Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Resumo

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Resumo

Anticorpos neutralizantes contra a hemaglutinina (HA) de vírus da gripe são considerados o principal mecanismo imune que se correlaciona com proteção para infecções de gripe. Ensaios de Microneutralization (MN) são frequentemente usados para medir respostas de anticorpos neutralizantes em soros humanos após vacinação gripe ou infecção. Madine Darby Canine renal (MDCK) as células são o substrato de célula comumente utilizada para ensaios de MN. No entanto, atualmente circulam 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe adquiriram o vírus alterado especificidade de ligação do receptor. A linhagem de células MDCK-SIAT1 com metades de aumento α-2,6 siálico galactose na superfície provou para fornecer melhorada infecciosidade e replicações mais fiel do que células MDCK convencionais para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Aqui, descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 que foi otimizado para quantificar os anticorpos neutralizantes para estes vírus A(H3N2) contemporâneas. Neste protocolo, soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para vincular aos vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO₂ para permitir que A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada bem é quantificada por um ensaio imunoenzimático (ELISA) usando antigripe uma cadeia (NP) os anticorpos monoclonais. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece ≥ 50% de inibição de infecciosidade do vírus.

Introdução

Vírus da gripe continuam a causar morbidade e mortalidade na população humana, a cada ano. HA é a glicoproteína de superfície principal de vírus da gripe. Anticorpos neutralizantes direcionamento HA são o principal mecanismo imune que se correlaciona com a proteção da gripe infecção^1,2. Ensaios de inibição (HI) de hemaglutinação e ensaios de MN são dois métodos amplamente utilizados para medir respostas de anticorpos no soro humano após gripe infecção ou vacinação³. O ensaio de HI mede anticorpo da inibição da hemaglutinação vírus das células vermelhas do sangue e é considerado um ensaio de substituto. Ao contrário de HI, o ensaio de MN diretamente pode medir os níveis de anticorpos no soro humano que neutraliza a infecção da gripe em culturas de células. Células MDCK são frequentemente usadas no isolamento do vírus da gripe e MN ensaios⁴.

Vírus da gripe sofrem constantemente deriva antigênica e shift, adquirindo mutações em proteínas HA que podem alterar a especificidade de ligação do receptor do vírus. Desde 2014, novos grupos de A(H3N2) vírus emergiram e continuaram a circular até a temporada atual. A maioria destes vírus pertence ao grupo genético 3C.2a e 3C.3a com base na análise filogenética das proteínas HA. Muitos dos vírus circulantes 3C.2a tinham reduzido a capacidade de hemagglutinate células vermelhas do sangue e, portanto, não podem ser caracterizados por HI ensaios⁵. Ensaios de neutralização devem ser usados para medir as respostas de anticorpos para esses vírus que não hemagglutinate⁶. Além disso, estudos têm mostrado que estes vírus A(H3N2) contemporâneas alteraram as propriedades de ligação de receptores em comparação com anteriores A(H3N2) vírus e tendem a se acumular mutações cultura adaptada e polimorfismo quando passadas na cela em vitro culturas de^8,7,9. Em comparação com células MDCK convencionais, MDCK-SIAT1 é uma linha de celular desenvolvida por Matrosovich et al . através do transfection estável de células MDCK com cDNA de α2 humano, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta linha de célula expressa uma quantidade aumentada de α2, metades 6-siálico galactose e diminuição da quantidade de α2, partes de ácido siálico-3 do que o pai de células MDCK¹⁰. Células MDCK-SIAT1 mostraram-se para melhorar as taxas de isolamento de vírus A(H3N2) em relação ao de células MDCK¹¹. Recentemente, Lin et al. relatou-se que para o novo 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) gripe vírus humanos, replicações de vírus mais fiel e melhor infecciosidade do vírus foram alcançados quando vírus eram cultivadas em linhas de células MDCK-SIAT1 comparadas com o de células MDCK⁷. Assim, as células MDCK-SIAT1 são mais adequadas em ensaios de MN para caracterizar respostas de anticorpos para os clusters recentes do vírus A(H3N2).

