورغ، ألمانيا¹⁰. هذا الخط خلية يمكن أيضا الحصول عليها تجارياً (انظر الجدول للمواد).
2. تعد وسائل الإعلام نشر الفيروسات العقيمة باستخدام 500 مل من الجلوكوز عالية دميم، 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، 0.3% ألبومين المصل البقري (BSA) جزء الخامس، و 20 ملم حبيس. تعقيم بترشيح من خلال غشاء حجم مسام 0.2 ميكرون.
3. إعداد 0.75% (v/v) خلايا الدم الحمراء خنزير غينيا (جبربكس) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 0.01 متر، في الرقم الهيدروجيني 7.2.
4. تعد الفيروسات معقم مخفف باستخدام دميم الجلوكوز ارتفاع 1% V الكسر الزلال البقري (BSA)، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل وعيار 20 ملم حبيس. تعقيم بالترشيح بغشاء حجم مسام 0.2 ميكرون، وتعد طازجة لكل فحص.
5. إعداد مثبت خلية الباردة الأسيتون البارد 80% في برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2).
6. إعداد يغسل المخزن المؤقت باستخدام برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.2) و 0.3% (v/v) توين-20.
7. إعداد جسم مخفف باستخدام برنامج تلفزيوني (0.01 M برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2)، 0.3% (v/v) توين-20، و 5% الخالي من الدسم اللبن المجفف.
8. استخدام المضادة الإنفلونزا "التي أرستها" الماوس [مونوكلونل] جسم استنساخ A1 و A3 تجمع جسم الأولية. تضعف بجسم مادة في تركيز الأمثل كما يحددها المعايرة.
9. الماعز استخدام الماوس المضادة مفتش مترافق لحصان الفجل البيروكسيديز (HRP) جسم الثانوية. تضعف بجسم مادة في تركيز الأمثل كما يحددها المعايرة.
10. تعد الركيزة البيروكسيديز استخدام هيدروكلوريد-فينيلينيدياميني س(العيادات الخارجية) في المخزن المؤقت لسترات الفوسفات 0.05 متر مكعب في درجة الحموضة 5. إعداد المخزن المؤقت سترات الفوسفات 0.05 متر مكعب بإذابة 1₂ح كبسولة 100 مل منزوع اللوحي O. حل 1 العيادات الخارجية (10 ملغ)/20 مل من الفوسفات سترات العازلة مباشرة قبل الاستخدام.
11. استخدام 0.5 M من حمض الكبريتيك العيادات الخارجية وقف الحل. إضافة مل 28 م 18 حمض الكبريتيك المخزون إلى منزوع 972 مل ح₂س في غطاء كيميائية.
12. علاج الأمصال البشرية والحيوانية
    1. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال البشرية المستخدمة في فحوصات دقيقة في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل المقايسة. استخدامها على الفور أو إذا لزم الأمر، بتخزين الأمصال المذابة في 4 درجات مئوية للا تزيد عن 24 ساعة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة أطول التخزين، تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
    2. علاج الأمصال الحيوانية المستخدمة في فحوصات دقيقة مع الإنزيم يدمر مستقبلات (استخلاص) وإلغاء تنشيط الحرارة قبل المقايسة كما يلي.
       1. ذوبان الجليد الأمصال في حمام مائي 37 ˚C ثم ضع على الجليد. مزيج 1 حجم عينة مصل الحيوان مع 3 مجلدات للتدمير. احتضان في ˚C 37 ح 18-20.
       2. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال استخلاص تعامل في ˚C 56 للحد الأدنى 30 6 إضافة مجلدات لبرنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2 لكل عينة لإضعاف ما قبل نهائية من 01:10. إذا لزم الأمر، بتخزين الأمصال المذابة في 4 درجات مئوية للا تزيد عن 24 ساعة؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة أطول التخزين، تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
          ملاحظة: قد تحتوي على الأمصال الحيوانية جليكانس الحامض اللعابي المختلفة التي قد ربط قد فيروسات الإنفلونزا وتحول دون ربط مكافحة الإنفلونزا على حدة-ها الأجسام المضادة. ولذلك، من الضروري استخلاص علاج جميع الأمصال الحيوانية قبل فحوصات دقيقة لإزالة هذه الاضبارات هكتار الفيروسية غير محددة في عينات مصل الدم.

