JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

Özet

Karşı hemagglutinin (HA) grip virüsleri nötralize antikor koruma için grip enfeksiyonları ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması olarak kabul edilir. Microneutralization (MN) deneyleri kez grip aşısı ya da enfeksiyon sonra insan sera içindeki nötralize antikor yanıtları ölçmek için kullanılır. MN deneyleri için yaygın olarak kullanılan hücre yüzey Madine Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerdir. Ancak, şu anda 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) grip virüsleri elde etmiş dolaşan reseptör bağlama özgüllük değişmiş. MDCK-SIAT1 hücre kültürünü artan α-2,6 sialik galaktoz moieties yüzeyi ile geliştirilmiş infektivite ve daha geleneksel MDCK hücreleri daha sadık çoğaltmalar için çağdaş A(H3N2) virüsler sağlamak için kanıtlamıştır. Burada, bu çağdaş A(H3N2) virüsleri nötralize antikor titreleri ölçmek için en iyi duruma getirilmiş MN tahlil MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Bu protokol için ısı inaktive sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor için virüs bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 A(H3N2) virüs MDCK SIAT1 hücre bulaştırmak için izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plaka sabittir ve virüs her miktar de anti-grip kullanarak bir enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) sayısal nükleoprotein (NP) monoklonal antikorlar. Antikor titresi nötralize ≥50% virüs infektivite inhibisyonu sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.

Giriş

Grip virüsleri morbidite ve mortalite insan nüfusunun her yıl neden devam. HA büyük yüzey glikoprotein grip virüsleri olduğunu. Nötralize antikorlar HA hedefleme grip enfeksiyonu1,2korunması ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması vardır. Hemaglütinasyon inhibisyon (hı) deneyleri ve MN deneyleri grip enfeksiyonu veya aşı3sonra insan sera içindeki antikor yanıtları ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem vardır. HI tahlil virüs hemaglütinasyon kırmızı kan hücrelerinin antikor inhibisyonu ölçer ve bir vekil tahlil olarak kabul edilir. HI, MN tahlil grip enfeksiyonu hücre kültürlerinde nötralize insan sera antikor düzeyleri doğrudan ölçebilirsiniz. MDCK hücreler kez grip virüsü yalıtım modunda kullanılır ve4MN deneyleri.

Grip virüsleri sürekli antijenik drift ve kaydırma mutasyonlar reseptör bağlama özgüllük virüslerin değiştirebilirsiniz HA proteinler olarak alınıyor, tabi. 2014 beri A(H3N2) virüslerin yeni kümeler ortaya çıktı ve sezon kadar dolaşmaya devam etti. Çoğunluk bu virüslerin genetik grup 3C.2a ve HA proteinlerin Filogenetik analizi dayalı 3C.3a ait. Dolaşımdaki 3C.2a virüsler kırmızı kan hücreleri hemagglutinate yeteneği azaltılmış vardı ve bu nedenle HI deneyleri5tarafından karakterize olamaz. Nötralizasyon deneyleri6hemagglutinate değil bu virüslere antikor yanıtlarını ölçmek için kullanılması gerekir. Ayrıca, çalışmalar bu çağdaş A(H3N2) virüsler önceki A(H3N2) virüsler ile karşılaştırıldığında reseptör bağlama özellikleri değiştirmiş ve adapte Kültür mutasyonlar ve in vitro hücre pasajlı zaman çok biçimlilik birikir eğilimindedir göstermiştir kültürler7,8,9. Geleneksel MDCK hücreleri ile karşılaştırıldığında, MDCK-SIAT1 Matrosovich vd tarafından geliştirilen bir hücre çizgidir MDCK hücreleri cDNA insan α2, 6-sialtransferase (SIAT1) ile istikrarlı transfection. Bu hücre kültürünü artan miktarda α2, 6 sialik galaktoz moieties ve azalmış miktarda α2, ailenin MDCK hücreleri10daha 3 sialik asit moieties ifade eder. MDCK-SIAT1 hücreleri A(H3N2) virüs MDCK hücreleri11' e göre yalıtım oranlarını artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, Lin vd. virüs MDCK SIAT1 hücre hatlarında MDCK hücreleri7ile karşılaştırıldığında kültürlü yaşındayken yeni ortaya 3C.2a ve 3C.3a insan A(H3N2) grip virüsleri için daha sadık virüs çoğaltmalar ve daha iyi virüs infektivite elde edildi bildirdi. Böylece, MDCK-SIAT1 hücreleri daha iyi MN deneyleri antikor yanıt A(H3N2) virüs son kümeleri için karakterize etmek için uygundur.