Aqui descrevemos um ensaio de MN usando células MDCK-SIAT1 para medir respostas de anticorpos para 3C.2a contemporânea e vírus A(H3N2) 3C.3a em soros humanos. Vírus cultivados em células ou ovos podem ser usados neste ensaio. Soros de calor inativada contendo anticorpos neutralizantes primeiro serialmente diluem-se, em seguida incubadas com 100 TCID50/bem de vírus de gripe A(H3N2) para permitir que os anticorpos no sera para ligar ao vírus. Células MDCK-SIAT1 então são adicionadas à mistura de vírus-anticorpo e incubadas por 18-20 h a 37 ° C, 5% de CO₂ para permitir que o A(H3N2) vírus infectar células MDCK-SIAT1 e replicar. Após a incubação durante a noite, as placas são fixos e a quantidade de vírus em cada poço é quantificada por um ELISA usando os anticorpos monoclonais antigripe A NP. A detecção de NP indica a presença de infecção pelo vírus e a ausência de anticorpos neutralizantes. Neutralizar o título de anticorpos é definida como a recíproca da maior diluição do soro que fornece a inibição de 50% ≥ de infecciosidade do vírus.

Protocolo

Todos os vírus da gripe devem ser tratados de acordo com requisitos de nível de biossegurança adequado (BSL-2 ou superior) como definido na Biossegurança na microbiológicas e Biomedical Laboratories (BMBL)¹².

1. preparação dos reagentes e matérias-primas

1. Preparar células MDCK-SIAT1 e meio de cultura celular estéril
   1. Preparar o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) de 500 mL com glicose alta, inactivados por calor de v/v de 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, sulfato 1mg/mL G418 (por exemplo, Geneticin) e 100 U/ml penicilina com 100 estreptomicina µ g/mL (opcional). Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 µM. G418 sulfato é adicionado para assegurar a estabilidade do plasmídeo nas células MDCK-SIAT1.
   2. Prepare a linhagem de células MDCK-SIAT1 . 162 cm²- flask(s) de cultura de tecidos contendo 30 mL de meios de cultura de células estéreis, frascos com 2 a 2,5 x 10⁶ MDCK-SIAT1 células da semente e incubar a 37 ° C em 5% de CO₂ por 2 dias; Este será utilizado para a determinação de dose infecciosa (TCID) cultura de tecidos e MN ensaios.
      Nota: Células MDCK-SIAT1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha¹⁰. Esta linha de celular também pode ser obtida comercialmente (consulte a Tabela de materiais).
2. Prepare os meios de propagação de vírus estéril usando 500 mL de glicose alta DMEM, fração de albumina de soro bovino (BSA) de 0,3% V, 100 penicilina U/mL Estreptomicina 100 µ g/mL e 20 mM HEPES. Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 µM.
3. Prepare a 0,75% (v/v) cobaia células vermelhas do sangue (gpRBCs) em solução salina tamponada fosfato (PBS) contendo PBS de 0,01 M, pH 7,2.
4. Prepare o diluente estéril vírus usando DMEM glicose alta, 1% V de fração de Albumina bovina (BSA), 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 µ g/mL e 20 mM HEPES. Esterilizar por filtração com uma membrana de tamanho de poro 0,2 µm e prepare-se fresco para cada ensaio.
5. Prepare o fixador de cela fria como acetona gelada 80% em PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2).
6. Preparar o tampão de lavagem usando PBS (pH 7,2 de 0,01 M PBS) e 0,3% (v/v) tween-20.
7. Preparar o diluente de anticorpo usando PBS (PBS de 0,01 M, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 e 5% magro seco leite.
8. Use antigripe A NP clone de anticorpo monoclonal de rato A1 e A3 piscina como o anticorpo primário. Diluído em diluente na concentração ideal, conforme determinado por titulação do anticorpo.
9. Cabra de uso do anti-mouse IgG conjugado com peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) como o anticorpo secundário. Diluído em diluente na concentração ideal, conforme determinado por titulação do anticorpo.
10. Prepare o substrato de peroxidase usando o- fenilenodiamina dicloridrato (OPD) em tampão de citrato fosfato 0,05 M pH 5. Preparar o tampão de citrato fosfato 0,05 M dissolvendo-se 1 cápsula/100 mL água deionizada H₂O. dissolver OPD 1 comprimido (10 mg) / 20 mL de tampão de citrato fosfato imediatamente antes do uso.
11. Usar 0,5 M de ácido sulfúrico como o OPD parar de solução. Adicione 28 mL de estoque de ácido sulfúrico de 18 M 972 mL água deionizada H₂O numa vizinhança de química.
12. Tratamento de soros humanos e animais
    1. Calor inactivate o soros humanos utilizados em ensaios os MN em um banho de água a 56 ° C durante 30 min antes do ensaio. Use imediatamente ou se necessário, armazenar sera descongelado a 4 ° C, para não mais de 24 h; Se houver necessidade de longo período de armazenamento, armazene soros congelados a-20 ° C ou mais frios.
    2. Tratar os soros de animais utilizados em ensaios de MN com Receptor destruindo enzima (RDE) e calor inativar antes do ensaio da seguinte forma.
       1. Descongelar o sera em um banho-maria 37 ˚ c, em seguida, coloque no gelo. Misturar 1 volume de amostra de soro animal com 3 volumes de RDE. Incube a 37 ˚ c por 18-20 h.
       2. Calor inactivate o sera RDE Tratado em 56 ˚ c por 30 min. Adicione 6 volumes de PBS, pH 7.2 para cada amostra para uma pre-diluição final de 01:10. Se necessário, armazenar sera descongelado a 4 ° C, para não mais de 24 h; Se houver necessidade de longo período de armazenamento, armazene soros congelados a-20 ° C ou mais frios.
          Nota: Soros de animais podem conter vários os glicanos de ácido siálico que podem ligar para o tem de vírus da gripe e inibe a ligação de gripe específicos anti-HA anticorpos. Portanto, é necessário para RDE tratar todos os soros animais antes dos ensaios de MN para remover estas pastas HA virais específico nas amostras de soro.