2-إقرار ثقافة الخلية مدك-SIAT1

ملاحظة: يجب إجراء جميع الثقافات الخلية في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع التلوث.

1. صب مستنبت الخلية من المونولاير الخلية في قوارير² 162 سم. تريبسينيزي الخلايا بدهن المونولاير مع يدتا التربسين. إضافة 5 مل التربسين-يدتا لتغطية أحادي الطبقة الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حتى ينفصل أحادي الطبقة (5-10 دقيقة). إضافة 15 مل من مدك-SIAT1 خلية ثقافة وسائل الإعلام إلى كل قارورة تحتوي على خلايا تريبسينيزيد، ماصة صعودا وهبوطاً لفصل الخلايا.
2. استخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق لتحديد الخلية بحساب والجدوى. بذور الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة² سم 162 جديدة تحتوي على 30 مل من خلية ثقافة الإعلام مع 2-2.5 × 10⁶ خلايا/flask واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة يومين لاستخدامها في فحوصات تسيد والمنغنيز. بذور الخلايا في 4-5 × 10⁶ خلايا/قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة يومين لاستخدامها في نشر الفيروسات.
   ملاحظة: يمكن ضبط كثافة البذر إذا هي رغبت في فترات أقصر أو أطول من الثقافة. لانتشار الفيروس، الخلايا ينبغي أن تصل إلى ما يزيد على 100% كونفلوينسي. لفحوصات جرعة العدوى زراعة الأنسجة (تسيد) والمنغنيز، ينبغي أن الخلايا كونفلوينسي 75-95% (الشكل 1).

3-نشر فيروسات A(H3N2) في خلايا مدك-SIAT1

ملاحظة: يمكن نشر الفيروسات A(H3N2) أما في 10-11 يوم بيض الدجاجة امبريوناتيد القديمة وفقا لبروتوكول قياسي³، أو خلية مدك-SIAT1 الثقافات. خلايا SIAT1 مدك ينبغي أن تصل إلى ما يزيد على 100% كونفلوينسي لفيروس التطعيم. ويمكن تلقيح مخزونات البذور الفيروس مع تخفيف العديد من العدوى. يمكن استخدام تخفيف العدوى مع موسم الحصاد أفضل هكتار والعدوى لفحوصات دقيقة كذلك.