Burada bir MN tahlil antikor yanıt çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs insan sera içinde ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Yumurta veya hücreler virüs bu tahlil kullanılabilir. İnaktive ısı sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor virüse bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 -MDCK-SIAT1 hücreleri enfekte ve çoğaltmak A(H3N2) virüs izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plakaları sabittir ve her iyi virüs miktarı bir ELISA anti-grip A NP monoklonal antikorları kullanarak tarafından sayılabilir. NP tespiti antikorları nötralize yokluğu ve virüs enfeksiyonu varlığı gösterir. Antikor titresi nötralize ≥ % 50 inhibisyonu virüs infektivite sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.

Protokol

Tüm grip virüsleri uygun biyogüvenlik düzeyi gereksinimlerine göre ele alınmalıdır (BSL-2 veya daha yüksek) təhlillər ve Biyomedikal Laboratuvarı (BMBL)12Biyogüvenlik tanımlandığı gibi.

1. reaktifler ve başlangıç materyali hazırlanması

  1. MDCK-SIAT1 hücreleri ve steril hücre kültür ortamı hazırlamak
    1. MDCK-SIAT1 hücre kültür orta ile yüksek glikoz 500 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) kullanarak hazırlamak, % 10 v/v ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 1 mg/mL G418 sülfat (örn., geneticin) ve 100 U/ml penisilin ile 100 µg/mL streptomisin (isteğe bağlı). Filtrasyon 0.2 µM gözenek boyutu membran aracılığıyla tarafından sterilize. G418 sülfat MDCK-SIAT1 hücrelerdeki plazmid istikrarı sağlamak için eklenir.
    2. MDCK-SIAT1 hücre kültürünü hazırlayın. Bir 162 cm2- 30 mL steril hücre kültür ortamının içeren doku kültürü flask(s) şişeler 2-2.5 x 106 MDCK-SIAT1 hücreleri ile tohum ve % 5 CO2 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya; Bu doku kültürü bulaşıcı doz (TCID) belirlenmesi ve MN için kullanılacaktır deneyleri.
      Not: MDCK-SIAT1 hücreleri nazikçe Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya10tarafından temin edilmiştir. Bu hücre kültürünü de ticari olarak elde edilebilir ( Tablo reçetesigörmek).
  2. 500 mL DMEM yüksek glikoz, % 0.3 sığır serum albumin (BSA) kesir V, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 20 mM HEPES kullanılarak steril virüs yayma ortam hazırlamak. Filtrasyon 0.2 µM gözenek boyutu membran aracılığıyla tarafından sterilize.
  3. 0,01 M PBS pH 7.2 içeren fosfat tamponlu tuz (PBS) %0,75 (v/v) eskiden şiling şimdi domuz kırmızı kan hücreleri (gpRBCs) hazırlayın.
  4. DMEM yüksek glikoz, %1 sığır albümin kesir V (BSA), 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 20 mM HEPES kullanarak steril virüs seyreltici hazırlayın. İle 0.2 µm gözenek boyutu membran filtrasyon tarafından sterilize ve taze her tahlil için hazırlanın.
  5. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2) % 80 soğuk aseton olarak soğuk hücre sabitleştirici hazırlayın.
  6. PBS (0.01 M PBS pH 7.2) kullanarak arabellek yıkayın hazırlayın ve %0,3 (v/v) ara-20.
  7. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2) kullanarak antikor seyreltici hazırlamak, %0,3 (v/v) ara-20 ve % 5 yağsız süt Makinası.
  8. Anti-grip A NP fare Monoklonal antikor klon A1 ve A3 havuzu birincil antikorkullanın. Titrasyon tarafından belirlendiği gibi en iyi konsantrasyon seyreltici antikor oranında seyreltin.
  9. Kullanım keçi Anti-fare IgG at turp peroksidaz (HRP) ikincil antikorBirleşik. Titrasyon tarafından belirlendiği gibi en iyi konsantrasyon seyreltici antikor oranında seyreltin.
  10. O- boya dihydrochloride (OPD) 0,05 M fosfat sitrat tampon pH 5 kullanılarak peroksidaz substrat hazırlayın. 1 kapsül/100 mL deiyonize H2O. erimesi 1 OPD tablet (10 mg) çözülerek 0,05 M fosfat sitrat arabellek hazırlamak / 20 mL fosfat sitrat arabelleği kullanımdan hemen önce.
  11. 0, 5 M sülfürik asit OPD durdurmak çözümolarak kullanın. 972 havaalanı mL deiyonize H2O kimyasal başlıklı 18 M sülfürik asit stokunun 28 mL ekleyin.
  12. İnsan ve hayvan sera tedavisinde
    1. Isı MN deneyleri 56 ° c su banyosunda 30 dk önce tahlil için kullanılan insan sera devre dışı bırakabilirsiniz. Hemen kullanma veya gerekirse, mağaza için en fazla 24 h 4 ° C'de sera çözdürülen; daha uzun depolama süresi gerekiyorsa, sera-20 ° C'de dondurulmuş veya soğuk depolar.
    2. MN deneyleri reseptör yok enzim (RDE) ile kullanılan hayvan sera tedavi ve ısı şöyle tahlil önce devre dışı bırakın.
      1. Sera 37 ˚C su banyosu içinde çözülme sonra buz üzerinde yerleştirin. Hayvan serum örneği 1 hacmi RDE 3 cilt ile karıştırın. 18-20 h 37 ˚C, kuluçkaya.
      2. Isı tedavi RDE sera 56 ˚C PBS, pH 7.2 her örnek için bir final öncesi seyreltme 1:10 30 dk. 6 eklemek miktarlar için devre dışı. Gerekirse, en fazla 24 h için 4 ° C'de çözdürülen sera depolar; daha uzun depolama süresi gerekiyorsa, sera-20 ° C'de dondurulmuş veya soğuk depolar.
        Not: Bind grip virüsleri HAs için ve grip özel anti bağlama inhibe çeşitli sialik asit glukanlardir hayvan sera içerebilir-HA antikorlar. Bu nedenle, RDE için gereklidir bu non-spesifik viral HA bağlayıcı serum örneklerinde kaldırmak için MN deneyleri önce tüm hayvan sera tedavi.