2. a passagem da cultura de células MDCK-SIAT1

Nota: Todas as culturas de célula devem ser executadas em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação.

1. Decante o meio de cultura celular da monocamada de células em frascos de² 162 cm. Trypsinize as células enxaguando a monocamada com tripsina-EDTA. Adicione 5 mL do trypsin-EDTA para cobrir a monocamada de células. Incube a 37 ° C, 5% CO₂ até a monocamada desanexa (5-10 min). Adicione 15 mL de meio de cultura de células MDCK-SIAT1 a cada balão contendo células trypsinized, pipeta para cima e para baixo celas separadas.
2. Use um hemocytometer e trypan azul para determinar que a célula conta e viabilidade. As células em novos frascos de cultura de tecidos de² 162 cm contendo 30 mL de meio de cultura celular com 2 a 2,5 x 10⁶ células /flask de sementes e incubar a 37 ° C com 5% de CO₂ por 2 dias para uso em ensaios TCID e MN. Células em 4-5 x 10⁶ células/balão de sementes e incubar a 37 ° C com 5% de CO₂ por 2 dias para uso na propagação de vírus.
   Nota: A densidade de semeadura pode ser ajustada se períodos mais curtos ou mais longos de cultura são desejados. Para a propagação de vírus, células devem chegar a mais 100% confluência. Para os ensaios de cultura de tecidos infecção Dose (TCID) e MN, as células devem ser na confluência de 75-95% (Figura 1).

3. a propagação de vírus A(H3N2) nas células MDCK-SIAT1

Nota: A(H3N2) vírus podem ser propagado de qualquer dia de 10-11 em ovos de galinha embrionados velha de acordo com o protocolo padrão³, ou de células MDCK-SIAT1 culturas. Células MDCK-SIAT1 devem alcançar mais de 100% confluencia para inoculação do vírus. Reservas de sementes de vírus podem ser inoculadas com várias diluições do inóculo. As diluições do inóculo com a melhor colheita HA e infectividade podem ser usados para mais ensaios de MN.