1. إزالة مستنبت الخلية من أحادي الطبقة الخلية (> 100% كونفلوينسي) في قوارير² 162 سم. أغسل المونولاير مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني م 0.01 العقيمة، الرقم الهيدروجيني 7.2، وصب.
2. 1 قارورة كعنصر تحكم تسمية وإضافة 20 مل من وسائل الإعلام في نشر الفيروسات. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂. ترك هذا قارورة لم يمسها وتستخدم للمقارنة بعد اليوم الأول من انتشار الفيروس.
3. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام نشر الفيروسات عقيمة flask(s) واحتضان جميع flask(s) في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂. ذوبان الجليد قنينة مخزون فيروس الإنفلونزا في درجة حرارة الغرفة ثم ضعه على الجليد. تضعف مع وسائل الإعلام نشر الفيروسات إلى تخفيف المستهدفة.
   ملاحظة: الهدف تخفيف يمكن تعديلها استناداً إلى التتر هكتار من مخزون فيروس. المخفف لإعداد 1: 1000 العدوى، إضافة 100 ميليلتر من الفيروس إلى 9.9 مل من وسائل الإعلام نشر الفيروسات العقيمة. عكس بلطف، إزالة 1 مل تمييع 1: 100 لمل 9 لوسائل الإعلام في نشر الفيروس العقيمة، عكس برفق للعدوى 1: 1000 المخفف. ضع على الجليد.
4. إزالة قوارير جميع ما عدا التحكم قارورة من الحاضنة. قم بإزالة وسائط نشر الفيروس من flask(s) الخلايا SIAT1 مدك وتطعيم كل قارورة مع 10 مل فيروس المخفف. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 1، تناوب flask(s) كل 15 دقيقة.
5. إزالة 5 مل العدوى من flask(s) واستبدل بالفيروس 15 مل نشر الوسائط التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل تبكك-التربسين. احتضان flask(s) عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 16-18.
6. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، مراقبة flask(s) تحت 100 × تكبير المجهر والبحث عن الآثار سيتوباثيك (CPE) في الخلايا. إزالة مل 15-17 من الفيروسات طافية من flask(s)، واستبدال مع مل 15-17 من الفيروسات المحضرة نشر الوسائط التي تحتوي على 2 ميكروغرام/مل تبكك-التربسين.
7. احتضان قوارير على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂. مراقبة التعليم المهني المستمر لأحادي الطبقة (مقارنة بقارورة مراقبة الخلية) وفحص ها بشكل دوري (كل ح 4) مع جبربك 0.75 في المائة حتى الحصاد.
   1. إعداد صفيحة microtiter 96 هكتار، حسنا. إضافة 50 ميليلتر من 0.01 م برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى الآبار A2-A12 و B2-B12 (مكررة)، والآبار H1-H12 لعنصر التحكم.
   2. إضافة 100 ميليلتر من الفيروسات طافية A1 و A2، أداء إضعاف إضعاف مسلسل من A1 و B1 عن طريق A12 و B12. تجاهل 50 ميليلتر بعد خلط في A12 و B12. إضافة 50 ميليلتر من جبربكس 0.75 في المائة إلى صفوف أ وب ه.
   3. اضغط على اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      1. تحديد هكتار فيروسات طافية بإمالة لوحة microtiter 96-جيدا في 45° بزاوية 60 درجة.
      2. قراءة لوحات hemagglutination؛ ويعتبر أعلى إضعاف الفيروس الذي يحقق hemagglutination كاملة نقطة نهاية المعايرة هكتار للفيروس محددة. سجل المتبادلة لإضعاف الفيروس أعلى مع هيماجلوتينيشن كاملة كعيار هكتار من الفيروس.
         ملاحظة: ينبغي بدء "تشغيل" كرات الدم الحمراء تمت تسويتها في صف ح (عناصر) وتشكيل شكل دمعة صغيرة بسبب خطورة. الانتظار حتى كرات الدم الحمراء في السيطرة على آبار إنهاء قيد التشغيل، ثم قراءة الأزرار ربك في الفيروس معايرة الآبار. تلك التي تظهر أزرار ربك و "تشغيل"، لا تحقق هيماجلوتينيشن. قم بتحديد موقع إضعاف أعلى من الفيروسات التي تمنع hemagglutination تماما كعيار هكتار نقطة النهاية لهذا الفيروس.
8. حصاد الفيروس عند هضاب هكتار ثقافة الفيروس أو ثقافة الفيروس يصل إلى هدف ها (على سبيل المثال، > هاو 16)، ولكن قبل الخلية يبدأ أحادي الطبقة لعرض CPE كبيرة.
   1. الطرد المركزي ثقافة الفيروس طافية على 300 غرام x لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه الحطام الخلوية. نقل المادة طافية توضيح تحتوي على الحصاد الفيروس إلى أنبوب نظيفة. الكوة المادة طافية المحتوية على الفيروس الحصاد في قنينات المبردة معقمة تستخدم مرة واحدة وتجمد فورا-70 درجة مئوية أو برودة.
      ملاحظة: يجب أن يكون مخزون الفيروسات المستخدمة لفحوصات دقيقة عيار المعدية عالية والحد الأدنى من جسيمات معيبة. إضعاف الحد الأدنى مخزون الفيروس تحقيق تسيد 100₅₀50 ميليلتر للمقايسة مينيسوتا 1: 100.
      ملاحظة: مخزون الفيروس المستخدمة في فحوصات MN ينبغي عدم إذابة وريفروزين.