2. MDCK-SIAT1 hücre kültürü geçirilmesi

Not: Tüm hücre kültürleri biyolojik Emanet kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Hücre monolayer 162 cm2 şişeler içinde hücre kültür ortamından dikkatle boşaltmak. Hücreleri monolayer tripsin-EDTA ile durulama tarafından trypsinize. 5 mL tripsin-EDTA hücre monolayer kapsayacak şekilde ekleyin. 37 ° C'de, monolayer (5-10 dk) ayırır kadar % 5 CO2 kuluçkaya. MDCK-SIAT1 hücre kültür ortamının 15 mL trypsinized hücreleri, yukarı ve aşağı ayrı hücreler pipet içeren her şişe ekleyin.
  2. Bir hemasitometre ve trypan hücre sayar belirlemek için mavi ve canlılığı kullanın. Yeni 162 cm2 doku kültürü şişeler ile 2-2. 5 x 106 hücre /flask hücre kültür ortamının 30 mL içeren hücrelerde tohum ve % 5 CO2 37 ° C'de 2 gün kullanılmak üzere TCID ve MN deneyleri için kuluçkaya. Senaryo Özeti 4-5 x 106 hücreler/şişesi tohum ve virüs yayma kullanmak için 2 gün için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: daha kısa veya daha uzun kültür dönemleri istenirse tohum yoğunluğu ayarlanabilir. Virüs yayma için hücreleri üzerinde % 100 ulaşır confluency. Doku kültürü enfeksiyon doz (TCID) ve MN deneyleri için hücreleri 75-%95 confluency (şekil 1) olmalıdır.

3. MDCK-SIAT1 hücrelerdeki A(H3N2) Virüs yayılması

Not: Eski embryonated tavuk standart protokolü3veya MDCK-SIAT1 hücre göre yumurta kültürler içinde ya da 10-11 gün A(H3N2) virüs yayılamaz. MDCK-SIAT1 hücreleri üzerinde % 100 ulaşmak virüs aşılama için confluency. Virüs tohum stokları inoculum birden fazla dilutions ile aşılanmış. İnoculum dilutions en iyi hasat HA ile ve infektivite daha fazla MN deneyleri için kullanılabilir.