1. Remover o meio de cultura celular de monocamada a célula (> 100% confluência) em frascos de² 162 cm. Lave a monocamada duas vezes com 15 mL de PBS estéril de 0,01 M, pH 7,2 e decantar.
2. 1 frasco como controle de rótulo e adicionar 20 mL de meios de propagação do vírus. Incube o frasco a 37 ° C com 5% de CO₂. Deixe este frasco intocado e usar para comparação após dia 1 de propagação do vírus.
3. Adicionar 10 mL de meios de propagação de vírus estéril para o flask(s) e incubar todas flask(s) a 37 ° C, 5% de CO₂. Descongelar um frasco de estoque de vírus da gripe em temperatura ambiente, em seguida, coloque no gelo. Dilua com os meios de propagação de vírus para as diluições de alvo.
   Nota: Alvo diluições podem ser ajustadas baseado no HA uma concentração de reservas de vírus. Para preparar um 1: 1000 diluído inóculo, adicionar 100 µ l de vírus a 9,9 mL de meios de propagação de vírus estéril. Inverter suavemente, retire 1 mL da diluição de 1: 100 para 9 mL de meios de propagação de vírus estéril, inverter suavemente para um inóculo de 1: 1000 diluído. Coloque no gelo.
4. Remova todos os frascos exceto balão de controle da incubadora. Remover os meios de propagação do vírus da flask(s) de células MDCK-SIAT1 e inocular cada frasco com 10 mL de vírus diluído. Incube os frascos a 37 ° C, 5% de CO₂ para 1 h, girando o flask(s) a cada 15 min.
5. Retire o flask(s) de 5 mL de inóculo e substitua por meios de propagação de vírus 15 mL contendo 1 µ g/mL TPCK-tripsina. Incube a flask(s) a 37 ° C, 5% de CO₂ para 16-18 h.
6. Após a incubação durante a noite, observar o flask(s) sob 100 X ampliação do microscópio e procurar efeitos citopático (CPE) nas células. Remova o flask(s) 15-17 mL do sobrenadante de vírus e substitua por 15-17 mL de meios de propagação de vírus recentemente preparada com 2 µ g/mL TPCK-tripsina.
7. Incube os frascos a 37 ° C, 5% de CO₂. Monitorar o CPE da monocamada (em comparação com o balão de controle da célula) e verificar o HA periodicamente (a cada 4 h) com gpRBC de 0,75% da colheita.
   1. Configure uma placa de microtitulação 96 HA. Adicionar 50 µ l de PBS 0,01 M, pH 7,2 a poços A2 - A12 e B2 - B12 (duplicatas) e poços H1 - H12 para controle.
   2. Adicionar 100 µ l do sobrenadante de vírus para A1 e A2, realizar uma diluição serial 2 vezes de A1 e B1 a A12 e B12. Descarte de 50 µ l após a mistura em A12 e B12. Adicionar 50 µ l de gpRBCs de 0,75% para as linhas A, B e H.
   3. Toque a placa e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
      1. Determine HA de vírus sobrenadante pela inclinação da placa de 96 poços da microplaca um 45 ° de ângulo de 60°.
      2. Ler as placas para hemaglutinação; a maior diluição do vírus que atinge a completa hemaglutinação é considerada o ponto final de titulação HA para o vírus específico. Recorde a recíproca da maior vírus diluição com hemaglutinação completa como o HA sendo o título do vírus.
         Nota: As hemácias se estabeleceram na linha H (controles) devem começar a "correr" e uma forma de pequena lágrima devido à gravidade. Esperar até hemácias em controle de poços terminar executando, em seguida, ler os botões de RBC no vírus poços de titulação. Aqueles que apresentam botões RBC e "correr", não alcançar a hemaglutinação. Localize a maior diluição do vírus que inibem completamente hemaglutinação como o ponto final HA sendo o título do vírus.
8. Recolher o vírus quando o HA de cultura de vírus platôs ou a cultura de vírus atinge o alvo HA (por exemplo, > 16 HAU), mas antes da célula monocamada começa a exibir CPE significativa.
   1. Centrifugar a cultura de vírus sobrenadante a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C e os restos celulares de Pelotas. Transferi o sobrenadante clarificado contendo a colheita de vírus para um tubo limpo. Alíquota do sobrenadante contendo o vírus colheita dentro dos frascos criogênicos estéril de uso único e congelar imediatamente a-70 ° C ou mais frio.
      Nota: As reservas de vírus usadas para os ensaios de MN devem ter alta concentração infecciosa e mínimas partículas defeituosas. A diluição mínima de reservas de vírus para atingir 100 µ l de TCID₅₀50 para ensaio de MN é de 1: 100.
      Nota: As reservas de vírus usadas em ensaios os MN não devem ser descongeladas e recongeladas.