4-تحديد تسيد الفيروس

1. يوم 1: معايرة الفيروس
   1. ذوبان الجليد قنينة فيروس في درجة حرارة الغرفة والمكان فورا على الجليد.
   2. اختبار الفيروس في تخفيف انطلاق مختلفة اثنين: 10^-2 و 10^-3. إضافة 100 ميليلتر من الفيروس إلى 9.9 مل من مادة ل 10^-2 إضعاف الفيروس. أضف 1 مل من 10^-2 إضعاف لمل 9.0 من الفيروس مادة ل 10^-3 إضعاف.
   3. استخدام microtiter اثنين اللوحات (لوحة 1 على 10^-2 إضعاف) ولوحة 2 ل 10^-3 إضعاف، إضافة 100 ميليلتر من الفيروس مادة لجميع الآبار باستثناء العمود 1 من لوحة ميكروتيتير 96-جيدا.
   4. إجراء تخفيف₁₀ ½log (10^-2، 10^{-2، 5}، 10^-3، إلخ). إضافة ميليلتر 146 من الفيروس ابتداء من إضعاف لجميع الآبار في العمود 1 ونقل ميليلتر 46 متسلسل من العمود 1 من خلال العمود 11 (الشكل 2). نصائح ماصة التغيير بين الآبار. بعد خلط العمود 11، تجاهل النصائح مع تمييع ميليلتر 46.
   5. استخدام عمود 12 كمراقبة الخلية (CC)؛ إلا أنه يحتوي على فيروس مخفف. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%_2-
2. يوم 1: إعداد الخلايا مدك-SIAT1
   ملاحظة: ينبغي التوصل إلى أحادي الطبقة خلية مدك-SIAT1 كونفلوينسي 75-95% لفحوصات تسيد والمنغنيز. قارورة 162-سم² واحد في كونفلوينسي 95% ينبغي أن تسفر عن خلايا كافية إلى البذور ~ لوحات ميكروتيتير 4-5.
   1. أغسل المونولاير المتلاقية 75-95% مع 20 مل برنامج تلفزيوني لإزالة FBS في ثقافة وسائل الإعلام. تريبسينيزي الخلايا كما يلي.
      1. شطف في أحادي الطبقة مع PBS العقيمة، إضافة 7 مل التربسين-يدتا لتغطية أحادي الطبقة الخلية. تكمن في قارورة مسطحة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حتى ينفصل أحادي الطبقة (حوالي 5-10 دقيقة). إضافة 7 مل فيروس مادة لكل قارورة تحتوي على خلايا تريبسينيزيد.
   2. تغسل الخلايا مع فيروس مخفف لإزالة FBS.
      1. بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل؛ ملء الأنبوب مع فيروس مخفف.
      2. الطرد المركزي في ز 485 x 5 دقيقة صب مادة الفيروس واستبدالها جديدة 50 مل فيروس مخفف، والطرد المركزي في 485 x ز لأدنى 5 صب مادة الفيروس واستبدال مخفف فيروس جديد (10 مل/قارورة) ريسوسبيند بيليه.
   3. استخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا والجدوى. ضبط تركيز الخلية بالفيروس مادة إلى 1.5 × 10⁵ خلايا/مل.
   4. إضافة 100 ميليلتر المخفف مدك-SIAT1 الخلايا لكل بئر من لوحات ميكروتيتير (1.5 × 10⁴ خلايا/البئر) وتغطي اللوحات. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 18-20.
3. يوم 2: أليسا
   1. تثبيت خلايا
      1. إزالة المتوسطة من لوحات ميكروتيتير. تغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميليلتر الباردة الأسيتون 80% لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 إزالة مثبت وتسمح لوحات للهواء الجاف.
   2. أليسا
      1. إضافة جسم الأولية
         ملاحظة: يجب استخدام المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم في الزائدة كجسم الأولية في أليسا. تحديد إضعاف جسم المثلى لكل الكثير من الأجسام المضادة الأولية عن طريق إجراء المعايرة الأضداد في مينيسوتا. حدد تركيز الأجسام المضادة الأولية في الزائدة ومع أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية.
         1. تمييع المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم (جسم الأولية) إلى تركيز الهدف في جسم مادة (مثل إضافة 30 ميليلتر من جسم الأولية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف هدف 1: 1000).
         2. غسل الأطباق 3 مرات مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. إضافة 100 ميليلتر جسم الابتدائي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      2. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
         ملاحظة: ماعز المضادة للماوس مفتش مترافق فجل الحصان ينبغي أن تستخدم البيروكسيديز (HRP) في الزائدة كجسم الثانوية في أليسا. تحديد إضعاف جسم المثلى لكل الكثير من الأجسام المضادة الثانوية بإجراء معايرات أضداد. حدد تركيز الأجسام المضادة الثانوية في الزائدة ومع أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية.
         1. تمييع الماعز الماوس المضادة مترافق مفتش لبرنامج الصحة الإنجابية الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) لتركيز الهدف في جسم مادة (مثل إضافة 7.5 ميليلتر من جسم الثانوية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف 1:4000 مستهدفة).
         2. أغسل لوحات 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. إضافة 100 ميليلتر جسم الثانوي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
      3. قراءة اللوحة وإضافة الركازة
         1. غسل الأطباق 5 مرات مع 300 ميليلتر يغسل المخزن واضغط على مسح خالية من الوبر.
         2. إضافة 100 ميليلتر من الركازة طازجة لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يشبع وضع اللون والكثافة البصرية (OD) خلية مراقبة الآبار < 0.2.
         3. إضافة 100 ميليلتر لوقف الحل لجميع الآبار. قراءة OD آبار في 490 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروسكوبية.
4. تسيد ₅₀ حساب
   1. حساب متوسط OD₄₉₀ من عناصر الخلية (عمود 12).
   2. النظر في أي اختبار جيد مع OD₄₉₀ أكبر من ضعف متوسط OD₄₉₀ من الآبار CC التي وصفها بأنها "إيجابية"؛ خلاف ذلك، فإنه يعتبر من "سلبية".
   3. حساب تسيد₅₀ من الفيروس باستخدام أسلوب مونش ريد¹³.
      1. تحديد العدد من الإيجابيات والسلبيات في كل تمييع.
      2. حساب "تراكمية إيجابية"، "التراكمية السلبية"، "نسبة"، و "% إيجابية" كما هو موضح في الجدول 1.
      3. حساب "متناسبة مع المسافة" بين عرض تمييع > 50% إيجابيات وعرض تمييع < إيجابيات 50% باستخدام ما يلي:
         