  1. Hücre kültür Orta hücre monolayer kaldırmak (> % 100 confluency) 162 cm2 şişeler içinde. 15 mL steril 0.01 M PBS, pH 7.2, ile iki kez monolayer yıkama ve dikkatle boşaltmak.
  2. 1 şişe kontrol olarak etiketleyin ve virüs yayma medya 20 mL ekleyin. Şişesi %5 CO2ile 37 ° C'de kuluçkaya. Bu şişeye el değmemiş bırakın ve karşılaştırma için virüs yayılma 1 gün sonra kullanın.
  3. 10 mL steril virüs yayma medya için flask(s) ekleyin ve tüm flask(s) 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya. Grip virüsü stok oda sıcaklığında bir şişe çözülme sonra buz üzerinde yerleştirin. Hedef dilutions virüs yayma medyaya ile oranında seyreltin.
    Not: dilutions ayarlanabilir hedef virüs stokları HA titreleri üzerinde temel. Bir 1: 1000 hazırlamak için inoculum sulandırılmış, şunun 100 µL 9.9 mL steril virüs yayma medya ekleyin. Yavaşça tersine çevirin, 1 mL 1: 100 seyreltme 9 ml steril virüs yayma medya kaldırmak, seyreltilmiş 1: 1000 inoculum için yavaşça tersine çevirin. Buza koyun.
  4. Denetim şişesi hariç tüm şişeler kuluçka makinesi kaldırın. MDCK-SIAT1 hücre flask(s) virüs yayma medyayı çıkarın ve her şişeye 10 mL sulandırılmış virüs ile aşılamak. Şişeler 37 ° c, % 5 CO2 1 h, flask(s) her 15dk döndürme için kuluçkaya.
  5. İnoculum 5 mL flask(s) Kaldır ve 1 µg/mL TPCK-tripsin içeren 15 mL virüs yayma ortamı ile değiştirin. Flask(s) 37 ° c, % 5 CO2 16-18 h için kuluçkaya.
  6. Gecede kuluçka sonra 100 X için mikroskop büyütme altında flask(s) gözlemlemek ve cytopathic etkileri (CPE) hücreleri arayabilirsiniz. 15-17 mL süpernatant şunun flask(s) kaldırın ve 15-17 mL 2 µg/mL TPCK-tripsin içeren taze hazırlanmış virüs yayma medya ile değiştirin.
  7. 37 ° c, % 5 CO2şişeler kuluçkaya. (Yasland hücre kontrol şişesi) monolayer CPE izlemek ve HA düzenli aralıklarla (her 4 h) % 0.75 gpRBC ile hasat kadar kontrol edin.
    1. Bir HA 96-şey microtiter tabak ayarlayın. 0,01 M PBS, pH 7.2 wells A2 - A12 ve B2 - B12 için 50 µL ekleyin (Yineleme) ve wells H1 - H12 denetimi için.
    2. Logosuna 2 kat seri seyreltme A1 ve B1 A12 ve B12 gerçekleştirmek, A1 ve A2 için virüs süpernatant 100 µL ekleyin. 50 µL A12 ve B12 karıştırdıktan sonra atın. Satır için A, B ve h 50 µL % 0.75 gpRBCs Ekle
    3. Plaka dokunun ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      1. HA virüs süpernatant 60 ° açı 45 ° 96-şey microtiter plaka eğerek belirlemek.
      2. Plakalar hemaglütinasyon için okumak; tam hemaglütinasyon elde virüs en yüksek seyreltme HA titrasyon bitiş noktası için belirli virüs olarak kabul edilir. Kayıt yüksek virüs seyreltme tam hemaglütinasyon ile HA titresi olarak virüs karşılıklı.
        Not: Kapatılan RBCs satırındaki H (denetimleri) "kaçmak" ve yerçekimi nedeniyle küçük bir gözyaşı şekli oluşturmak gerekir. Kuyu bitirmek denetimindeki RBCs kadar bekle çalıştıran, sonra titrasyon wells RBC düğme içinde belgili tanımlık virüs okuyun. Bu sergi RBC düğmeleri ve "Çalıştır", elde değil hemaglütinasyon. Tamamen hemaglütinasyon virüs bitiş noktası HA titresi inhibe virüs en yüksek seyreltme bulun.
  8. Virüs virüs kültür HA yaylalar veya virüs kültürü hedef HA ulaşır hasat (örneğin, > 16 HAU), ama önce hücre monolayer önemli CPE görüntülemek başlar.
    1. Virüs kültür süpernatant vasıl 300 x g 4 ° C'de hücresel enkaz cips için 10 dk santrifüj kapasitesi. Virüs hasat için temiz bir tüp içeren açıklık süpernatant aktarın. Aliquot virüs içeren süpernatant tek kullanımlık steril kriyojenik tüpleri hasat ve hemen-70 ° C'de veya soğuk dondurma.
      Not: MN deneyleri için kullanılan virüs hisse senetleri yüksek bulaşıcı titresi ve en az kusurlu parçacıklar olmalıdır. Virüs hisse senetleri 100 TCID50/50 µL MN tahlil için elde etmek için en az seyreltme 1: 100 var.
      Not: MN deneyleri kullanılan virüs stokları çözdürülen refrozen ve değil.