4. determinação de TCID do vírus

1. Dia 1: Titulação do vírus
   1. Descongelar um frasco de vírus à temperatura ambiente e coloque imediatamente no gelo.
   2. Testar o vírus em duas diferentes diluições de partida: 10^-2 e 10^-3. Adicione 100 µ l de vírus a 9,9 mL de diluente para 10^-2 de diluição de vírus. Adicione 1 mL de 10^-2 diluição a 9,0 mL de diluente para a 10^-3 de diluição de vírus.
   3. Usando dois microtiter placas (1 para 10^-2 diluição) e chapa 2 para a 10^-3 diluição, adicionar 100 µ l de diluente de vírus para todos os poços exceto coluna 1 da placa de 96 poços da microplaca.
   4. Realize diluições de₁₀ ½log (10^-2, 10^-2.5, 10^-3, etc.). Adicionar 146 µ l do vírus começando a diluição de todos os poços na coluna 1 e transferir 46 µ l em série da coluna 1 pela coluna 11 (Figura 2). Pontas de pipetas de mudança entre poços. Após a mistura coluna 11, elimine as pontas com a diluição de 46 µ l.
   5. Use a coluna 12 como a célula controle (CC); Ela contém apenas o diluente de vírus. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO_2.
2. Dia 1: Preparação de células MDCK-SIAT1
   Nota: A monocamada de células MDCK-SIAT1 deve alcançar confluência de 75-95% para ensaios TCID e MN. Um frasco de 162 cm² a confluência de 95% deve produzir células suficientes para semente ~ 4-5 placas de microtitulação.
   1. Lave a monocamada confluente de 75-95% com 20 mL de PBS para remover o FBS nos meios de cultura. As células Trypsinize da seguinte forma.
      1. Enxágue a monocamada com PBS estéril, adicionar 7 mL do trypsin-EDTA para cobrir a monocamada de células. Colocar o balão liso e incubar a 37 ° C, 5% CO₂ até a monocamada desanexa (aproximadamente 5-10 min). Adicione 7 mL de diluente de vírus a cada balão que contém as células trypsinized.
   2. Lave as células com diluente de vírus para remover o FBS.
      1. Delicadamente Pipete para cima e para baixo para separar as células. Transferir as células para um tubo cónico de 50 mL; Encha o tubo com diluente de vírus.
      2. Centrifugar a 485 x g durante 5 min. decantar o diluente de vírus, substitua com diluente de vírus fresco 50 mL e centrifugar a 485 x g, durante 5 min. decantar o diluente de vírus e diluente de vírus fresco (10 mL/frasco) para Ressuspender o precipitado.
   3. Use um hemocytometer e trypan azul para determinar a contagem de células e a viabilidade. Ajuste a concentração de células com o vírus diluente para 1,5 x 10⁵ células/mL.
   4. Adicione 100 µ l de diluídos células MDCK-SIAT1 a cada poço das placas de microtitulação (1,5 x 10⁴ células/poço) e cobrir as placas. Incube a 37 ° C, 5% de CO₂ para 18-20 h.
3. Dia 2: ELISA
   1. Fixação de células
      1. Remova o meio das placas de microtitulação. Cada um Lave bem com 200 µ l de PBS. Adicionar 300 µ l frio 80% de acetona em cada poço e incubar a temperatura ambiente por 10 min. Retire o fixador e permitir que as placas para o ar seco.
   2. ELISA
      1. Adição de anticorpo primário
         Nota: Anticorpo monoclonal de anti-influenza A NP deve ser usado em excesso como o anticorpo primário em ELISA. Determine a diluição de anticorpo para cada lote de anticorpos primários, realizando as titulações de anticorpos em MN. Selecione a concentração do anticorpo primário que é em excesso e com o melhor sinal à relação de fundo.
         1. Diluir o anticorpo monoclonal antigripe A NP (anticorpo primário) para a concentração alvo em diluente o anticorpo (por exemplo, Adicionar 30 µ l de anticorpo primário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1: 1000 de alvo do anticorpo).
         2. Lave a placa 3 vezes com 300 µ l de tampão de lavagem. Adicione o anticorpo primário diluídos de 100 µ l a cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
      2. Adição de anticorpo secundário
         Nota: Cabra anti-mouse IgG conjugada com rabanete de cavalo peroxidase (HRP) deve ser usado em excesso como o anticorpo secundário em ELISA. Determine a diluição de anticorpo para cada lote de anticorpos secundários realizando titulações de anticorpos. Selecione a concentração do anticorpo secundário em excesso e com o melhor sinal à relação de fundo.
         1. Dilua o anti-mouse de cabra IgG conjugada com anticorpo HRP (anticorpo secundário) para a concentração alvo em diluente o anticorpo (por exemplo, adicionar 7,5 µ l de anticorpo secundário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1:4000 alvo de anticorpo).
         2. Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Adicione o anticorpo secundário diluído de 100 µ l de cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
      3. Adição do substrato e leitura de placa
         1. Lave as placas 5 vezes com 300 µ l lavagem buffer e torneira em uma limpeza de fiapos.
         2. Adicione 100 µ l de substrato recentemente preparado a cada poço e incubar a temperatura ambiente até o desenvolvimento de cor satura e a densidade óptica (OD) de poços de controle do celular < 0.2.
         3. Adicione 100 µ l de solução de paragem para todos os poços. Leia o D.O. de poços a 490 nm, utilizando um Espectrofotômetro de microplacas.
4. Cálculo de TCID ₅₀
   1. Calcule a mediana de OD₄₉₀ dos controles de célula (coluna 12).
   2. Considerar qualquer teste bem com um OD₄₉₀ superior a duas vezes a mediana OD₄₉₀ dos poços CC como "positivo"; caso contrário, considera-se "negativo".
   3. Calcule a TCID₅₀ do vírus usando o método de Reed-Muench¹³.
      1. Determine o número de pontos positivos e negativos para cada diluição.
      2. Calcule o "positivo cumulativo", "Cumulativa negativa", "Relação" e "% positiva" como ilustrado na tabela 1.
      3. Calcular a distância"proporcional" entre a exibição de diluição > 50% positivos e apresentando a diluição < 50% positivos usando o seguinte:
         