         ملاحظة: عامل التصحيح لتمييع سجل ½ هو 0.5. على سبيل المثال، في الجدول 1: (80 − 50)/(80 − 20) × 0.5 = 0.25
      4. حساب الفيروس تسيد₅₀ عن طريق إضافة المسافة النسبية لإضعاف عرض > 50% إيجابية.
         ملاحظة: على سبيل المثال، في الجدول 2، تسيد₅₀ من 10^-5+(-0.25) = 10^-5.25. ملاحظة هذا هو تسيد₅₀ من الفيروس الواحد 100 ميليلتر (أو 10^-5.25100 ميليلتر).
   4. حساب إضعاف الفيروس. لفحوصات دقيقة، يضعف الفيروس إلى تسيد 200₅₀100 ميليلتر (ما يعادل 100 ميليلتر₅₀50 تسيد كل بئر).
      ملاحظة: في المثال الوارد في الجدول 1، 1 تسيد₅₀ هو 10^-5.25 في 100 ميليلتر، وهو إضعاف لتحقيق تسيد 200₅₀100 ميليلتر 1:891 استناداً إلى الحسابات: 200 × 10^-5.25 = 10^-2.95 = 1/10^2.95 = 1 /891

5-مينيسوتا الفحص باستخدام خلايا مدك-SIAT1

1. يوم 1: اختبار ومراقبة الأمصال التحضير ولوحة التخطيط
   1. ذوبان الجليد الأمصال في حمام الماء 37 درجة مئوية وإزالة فورا بعد ذوبان الجليد. قاسمة كمية الأمصال التي تحتاج إلى اختبار؛ الحد أدنى من 10 ميليلتر من الأمصال الأصلي مطلوب لاختبار فيروس واحد في القميص. اختبار الأمصال في التكرارات إذا كان ذلك ممكناً.
   2. الحرارة إلغاء تنشيط الأمصال البشرية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 56 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 1.12.1. مكان سيرا على الجليد وظيفة المنظمة الحرارة، بإضافة مخفف الفيروس الأمصال لتحقيق 01:10 إضعاف ما قبل.
   3. استخلاص علاج وتمييع الأمصال الحيوانية إلى 01:10 ﻻستخدام عناصر تحكم كل 1.12.2 مسبقاً.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأمصال البشرية والحيوانية المذابة والمعالجة عند 4 درجة مئوية للم يعد من 24 حاء ينبغي تخزين الأمصال المجمدة في-20 درجة مئوية أو أبرد إذا أطول فترة التخزين المسبق قبل المقايسة.
   4. لاختبار مع أحد الفيروسات، قم بإضافة 100 ميليلتر 01:10 إضعاف سيرا إلى أعمدة A1 إلى A10 (الشكل 4). إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة إلى صفوف ب من خلال ح، ما عدا أعمدة 11 و 12 (الشكل 4). أداء إضعاف إضعاف مسلسل من صفوف A إلى H، وتجاهل آخر 50 ميليلتر في صف ح (الشكل 4).
      ملاحظة: عندما يكون اختبار فيروسات متعددة، يمكن أن تضعف الأمصال في أنابيب عيار. تخفيف المصل، لأن الغرض من تحديد عيار المصل، في ألف جيدا 01:10، جيدا ب 01:20، وكذلك ج 01:40، 1:80 د حسنا، حسنا ه 1:160، جيدا و 1:320، 1:640 ز جيدا، كذلك ح 1:1,280 (الشكل 4).
   5. لمراقبة الفيروسات، إضافة 50 ميليلتر من فيروس مخفف لآبار A12، B12، C12 و D12 (لا سيرا). لمراقبة الخلية، إضافة 100 ميليلتر من فيروس مخفف لآبار E12 F12، G12 و H12 (أي فيروس، لا سيرا).
   6. للأمصال التحكم (على سبيل المثال، عناصر تحكم النمس سيرا)، إضافة 100 ميليلتر من مراقبة المخفف سيرا حسنا عمود 11 وإضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة إلى آبار B11-H11. المسلسل مخفف إلى أسفل.
   7. تغطي اللوحات، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ حتى جاهزة لإضافة الفيروس.
2. يوم 1: إضافة الفيروس
   1. يضعف هذا الفيروس إلى تسيد 100₅₀50 ميليلتر مع الفيروس مادة.
   2. إضافة 50 ميليلتر الفيروس المخفف لجميع الآبار، باستثناء العمود 11 على لوحات المعايرة الخلفية (BT) وآبار مراقبة الخلية E12 F12، G12 و H12 في جميع لوحات (الشكل 4). لهذه اللوحات مع مراقبة الأمصال في العمود 11، إضافة الفيروس إلى العمود 11.