4. TCID virüs tespiti

  1. 1. gün: Virüs titrasyon
    1. Virüs, oda sıcaklığında bir şişe çözülme ve hemen buza koyun.
    2. Virüs iki farklı başlangıç dilutions adlı sınayın: 10-2 ve 10-3. 100 µL virüs virüs 10-2 seyreltme için seyreltici 9.9 mL ekleyin. 10-2 seyreltme 1 mL 10-3 seyreltme için seyreltici virüs 9.0 mL ekleyin.
    3. İki microtiter kullanarak tabak (plaka 1 10-2 seyreltme için) ve plaka 2 10-3 seyreltme için eklemek 100 µL virüs Dilüent sütun 1 96-şey microtiter plaka dışında bütün wells.
    4. ½log10 dilutions (10-2, 10-2.5, 10-3, vb) gerçekleştirin. Seyreltme bütün wells için sütun 1 başlangıç şunun 146 µL ekleyin ve 46 µL seri olarak sütun 1 sütun 11 (Şekil 2) yoluyla aktarmak. Kuyular arasında değişiklik pipet ipuçları. Sütun 11 karıştırma sonra ipuçları 46 µL seyreltme ile atmak.
    5. Sütun 12 hücre kontrolü (CC) olarak kullanmak; Sadece virüs seyreltici içerir. 1 h 37 ° c, % 5 CO için kuluçkaya2.
  2. 1. gün: MDCK-SIAT1 hücreleri hazırlanması
    Not: 75-%95 confluency TCID ve MN deneyleri için MDCK-SIAT1 hücre monolayer ulaştırılması gerekmektedir. Bir 162 cm2 şişeye % 95'i confluency, tohum için yeterince hücre verim ~ 4-5 microtiter plakaları.
    1. 75-%95 Konfluent monolayer 20 mL FBS kültür medyada kaldırmak için PBS ile yıkayın. Hücreleri aşağıdaki gibi trypsinize.
      1. Steril PBS ile monolayer durulama, 7 mL tripsin-EDTA hücre monolayer kapsayacak şekilde ekleyin. Şişeye yatıyordu düz ve 37 ° C'de, monolayer (yaklaşık 5-10 dk) ayırır kadar % 5 CO2 kuluçkaya. Virüs Dilüent 7 mL trypsinized hücreleri içeren her şişe ekleyin.
    2. FBS kaldırmak için virüs seyreltici hücrelerle yıkayın.
      1. Yavaşça yukarı ve aşağı hücreleri ayırmak için pipet. Hücreleri 50 mL konik tüp transfer; tüp virüs seyreltici ile doldurun.
      2. Santrifüj kapasitesi 485 x g 5 dk. Decant seyreltici virüs için de, taze 50 mL virüs seyreltici ile değiştirin ve santrifüj kapasitesi 485 x g 5 dk. Decant seyreltici virüs de ve taze virüs seyreltici ile değiştirin (10 mL/şişesi) Pelet resuspend için.
    3. Bir hemasitometre ve trypan mavi Hücre sayımı ve Viabilite belirlemek için kullanın. Hücre konsantrasyon Dilüent 1.5 x 105 hücre/mL için virüs ile ayarlayın.
    4. Her şey microtiter plakaların (1.5 x 104 hücreleri/iyi) 100 µL seyreltilmiş MDCK SIAT1 hücre eklemek ve kuruyucu. 37 ° c, % 5 CO2 18-20 h için kuluçkaya.
  3. 2. gün: ELISA
    1. Hücreleri fiksasyonu
      1. Orta microtiter plakalar kaldırın. Her yıkama 200 µL PBS ile iyi. Her şey için 300 µL soğuk % 80 aseton ekleyin ve 10 dk. sabitleştirici kaldırmak ve hava plakalara kuru izin için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. ELISA
      1. Birincil antikor ek
        Not: Anti-grip A NP Monoklonal antikor fazla ELISA birincil antikor olarak kullanılmalıdır. Her sürü birincil antikorlar için en uygun antikor seyreltme MN içinde antikor titrations gerçekleştirerek belirlemek. Aşırı ve arka plan oranı en iyi sinyali ile birincil antikor konsantrasyonu seçin.
        1. Anti-grip A NP Monoklonal antikor (birincil antikor) antikor Dilüent hedef konsantrasyonu seyreltik (örneğin eklemek 30 µL birincil antikor antikor Dilüent 1: 1000 bir hedef seyreltme için 30 mL).
        2. 3 kez ile yıkama arabelleği 300 µL plakalar yıkayın. 100 µL seyreltilmiş birincil antikor her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      2. İkincil antikor ek
        Not: Keçi anti IgG Birleşik at turp için fare peroksidaz (HRP) aşan ELISA ikincil antikor olarak kullanılmalıdır. Her sürü ikincil antikorlar için en uygun antikor seyreltme antikor titrations gerçekleştirerek belirlemek. İkincil antikor konsantrasyonu fazla ve en iyi sinyal arka plan oranı ile seçin.
        1. Hedef konsantrasyonu (örneğin , ikincil antikor antikor bir hedef 1:4000 seyreltme için seyreltici 30 mL için eklemek 7.5 µL) içinde Dilüent antikor IgG HRP antikor (ikincil antikor) Birleşik keçi Anti-fare sulandırmak.
        2. Plakaları 3 kez 300 µL yıkama arabelleği ile yıkayın. 100 µL seyreltilmiş ikincil antikor her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      3. Substrat toplama ve plaka okuma
        1. 5 kere ile 300 µL yıkama tamponu ve hav bırakmayan mendil mekândaki plakalar yıkayın.
        2. Her şey için taze hazırlanmış substrat 100 µL ekleyin ve Oda renk geliştirme karışırlar kadar sıcaklık ve optik yoğunluk (OD) hücre kontrol Wells kuluçkaya < 0,2.
        3. 100 µL durmak eriyik için tüm wells ekleyin. Wells, 490 OD okumak Mikroplaka Spektrofotometre kullanarak nm.
  4. TCID 50 hesaplama
    1. Hücre denetimleri (sütun 12) medyan OD490 hesaplayın.
    2. Herhangi bir test de bir OD490 ile iki kez medyan OD490 CC Wells "olumlu"; olarak daha büyük düşünün Aksi takdirde, "olumsuz" kabul edilir.
    3. Reed-Muench yöntemi13kullanarak virüs TCID50 hesaplayın.
      1. Pozitifler ve negatifler, her seyreltme sayısını belirleyin.
      2. "Toplu pozitif", "Toplu negatif", "Oran" ve Tablo 1' de gösterildiği % pozitif"olarak hesaplayın.
      3. "Orantılı uzaklığı" arasında seyreltme gösteren hesaplamak > % 50 pozitif ve seyreltme gösteren < % 50 pozitif birini kullanarak:
        figure-protocol-16516
        Not: 0,5 ½ günlük seyreltme için düzeltme faktörü olarak. Örneğin, Tablo 1' deki: (80 − 50) /(80 − 20) 0,5 = 0,25 x
      4. Virüs TCID%50 > 50 olumlu gösterilen seyreltme orantılı uzaklığı ekleyerek hesaplar.
        Not: Örneğin, Tablo 2' de, TCID50 10-5+(-0.25) olur 10-5.25=. Bu TCID50 / 100 µL (ya da 10-5.25/100 µL) virüs unutmayın.
    4. Virüs seyreltme hesaplayın. MN deneyleri için 200 TCID50/100 µL (100 TCID50/50 µL iyi başına eşdeğeridir) virüs sulandırmak.
      Not: Tablo 1' deki örnekte 1 TCID50 10-5.25 100 µL ise 200 TCID50/100 µL ulaşmak için seyreltme hesaplamalara dayalı 1:891: 200 x 10-5.25 10-2.95 = 1/102,95 = 1 = / 891