         Nota: O fator de correção para a diluição de log ½ é 0,5. Por exemplo, na tabela 1: (80 − 50) /(80 − 20) x 0,5 = 0,25
      4. Calcule o vírus TCID₅₀ adicionando a distância proporcional a diluição mostrando > 50% positivo.
         Nota: por exemplo, na tabela 2, TCID₅₀ é 10^-5+(-0.25) = 10^-5.25. Nota que este é o TCID₅₀ do vírus por 100 µ l (ou 10 µ l de^-5.25100).
   4. Calcule a diluição de vírus. Para os ensaios de MN, dilua o vírus para 200 TCID₅₀100 µ l (equivalente a 100 µ l de TCID₅₀50 por alvéolo).
      Nota: No exemplo da tabela 1, 1 TCID₅₀ 10^-5.25 em 100 µ l, e a diluição para atingir 200 TCID₅₀100 µ l é 1:891 com base nos cálculos: 200 x 10^-5.25 = 10^-2.95 = 1/10^2.95 = 1 / 891

5. MN ensaio usando células MDCK-SIAT1

1. Dia 1: Teste e controle de soros preparação e placa layout
   1. Descongelar o sera em banho-maria a 37 ° C e remover imediatamente após o descongelamento. Alíquota a quantidade de soro que precisam ser testados; um mínimo de 10 µ l do soro original é necessária para testar com um vírus no singlet. Teste soros em duplicatas, se possível.
   2. Calor inactivar os soros humanos por 30 min em um banho de água de 56 ° C como na etapa 1.12.1. Soros de lugar no gelo postar inactivação de calor, adicione o diluente de vírus para soros a alcançar um 01:10 pré-diluição.
   3. RDE tratar e pre-diluir soros de animais a 01:10 para usar controles por 1.12.2.
      Nota: Descongelados e tratados soros humanos e animais podem ser armazenados a 4 ° C por não mais do que 24 h. Sera deve ser armazenado congelado a-20 ° C ou mais frio se mais longo período de armazenamento é necessária antes do ensaio.
   4. Para testar com um vírus, adicionar 100 µ l 01:10 diluído soros a colunas de A1 a A10 (Figura 4). Adicione 50 µ l de diluente de vírus para linhas B a H, exceto colunas 11 e 12 (Figura 4). Realizar uma diluição serial 2 vezes de linhas de À H e descartar a última 50 μL na coluna H (Figura 4).
      Nota: Quando vários vírus estão a ser testado, soros podem ser diluídos em tubos de titulação. A diluição do soro, para a finalidade de determinar a concentração de soro, no bem A é 01:10, bem B 01:20, bem C 01:40, bem 1:80 de D, bem E 1:160, bem F 1:320, bem 1:640 de G, bem H 1:1,280 (Figura 4).
   5. Para o controle de vírus, adicionar 50 μL de diluente de vírus poços A12, B12, C12 e D12 (sem soro). Para o controle de célula, adicionar 100 µ l de diluente de vírus poços E12, F12, G12 e H12 (nenhum vírus, não sera).
   6. Para os soros de controlo (por exemplo, controles de soros de furão), adicione 100 µ l do soro controle diluído bem uma coluna 11 e adicionar 50 µ l de diluente de vírus para poços B11 - H11. Série diluído para baixo.
   7. Cobrir as placas, incubar a 37 ° C, 5% CO₂ até que esteja pronto para a adição de vírus.
2. Dia 1: Adição de vírus
   1. Dilua o vírus a 100 TCID₅₀50 µ l com diluente de vírus.
   2. Adicione vírus diluído de 50 µ l de todos os poços, excepto a coluna 11 sobre as placas traseiras titulação (BT) e poços de controle a célula E12, F12, G12 e H12 em todas as placas (Figura 4). Para as chapas com soros de controlo na coluna 11, adicione vírus a coluna 11.
   3. Volta a titulação (BT)