   3. يعود المعايرة (BT)
      1. وتشمل بريتيش تيليكوم في العمود 11 من مجموعة واحدة من لوحات مكررة (على سبيل المثال، لوحة 1A و 1B). إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة لجميع الآبار في العمود 11. إضافة 50 ميليلتر من الفيروس في تسيد 100₅₀50 ميليلتر للبئر الأولى (A11). مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
      2. خلط ونقل 50 ميليلتر لآبار المتعاقبة لإجراء تخفيف المسلسل إضعاف. تغيير نصائح ماصة بين الآبار لتجنب الفيروسات المرحل. تجاهل 50 ميليلتر من H11 جيدا.
      3. إضافة 50 ميليلتر من الفيروس مادة للعمود 11 إحضار وحدة التخزين النهائي إلى 100 ميليلتر. اضغط على لوحات لمزيج.
   4. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 1.
   5. تؤدي إضافة خلية مدك-SIAT1 في يوم 1 وإليزا في اليوم 2 كما هو موضح في الخطوات 4.2 و 4.3 (كما هو موضح في 5.3 و 5.4)
3. يوم 1: إضافة خلية مدك-SIAT1
   1. إعداد الخلايا مدك-SIAT1 كما هو موضح في الخطوة 4، 2. إضافة خلايا مدك-SIAT1 ميليلتر 100 في 1.5 × 10⁵ خلايا/مل لكل بئر (1.5 × 10⁴ خلايا/جيد). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 18-20.
4. يوم 2: أليسا
   1. وبعد الحضانة بين عشية وضحاها، اليوم الثاني، إصلاح الخلايا مع الأسيتون البارد 80% كما هو موضح في الخطوة 4، 3.
   2. إضافة جسم الأولية
      1. أغسل لوحات 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. تمييع المضادة الإنفلونزا A التي أرستها [مونوكلونل] جسم (جسم الأولية) إلى تركيز الأمثل حسبما تقرره المعايرة في جسم مخفف (مثل إضافة 30 ميليلتر من جسم الأولية إلى 30 مل جسم مادة لإضعاف هدف 1: 1000).
         ملاحظة: مطلوب 100 ميليلتر من جسم الابتدائي كل بئر. ~ 10 مل المسبق للوحة الواحدة.
      2. إضافة 100 ميليلتر جسم الابتدائي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   3. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
      1. غسل الأطباق 3 مرات مع 300 ميليلتر يغسل العازلة. تمييع الماعز المضادة للماوس مترافق مفتش إلى HRP الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) لتركيز الهدف في جسم مخفف (مثل إضافة 7.5 ميليلتر من جسم الثانوية إلى 30 مل جسم مادة 1:4000 هدف.)
         ملاحظة: 100 ميليلتر من جسم الثانوية مطلوب الواحدة 96 جيدا. ~ 10 مل المسبق للوحة الواحدة.
      2. إضافة 100 ميليلتر جسم الثانوي المخفف لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
   4. قراءة اللوحة وإضافة الركازة
      1. غسل الأطباق 5 مرات مع 300 ميليلتر يغسل المخزن واضغط على مسح خالية من الوبر.
      2. إضافة 100 ميليلتر من الركازة طازجة لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى آبار مراقبة الفيروس التطوير التنظيمي₄₉₀ = 0.8-3، مع مراقبة الخلية في أدنى مستوى الخلفية OD₄₉₀ < 0.2.
      3. إضافة 100 ميليلتر من الحل وقف لجميع الآبار. قراءة OD آبار في 490 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروسكوبية.
5. تحليل البيانات
   ملاحظة: الحسابات MN مصممون لكل لوحة على حدة.
   1. تحديد عيار الأجسام المضادة تحييد كل عينة المصل.
      1. حساب وقف₄₉₀ OD تحييد الفيروس 50% لكل لوح باستخدام المعادلة التالية:
         