5. MN tahlil MDCK-SIAT1 hücreler kullanma

  1. 1. gün: Test ve kontrol sera hazırlık ve plaka yerleşimi
    1. Sera 37 ° C su banyosu içinde çözülme ve hemen çözdürme sonra kaldırın. Aliquot test edilmesi gereken sera miktarı; en az 10 µL özgün sera singlet içinde bir virüs ile test etmek için gereklidir. Sera çoğaltmaları mümkünse sınayın.
    2. Isı 30 dk içinde olduğu gibi adım 1.12.1 56 ° C su banyosu için insan sera devre dışı bırakabilirsiniz. Yer sera buz üzerinde ısı inactivation sonrası, virüs Dilüent 1:10 ulaşmak için sera ekle öncesi seyreltme.
    3. RDE tedavi ve hayvan sera 1.12.2 başına denetimler için kullanmak için 1:10 önceden oranında seyreltin.
      Not: Çözülmüş ve tedavi insan ve hayvan sera 4 ° C'de artık 24 h-20 ° C'de dondurulmuş Sera depolanması gereken veya daha uzun, soğuk depolama süresi önce tahlil gereklidir için saklanır.
    4. Bir virüs test eklemek 100 µL 1:10 seyreltilmiş sütunlara A1 A10 için sera (şekil 4). Virüs Dilüent 50 µL sütunları 11 ve 12 (şekil 4) dışında H, B satır ekleyin. Logosuna 2 kat seri seyreltme satır A ile H gerçekleştirmek ve son 50 µL þeklinde okunur H (şekil 4) atın.
      Not: birden fazla virüs test edilecek olduğunda, sera titresi tüplerde seyreltilmiş. Serum, seyreltme için iyi a serum titresi belirlenmesi amacı 1:10, 1:20 B iyi, C 1:40, de D 1:80 E 1:160 de iyi, F 1:320, iyi G 1:640, de H 1:1,280 (şekil 4) iyi.
    5. Virüs denetimi için virüs seyreltici 50 µL wells A12, B12, C12 ve D12 ekleyin (sera). Hücre denetimi için virüs seyreltici 100 µL wells E12, F12, G12 ve H12 ekleyin (Hayır virüs, hayır sera).
    6. Denetim sera için (örneğin, gelincik sera denetimleri) 100 µL seyreltilmiş denetim sera bir sütun 11 iyi ve virüs Dilüent 50 µL wells B11 - H11 eklemek için ekleyin. Seri seyreltik aşağı.
    7. Kuruyucu, 37 ° c, % 5 CO2 virüs eklenmesi için hazır kadar kuluçkaya.
  2. 1. gün: Virüs ek
    1. 100 TCID50/50 µL virüs virüs Dilüent sulandırmak.
    2. 50 µL seyreltilmiş virüs sütun 11 geri titrasyon (BT) plakalar ve tüm plakaları (şekil 4) hücre kontrol wells E12, F12, G12 ve H12 haricinde bütün wells ekleyin. Denetim sera sütunda 11 ile tabakaları, virüs 11 sütununu ekleyin.
    3. Geri titrasyon (BT)
      1. Bir BT (örneğin, plaka 1A ve 1B) yinelenen plakaların bir kümenin 11 sütununda yer. Virüs Dilüent 50 µL 11 sütunundaki tüm wells ekleyin. Virüsün 50 µL 100 TCID50/50 µL ilk kuyu (A11) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
      2. Mix ve 50 µL logosuna 2 kat seri dilutions gerçekleştirmek için art arda gelen wells aktarmak. Pipet ipuçları virüs etkilenmişimdir önlemek için kuyu arasında değiştirin. İyi H11 üzerinden 50 µL atmak.
      3. Virüs Dilüent sütuna son hacim 100 µL. için getirmek için 11 50 µL dokunun karıştırın tabakları ekleyin.
    4. Tabak 37 ° c, % 5 CO2 1 h için kuluçkaya.
    5. Günde 1 MDCK-SIAT1 hücre toplama ve günde adımları 4.2 ve 4.3 (5.3 ve 5,4'da açıklanan) açıklandığı gibi 2 ELISA gerçekleştirmek