      1. Inclua um BT na coluna 11 de um conjunto de placas duplicadas (por exemplo, placa 1A e 1B). Adicione 50 µ l de diluente de vírus para todos os poços na coluna 11. Adicione 50 µ l do vírus em 100 TCID₅₀50 µ l para o primeiro poço (A11). Misture pipetando para cima e para baixo.
      2. Misturar e transferir 50 µ l de sucessivos poços para executar 2 vezes diluições em série. Altere as pontas de pipeta entre poços para evitar transferência do vírus. Descarte de 50 µ l de H11 bem.
      3. Adicione 50 µ l de diluente para coluna 11 para trazer o volume final de 100 µ l. vírus toque as placas para misturar.
   4. Incube as placas a 37 ° C, 5% de CO₂ por 1h.
   5. Realizar adição de células MDCK-SIAT1 no dia 1 e ELISA no dia 2, como descrito nos passos 4.2 e 4.3 (também descrito em 5.3 e 5.4)
3. Dia 1: Adição de células MDCK-SIAT1
   1. Prepare as células MDCK-SIAT1, conforme descrito na etapa 4.2. Adicione 100 células MDCK-SIAT1 de µ l em 1.5 x 10⁵ células/mL para cada poço (1,5 x 10⁴ células/poço). Incube as placas a 37 ° C, 5% de CO₂ para 18-20 h.
4. Dia 2: ELISA
   1. Após a incubação durante a noite, no segundo dia, corrigi as células com acetona gelada 80% conforme descrito na etapa 4.3.
   2. Adição de anticorpo primário
      1. Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Diluir o anticorpo monoclonal antigripe A NP (anticorpo primário) a concentração óptima conforme determinado por titulação em diluente de anticorpo (por exemplo, Adicionar 30 µ l de anticorpo primário a 30 mL de diluente para uma diluição de 1: 1000 de alvo do anticorpo).
         Nota: 100 µ l de anticorpo primário é necessário por bem. ~ 10 mL é necessária por placa.
      2. Adicione o anticorpo primário diluídos de 100 µ l a cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
   3. Adição de anticorpo secundário
      1. Lave a placa 3 vezes com tampão de lavagem 300 µ l. Diluir a cabra anti-mouse IgG conjugada com anticorpo HRP (anticorpo secundário) para a concentração alvo no diluente de anticorpo (por exemplo, adicionar 7,5 µ l de anticorpo secundário a 30 mL de diluente para um alvo 1:4000 anticorpo.)
         Nota: 100 µ l de anticorpo secundário é necessária por 96 bem. ~ 10 mL é necessária por placa.
      2. Adicione o anticorpo secundário diluído de 100 µ l de cada poço. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
   4. Adição do substrato e leitura de placa
      1. Lave as placas 5 vezes com 300 µ l lavagem buffer e torneira na limpeza de fiapos.
      2. Adicione 100 µ l de substrato recentemente preparado a cada poço e incubar a temperatura ambiente até os poços de controle do vírus atinjam um OD₄₉₀ = 0,8 - 3, com o controle de célula em uma baixa de fundo OD₄₉₀ < 0.2.
      3. Adicione 100 µ l da solução de paragem para todos os poços. Leia o D.O. de poços a 490 nm, utilizando um Espectrofotômetro de microplacas.
5. Análise de dados
   Nota: Os cálculos de MN são determinados por cada placa individualmente.
   1. Determine o título de anticorpos neutralizantes de cada amostra de soro.
      1. Calcule o limite de₄₉₀ OD de neutralização de vírus de 50% para cada placa, usando a seguinte equação:
         