         ملاحظة: هنا x = 50% إنتاج الأبطال. تخفيف المصل متبادلة المقابلة لإضعاف أعلى مع OD₄₉₀ يعتبر أقل من 50% الإنتاج (تثبيط % إيه فايف زيرو) عيار الأجسام المضادة الأبطال لأن عينة المصل (الشكل 5).
   2. تحقق من أن آبار مراقبة الخلية التطوير التنظيمي₄₉₀ < 0.2 وآبار مراقبة الفيروس لها التطوير التنظيمي₄₉₀ = 0.8-3.
   3. تحقق من العدوى الفيروس في كل مقايسة (100 x TCID₅₀) بفيروس تي. النطاق المقبول بريتيش تيليكوم 50 أو 100 أو 200 تسيد. في حالة استخدام نفس الوقف كما هو معرف في الخطوة 4.4.2، ينبغي أن يكون إضعاف الفيروس أعلى في العمود بريتيش تيليكوم مع التطوير التنظيمي أعلاه وقف إنتاج المواد الانشطارية في آبار E11، F11، G11.
      ملاحظة: يجب أن تعطي عناصر إيجابية المصل التتر داخل 2-fold من القيم التي تم الحصول عليها في الاختبارات السابقة. OD₄₉₀ من مراقبة سلبية المصل ينبغي أن تكون مشابهة للتي لوحظت بالنسبة لمكافحة الفيروسات.

النتائج

تحديد العدوى مخزون الفيروس هو الخطوة الأولى في التحليل MN. ويبين الشكل 2 تخطيط لوحة تحديد تسيد₅₀ مخزون الفيروس. لمخزونات الفيروس بالعدوى غير معروف، يمكن تيتراتيد الفيروس من تخفيف ما قبل متعددة، على سبيل المثال كل 10^-2 و 10^-3، من أجل التقاط أفض?...

Discussion

والرزن مينيسوتا واحد من الاختبارات الرئيسية المستخدمة للأنفلونزا الأمصال للكشف عن استجابات الأجسام المضادة بعد الإصابة بالإنفلونزا أو التطعيم. كثيرا ما تستخدم التتر المتولدة من فحوصات دقيقة النتيجة الأولية للعديد من الدراسات السيرولوجية الإنفلونزا. فحوصات دقيقة تستخدم على نطاق واسع أ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose	Life Science	11965	A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamine	Life Science	25030-081
Sodium pyruvate	Life Science	11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Life Science	15630-080
Penicillin/Streptomycin	Life Science	15140-122
Acetone	VWR	67-64-1	Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A510-P500	Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L	VWR	EM-AX0422-3	Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA	Life Science	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab	Millipore pool	MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP	KPL	074-1802
96-well flat-bottom plates	Thermo Scientific	3455
Plate reader	Molecular Device	Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap	Corning/VWR	3151