  3. 1. gün: MDCK-SIAT1 hücre ekleme
    1. 4.2. adımda açıklandığı gibi MDCK-SIAT1 hücreleri hazırlayın. Her şey (1.5 x 104 hücreleri/iyi) için 1.5 x 105 hücre/mL, 100 µL MDCK-SIAT1 hücreleri ekleyin. Plakayı 37 ° c, % 5 CO2 18-20 h için kuluçkaya.
  4. 2. gün: ELISA
    1. Sonra ikinci gün, gece kuluçka 4.3 adımda anlatıldığı gibi % 80 soğuk aseton ile hücreleri tamir.
    2. Birincil antikor ek
      1. Plakaları 3 kez 300 µL yıkama arabelleği ile yıkayın. Anti-grip A NP Monoklonal antikor (birincil antikor) antikor seyreltici titrasyon tarafından belirlenen en yüksek konsantrasyonu seyreltik (örneğin eklemek 30 µL birincil antikor antikor Dilüent 1: 1000 bir hedef seyreltme için 30 mL).
        Not: birincil antikor 100 µL iyi gereklidir. ~ 10 mL plaka gereklidir.
      2. 100 µL seyreltilmiş birincil antikor her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. İkincil antikor ek
      1. Plakaları 3 kez 300 µL yıkama arabelleği ile yıkayın. Keçi seyreltik anti IgG Birleşik HRP antikor (ikincil antikor) antikor seyreltici (örneğin eklemek 7.5 µL, ikincil antikor antikor için bir hedef 1:4000 seyreltici 30 mL.) hedef konsantrasyonu için fare
        Not: ikincil antikor 100 µL de 96 gereklidir. ~ 10 mL plaka gereklidir.
      2. 100 µL seyreltilmiş ikincil antikor her şey için ekleyin. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. Substrat toplama ve plaka okuma
      1. 5 kere ile 300 µL yıkama tamponu ve hav bırakmayan silme mekândaki plakalar yıkayın.
      2. Her şey için taze hazırlanmış substrat 100 µL ekleyin ve virüs denetimi wells bir OD490 ulaşana dek oda sıcaklığında kuluçkaya 0,8 - = 3, bir düşük hücre denetimiyle arka plan OD490 < 0,2.
      3. 100 µL durmak eriyik için tüm wells ekleyin. Wells, 490 OD okumak Mikroplaka Spektrofotometre kullanarak nm.
  5. Veri analizi
    Not: MN hesaplamalar her plaka için ayrı ayrı belirlenir.
    1. Her serum örneği nötralize antikor titresi belirlemek.
      1. Aşağıdaki denklemi kullanarak her tabağı % 50 virüs nötralizasyon OD490 cut-off Hesapla:
        figure-protocol-23161
        Not: Burada x = nötralizasyon kesme % 50. OD490 ile en yüksek seyreltme karşılık gelen karşılıklı serum seyreltme kesme (≥50% inhibisyon) % 50'den az nötralizasyon antikor titresi Bu serum örneği (şekil 5) için kabul edilir.
    2. Hücre kontrol wells bir OD490 olup olmadığını kontrol edin < 0.2 ve virüs denetimi kuyu var bir OD490 0,8 - = 3.
    3. 50, 100 veya 200 TCID virüs infektivite tarafından virüs BT BT kabul edilebilir aralığın her tahlil (100 x TCID50) olduğunu doğrulayın. 4.4.2. adımda tanımlanan aynı kesme kullanarak kesme yukarıdaki OD ile BT sütunda en yüksek virüs seyreltme wells E11, F11, G11 olmalıdır.
      Not: Serum olumlu denetimleri titreleri içinde 2'ye katlanmış vermelidir önceki testlerde elde edilen değerler. Negatif serum denetiminin OD490 virüs kontrolü için gözlemlenen benzer olmalıdır.