         Nota: Aqui x = 50% de recorte neutralização. A diluição do soro recíproca correspondente à maior diluição com OD₄₉₀ menos de 50% de recorte (≥ 50% inibição) é considerado o título de anticorpos de neutralização para aquela amostra de soro (Figura 5).
   2. Verifique se os poços de controle do celular tem uma OD₄₉₀ < 0.2 e poços de controle do vírus tem uma OD₄₉₀ = 0,8 - 3.
   3. Verifique se a infectividade do vírus em cada ensaio (100 x TCID₅₀) pelo vírus BT o intervalo aceitável de BT 50, 100 ou 200 TCID. Se usando o mesmo corte, conforme definido na etapa 4.4.2, a maior diluição do vírus na coluna BT com OD acima o corte deve ser em poços E11, F11, G11.
      Nota: Os controles de soro positivo devem dar títulos dentro de 2 dobras dos valores obtidos nos testes anteriores. O OD₄₉₀ do controle negativo soro deve ser semelhante à observada para o controle de vírus.

Resultados

Determinação da infectividade das populações de vírus é o primeiro passo no ensaio de MN. A Figura 2 ilustra o layout da placa para determinar a TCID₅₀ das populações de vírus. Para reservas de vírus com infecciosidade desconhecida, o vírus pode ser titulado de várias pre-diluições, por exemplo 10^-2 e 10^-3, a fim de capturar a melhor curva de titulação para calcular a infectividade do vírus. A quantidade de v?...

Discussão

O ensaio de MN é um dos principais ensaios utilizados para sorologia de gripe para detectar respostas de anticorpos após a infecção da gripe ou vacinação. Títulos gerados a partir de ensaios de MN são usados frequentemente como o resultado primário de muitos estudos de gripe hematológicas. Ensaios de MN são também amplamente utilizados para sero-diagnóstico e avaliação da imunogenicidade da vacina. Internacionais interlaboratório estudos têm sido realizados para comparar os ensaios de MN, realizados em v...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose	Life Science	11965	A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamine	Life Science	25030-081
Sodium pyruvate	Life Science	11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Life Science	15630-080
Penicillin/Streptomycin	Life Science	15140-122
Acetone	VWR	67-64-1	Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric Acid	Fisher Scientific	A510-P500	Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4L	VWR	EM-AX0422-3	Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTA	Life Science	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal Ab	Millipore pool	MAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP	KPL	074-1802
96-well flat-bottom plates	Thermo Scientific	3455
Plate reader	Molecular Device	Spectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap	Corning/VWR	3151