Sonuçlar

Virüs stoklarının infektivite belirlenmesi MN tahlil ilk adımıdır. Şekil 2 virüs stoklarının TCID50 belirlemek için plaka düzeni gösterilmektedir. Bilinmeyen infektivite ile virüs hisse senetleri için virüs birden çok ön dilutions, örneğin hem 10-2 ve 10-3, virüsün infektivite hesaplamak için en iyi titrasyon eğrisi yakalamak için titre. MN assay olarak kullanılan virüs tutarı 100 TCID50/...

Tartışmalar

MN tahlil için grip seroloji grip enfeksiyonu veya aşı aşağıdaki antikor yanıt algılamak için kullanılan ana deneyleri biridir. MN deneyleri oluşturulan titreleri genellikle birçok grip seroepidemiology çalışma sonucunu birincil kullanılır. MN deneyleri sero-tanı ve aşı immünojenisite değerlendirilmesi için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Uluslararası arası laboratuvar çalışmalar birden fazla laboratuvarları14' te gerçekleştirilen MN deneyleri karşılaştırma...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor. Bulgular ve sonuçlar bu yayındaki yazarlar ve dün Gösterim merkezleri hastalık kontrol ve Önleme ve finansman ajansı için yapıldı.

Teşekkürler

Bu yazının hazırlanmasında Dr. Xiuhua Lu, Dr Feng Liu ve Bayan Ashley Burroughs grip bölümü CDC onların eleştiri ve yardım için teşekkür ederiz. Biz Dr Adrian Reber grip bölümü CDC şekil 3grafik hazırlama konusunda onun yardım için teşekkür ederim. Son olarak, Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya MDCK-SIAT1 hücreleri sağlamak için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high GlucoseLife Science11965A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase FreeSigma-Aldrich3117332001
L-GlutamineLife Science25030-081
Sodium pyruvateLife Science11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt Sigma-AldrichA1720-5G  
HEPESLife Science15630-080
Penicillin/StreptomycinLife Science15140-122
AcetoneVWR67-64-1Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate Sigma-AldrichSLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tabletSigma-AldrichSLBQ1086V1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric AcidFisher ScientificA510-P500Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4LVWREM-AX0422-3Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTALife Science1748048
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
Tween 20Sigma-AldrichP1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal AbMillipore poolMAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP KPL074-1802
96-well flat-bottom platesThermo Scientific3455
Plate readerMolecular DeviceSpectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent CapCorning/VWR3151

Referanslar

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
  5. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  6. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  7. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  8. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
  9. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  10. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  11. US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  12. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  13. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  14. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  15. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Bula c hastal klarsay 129A H3N2 grip vir sleriMDCK SIAT1microneutralizationTCIDn tralize antikorba kl k

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır