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요약

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

초록

조류 독감 바이러스 (HA)에 대 한 중화 항 체는 인플루엔자 감염에 대 한 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘으로 간주 됩니다. Microneutralization (미네소타) 분석 실험 자주 독감 예방 접종 또는 감염 후 인간의 혈 청의 중화 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 됩니다. Madine 다 비 개 신장 (MDCK) 세포는 미네소타 분석 실험에 대 한 일반적으로 사용 되 셀 기판. 그러나, 현재 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 인플루엔자 바이러스 획득 순환 수용 체 바인딩 특이성 변경. 표면에 증가 된 α-2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties로 MDCK SIAT1 셀 라인은 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스에 대 한 향상 된 infectivity 기존의 MDCK 셀 보다 더 충실 한 복제를 제공을 입증 했다. 여기, 우리는 미네소타 분석 결과 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 계량 하도록 최적화 된 설명 합니다. 이 프로토콜 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 시킬 수 있도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 하룻밤 배양 후 플레이트 고정 되 고 각 바이러스의 양을 잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 인플루엔자를 사용 하 여 계량은 nucleoprotein (NP) 단일 클론 항 체. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity의 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.

서문

인플루엔자 바이러스는 인간의 인구 매년 사망률 및 사망 원인을 계속. 하는 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 당단백질. HA를 대상으로 하는 중화 항 체는 인플루엔자 감염1,2의 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘입니다. Hemagglutination 억제 (HI) 분석 실험 및 MN 분석 널리 인플루엔자 감염이 나 예방 접종3후 인간의 혈 청에 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 하는 두 가지 방법이 있습니다. 이 분석 결과 붉은 혈액 세포의 바이러스 hemagglutination의 항 체 억제를 측정 하 고 분석 결과 대리 하는 것으로 간주 됩니다. 안녕, 달리 미네소타 분석 결과 직접 인간의 세라 셀 문화에서 인플루엔자 감염을 중화 하는 항 체의 수치를 측정할 수 있습니다. MDCK 셀 인플루엔자 바이러스 분리에 자주 사용 하 고 미네소타 분석 실험4.

인플루엔자 바이러스는 지속적으로 antigenic 드리프트와 shift, 바이러스의 수용 체 의무적인 특이성을 변경할 수 있는 HA 단백질에 돌연변이 인수 받 다. 2014 년 이후 A(H3N2) 바이러스의 새로운 클러스터 등장 하 고 현재 시즌까지 회람 하기 위하여 계속 했다. 이 바이러스의 대부분은 유전 그룹 3C.2a와 3C.3a HA 단백질의 계통 발생 분석에 기반에 속한다. 순환 3C.2a 바이러스의 많은 hemagglutinate 붉은 혈액 세포 수를 감소 했다 고이 분석 실험5에 의해 특성화 될 수 없습니다. 중립화 분석6hemagglutinate 하지 않는 이러한 바이러스에 항 체 응답을 측정 하기 위해 사용 되어야 한다. 또한, 연구는 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 수용 체 바인딩 속성 이전 A(H3N2) 바이러스에 비해 변경 및 문화 적응 돌연변이 및 다형성 체 외에서 세포에 passaged 때 축적 하는 경향이 나타났습니다. 문화7,,89. 기존의 MDCK 세포와 비교 하면, MDCK-SIAT1는 Matrosovich 그 외 여러분 에 의해 개발 된 셀 라인 인간의 α2, 6-sialtransferase (SIAT1)의 cDNA와 MDCK 세포의 안정 되어 있는 transfection을 통해 이 셀 라인 α2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties 및 α2, MDCK 셀10부모 보다 3 sialic acid moieties 감소 금액의 증가 양을 표현 한다. MDCK-SIAT1 세포 MDCK 세포11에 비해 A(H3N2) 바이러스에 대 한 격리 속도 향상 시킬 나타났습니다. 최근, 린 외. 보고는 새로 등장 3C.2a 및 3C.3a 인간 A(H3N2) 인플루엔자 바이러스, 더 충실 한 바이러스 복제와 더 나은 바이러스 infectivity 달성 했다 바이러스 MDCK SIAT1 셀 라인 MDCK 셀7와 비교에 교양 있었다. 따라서, MDCK-SIAT1 세포는 더 미네소타 A(H3N2) 바이러스의 최근 클러스터에 대 한 항 체 응답 특성 분석에 적합 합니다.

여기 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 인간 혈 청에 항 체 응답을 측정 하기 위해 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 MN 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과에 계란 또는 세포에서 바이러스를 사용할 수 있습니다. 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 하 고 복제를 허용 하도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 야간 보육, 후 판을 고정 하 고는 ELISA 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체를 사용 하 여 각 우물에서 바이러스의 양을 계량은. NP의 감지 바이러스 감염의 존재와 항 체를 중화의 부재를 나타냅니다. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity ≥ 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.

프로토콜

모든 독감 바이러스는 적절 한 biosafety 수준 요구 사항에 따라 처리 되어야 합니다 (BSL-2 또는 더 높은) Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL)12에 Biosafety에 정의 된 대로.

1입니다. 시 약 및 시작 물자의 준비

  1. MDCK-SIAT1 세포와 균 세포 배양 매체 준비
    1. 높은 포도와 500 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)를 사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 배양 을 준비, 10 %v / v 열 소 태아 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 나트륨 1 mM pyruvate, 1 mg/mL G418 황산 염 (예를 들어, 비활성화 geneticin), 및 (옵션) 100 µ g/mL 스와 100 U/ml 페니실린. 0.2 µ M 기 공 크기 세포 막을 통해 여과 하 여 소독. G418 황산 염 MDCK SIAT1 세포에서 플라스 미드의 안정성을 보장 하기 위해 추가 됩니다.
    2. MDCK-SIAT1 셀 라인을 준비 합니다. 162 cm2-살 균 세포 배양의 30 mL를 포함 하는 조직 문화 flask(s) 씨앗 2-2.5 x 106 MDCK SIAT1 세포를 플라스 크에 2 일; 5% CO2 에서 37 ° C에서 품 어 이 조직 문화 감염 복용량 (TCID) 결정 하 고만 사용 될 것입니다 분석 실험.
      참고: MDCK SIAT1 셀 친절 하 게 박사 M. Matrosovich, Marburg, 독일10에 의해 제공 되었다. 이 셀 라인 얻어질 수 있다 또한 상업적으로 ( 테이블의 자료를 참조).
  2. DMEM 높은 포도 당, 0.3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 분수 V, 100 U/mL 페니실린, 스 100 µ g/mL, 500 mL와 20 mM HEPES 사용 하 여 살 균 바이러스 전파 미디어 를 준비 합니다. 0.2 µ M 기 공 크기 세포 막을 통해 여과 하 여 소독.
  3. 버퍼링 인산 염 (PBS) 0.01 M PBS, pH 7.2에 포함 된에서 0.75% (v/v) 기니 피그 적혈구 (gpRBCs)를 준비 합니다.
  4. DMEM 높은 포도 당, 1% 소 민 분수 V (BSA), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 20 mM HEPES 사용 하 여 살 균 바이러스 희석제 를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기 막으로 여과 하 여 살 균 하십시오 그리고 신선한 각 분석 결과 대 한 준비.
  5. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2)에서 80% 찬 아세톤으로 차가운 세포 정착 제 를 준비 합니다.
  6. 세척 버퍼 PBS (0.01 M PBS pH 7.2)를 사용 하 여 준비 및 0.3% (v/v) 트윈-20.
  7. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2)를 사용 하 여 항 체 희석 액 을 준비, 0.3% (v/v) 트윈-20, 그리고 5% 비-지방 우유를 건조.
  8. 1 차 항 체로 항 인플루엔자 A NP 마우스 단일 클론 항 체 클론 A1 및 A3 풀을 사용 합니다. 희석제 최적 농도에서 정한 적정 항 체에 희석.
  9. 사용 염소 반대로 마우스 IgG 활용 말 무 과산화 효소 (HRP) 이차 항 체. 희석제 최적 농도에서 정한 적정 항 체에 희석.
  10. 과산화 효소 기질 0.05 M 인산 염 구 연산 염 버퍼 pH 5에서에서 o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD)를 사용 하 여 준비 합니다. 1 캡슐/100 mL 이온된 H2o. 분해 1 OPD 태블릿 (10 mg)을 용 해 하 여 0.05 M 인산 염 구 연산 염 버퍼를 준비 / 인산 염 구 연산 염 버퍼 사용 직전의 20 mL.
  11. OPD 중지 솔루션으로 0.5 M의 황산을 사용 합니다. 972 mL 이온된 H2O 화학 후드에서 18 M 황산 재고 28 mL를 추가 합니다.
  12. 인간과 동물 세라의 치료
    1. 열 분석 결과 이전 30 분 동안 56 ° C에서 물 욕조에만 분석에 사용 되는 인간의 세라 비활성화. 즉시 사용 하거나 필요한 경우, 저장 더 이상 24 h; 4 ° C에서 해 동된 세라 장기간 보관이 필요한 경우 세라-20 ° C에서 냉동 또는 추운 저장 합니다.
    2. 수용 체 파괴 효소 (RDE)와 MN 분석 실험에 사용 된 동물 세라 치료 및 열 분석 결과 사전 다음과 같이 비활성화.
      1. 37 ˚C 물 욕조에 세라를 녹여 다음 얼음에. 믹스 1 RDE의 3 볼륨 동물 혈 청 샘플의 볼륨. 18-20 h 37 ˚C에서 품 어.
      2. 열 비활성화 PBS, pH 7.2 1시 10분의 최종 사전 희석에 대 한 각 샘플의 30 분 추가 6 볼륨 56 ˚C에서 취급 하는 RDE 세라. 필요한 경우, 저장 더 이상 24 h; 4 ° C에서 해 동된 세라 장기간 보관이 필요한 경우 세라-20 ° C에서 냉동 또는 추운 저장 합니다.
        참고: 동물 세라 인플루엔자 바이러스의 있다 바인딩할 하 고 인플루엔자-특정 안티의 바인딩을 억제 수 있습니다 다양 한 sialic acid glycans 포함 될 수 있습니다-HA 항 체. 따라서, 그것은 필요가 RDE 치료 혈 청 샘플에서 이러한 일반적인 바이러스 성 하 바인더를 제거 하려면 미네소타 분석 전에 모든 동물 세라.

2. MDCK SIAT1 세포 배양의 통로

참고: 모든 셀 문화 생물 안전 캐비닛 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다.

  1. 162 cm2 플라스 크에 세포 단층에서 세포 배양을 가만히 따르다. 트립 신-EDTA와 단층을 rinsing 하 여 세포를 trypsinize. 5 mL 트립 신-EDTA 셀 단층 커버를 추가 합니다. 37 ° c, 5% CO2 는 단층 분리 (5-10 분) 때까지 품 어. 포함 된 trypsinized 셀, 셀을 아래로 피펫으로 각 플라스 크에 MDCK SIAT1 세포 배양의 15 mL를 추가 합니다.
  2. 사용 하 여 hemocytometer trypan 블루 셀 계산을 결정 하 고 생존. 시드 2-2.5 x 106 세포 /flask 세포 배양의 30 mL를 포함 새로운 162 cm2 조직 배양 플라스 크에 세포와 TCID와 MN 분석 실험에서 사용 하기 위해 2 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어. 씨 4-5 x 106 셀/플라스 크에 세포와 바이러스 전파에 사용 하기 위해 2 일 동안 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.
    참고: 짧은 지 또는 긴지를 문화 기간 바란다면 시드 밀도 조정할 수 있습니다. 바이러스 전파에 대 한 셀에 도달 해야 이상 100 %confluency. 조직 문화 감염 복용량 (TCID)와 MN 분석 실험, 셀 75-95 %confluency (그림 1)에 있어야 합니다.

3. A(H3N2) MDCK SIAT1 세포에 바이러스의 전파

참고: A(H3N2) 바이러스 오래 된 embryonated 암 탉의 계란 표준 프로토콜3, 또는 MDCK SIAT1 셀 문화 10-11 하루 중에 전파 될 수 있습니다. MDCK-SIAT1 셀 이상 100%에 도달 해야 바이러스 접종에 대 한 confluency. 바이러스 씨 주식 inoculum의 여러 희석으로 주사 될 수 있습니다. 최고의 수확 하 inoculum 희석 및 infectivity 추가 MN 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.

  1. 셀 단층에서 세포 배양 매체를 제거 (> 100 %confluency) 162 cm2 플라스 크에. 살 균 0.01 M PBS, pH 7.2의 15 mL로 두 번 단층을 세척 하 고 가만히 따르다.
  2. 제어로 1 플라스 크 라벨 고 바이러스 전파 미디어의 20 mL를 추가 합니다. 플라스 크 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 이 플라스 크 그대로 두고 바이러스 전파의 1 일 후 비교를 위해 사용.
  3. flask(s)에 살 균 바이러스 전파 미디어의 10 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 모든 flask(s)를 품 어. 실 온에서 인플루엔자 바이러스의 유리병을 녹여 다음 얼음에. 바이러스 전파 미디어 대상 희석을 희석.
    참고: 대상 희석 조정 될 수 있다 바이러스 주식의 HA titers 기반으로 합니다. 준비는 1:1000 inoculum을 희석, 살 균 바이러스 전파 미디어의 9.9 mL를 100 µ L 바이러스의 추가. 부드럽게 반전, 제거 살 균 바이러스 전파 미디어의 9 mL에 1: 100 희석의 1 mL, 희석 1:1000 inoculum 위한 살짝 반전. 얼음에 놓습니다.
  4. 인큐베이터에서 제어 플라스 크를 제외 하 고 모든 플라스 크를 제거 합니다. Flask(s) MDCK-SIAT1 세포에서 바이러스 전파 미디어를 제거 하 고 희석된 바이러스의 10 mL와 함께 각 플라스 크에 접종. 37 ° C, 5% CO2 1 h, flask(s) 15 분 마다 회전에 플라스 크를 품 어.
  5. flask(s)에서 inoculum의 5 mL을 제거 하 고 1 µ g/mL TPCK-트립 신을 포함 하는 15 mL 바이러스 전파 미디어 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2 16-18 h에서 flask(s)를 품 어.
  6. 밤새 부 화 후 현미경 배율 X 100에서 flask(s)를 관찰 하 고 cytopathic 효과 (CPE) 셀에 대 한 보고. Flask(s)에서 15-17 mL의 표면에 뜨는 바이러스를 제거 하 고 2 µ g/mL TPCK-트립 신을 포함 하는 갓된 바이러스 전파 미디어의 15-17 mL를 바꿉니다.
  7. 37 ° c, 5% CO2플라스 크를 품 어. (비교해보면 셀 제어 플라스 크) 단층의 CPE를 모니터링 하 고 주기적으로 HA (모든 4 h) 0.75 %gpRBC 수확까지 확인.
    1. HA 96 잘 결정 플레이트를 설정 합니다. 0.01 M PBS, pH 7.2 웰 스 A2-a 12와 b 2-b 12의 50 µ L 추가 (중복), 및 제어를 위한 H12 웰 스 H1-.
    2. 추가 바이러스 표면에 뜨는 100 µ L a 1과 A2, A1 및 B1 A12 그리고 B12 통해 2-fold 직렬 희석을 수행 합니다. A12 그리고 B12 혼합 후 50 µ L를 버리십시오. 0.75 %gpRBCs 50 µ L A, B, 및 H. 행 추가
    3. 접시를 누르고 1 시간 실 온에서 품 어.
      1. 60 ° 각도를 45 °에서 96 잘 결정 플레이트를 기울이기에 의해 표면에 뜨는 바이러스의 HA를 결정 합니다.
      2. Hemagglutination;에 대 한 번호판을 읽기 완전 한 hemagglutination를 달성 하는 바이러스의 가장 높은 희석에는 특정 바이러스에 대 한 적정 하 끝점으로 간주 됩니다. 높은 바이러스 희석의 완전 한 hemagglutination와 HA titer로 바이러스의 상호를 기록 합니다.
        참고: 행 H (컨트롤)에 정착된 Rbc "실행" 시작 하 고 중력으로 인해 작은 눈 물방울 모양을 형성 한다. 제어 우물 완료에서 Rbc까지 대기 팬 들은 바이러스에 RBC 버튼 적정 웰 스의 정보를 읽고 다음 실행. RBC 단추 및 "실행", 그 hemagglutination을 달성 하지 않습니다. 바이러스의 끝점 HA titer로 hemagglutination를 완전히 억제 하는 바이러스의 가장 높은 희석을 찾습니다.
  8. 바이러스 문화의 하 고원 또는 바이러스 문화 대상 하에 도달 하는 경우 바이러스를 수확 (예 > 16 HAU), 셀 전에 단층 상당한 CPE를 표시 하기 시작 하지만.
    1. 300 x g 작은 세포질 파편을 4 ° C에서 10 분 동안에 표면에 뜨는 바이러스 문화 원심 깨끗 한 관을 바이러스 수확을 포함 하는 명확히 상쾌한 전송. Aliquot 바이러스를 포함 하는 상쾌한 일회용 살 균 저온 튜브에 수확 하 고-70 ° C에 또는 추 즉시 동결.
      참고: MN 분석 실험을 위해 사용 하는 바이러스 주식 해야 높은 감염 titer 최소한의 결함이 있는 입자. 바이러스 주식 100 TCID50/50 µ L MN 분석 결과 대 한 달성의 최소 희석 1: 100입니다.
      참고: MN 분석 실험에서 사용 하는 바이러스 주식 해야 안 수 해 동 및 refrozen.

4입니다. 바이러스의 TCID의 결정

  1. 제 1 일: 바이러스 적정
    1. 실 온에서 바이러스의 유리병을 해 동 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
    2. 두 개의 다른 시작 희석에서 바이러스 테스트: 10-2 , 10-3. 10-2 희석에 대 한 희석제 바이러스의 9.9 mL에 바이러스의 100 µ L를 추가 합니다. 10-3 희석에 대 한 희석제 바이러스의 9.0 mL를 10-2 희석의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 두 결정을 사용 하 여 접시 (접시 1 10-2 희석에 대 한) 및 격판덮개 2 10-3 희석, 96-잘 결정 접시의 1 열을 제외한 모든 우물에 바이러스 희석제의 100 µ L를 추가 합니다.
    4. ½log10 희석 (10-2, 10-2.5, 10-3, 등)을 수행 합니다. 열 1에서에서 시작 하는 모든 우물을 희석 하는 바이러스의 146 µ L을 추가 하 고 열 열 11 (그림 2)를 통해 1에서에서 46 µ L를 직렬로 전송. 웰 스 사이 변화 피 펫 팁. 혼합 후 열 11, 46 µ L 희석와 팁을 삭제 합니다.
    5. 사용 열 12로 셀 제어 (CC); 그것은 바이러스 희석제를 포함 됩니다. 37 ° C, 5 %CO 1 시간에 대 한 품 어2.
  2. MDCK-SIAT1 세포의 제 1 일: 준비
    참고: MDCK SIAT1 세포 단층 TCID와 MN 분석 실험에 대 한 75-95 %confluency 도달 한다. 95 %confluency 한 162 cm2 플라스 크 씨에 게 충분 한 세포를 산출 해야 한다 ~ 4-5 결정 플레이트.
    1. 75-95 %confluent 단층 20 mL 문화 미디어에서는 FBS를 제거 하는 PBS로 세척. Trypsinize 셀 다음과 같습니다.
      1. 살 균 PBS와 단층 린스, 7 mL 트립 신-EDTA 셀 단층 커버를 추가 합니다. 플라스 크를 누워 평평 하 고 37 ° c, 5% CO2 는 단층 분리 (약 5-10 분) 때까지 품 어. Trypsinized 셀에 포함 된 각 플라스 크에 바이러스 희석제의 7 mL를 추가 합니다.
    2. 워시는 FBS를 제거 하려면 바이러스 희석제와 셀.
      1. 부드럽게 아래로 셀을 분리 하기 위하여 플라스틱. 50 mL 원뿔 튜브; 셀 전송 바이러스 희석제로 튜브를 채우십시오.
      2. 5 분 Decant 희석제 바이러스에 대 한 485 x g에서 원심, 신선한 50 mL 바이러스 희석제, 대체 및 5 분 Decant 희석제 바이러스에 대 한 485 x g에서 원심 및 신선한 바이러스 희석제를 바꿉니다 (10ml/플라스 크) resuspend 펠 릿을.
    3. 이용 hemocytometer trypan 블루 셀 수와 생존 능력 결정 하. 1.55 셀/10ml x 희석제 바이러스 세포 농도 조정 합니다.
    4. 결정 플레이트 (104 셀/잘 x 1.5)의 각 음을 희석된 MDCK SIAT1 세포의 100 µ L을 추가 하 고 번호판 커버. 37 ° C, 5% CO2 18-20 h에서 품 어.
  3. 제 2 일: 애 란
    1. 셀의 고정
      1. 결정 플레이트에서 매체를 제거 합니다. 각 씻어 PBS의 200 µ L로 잘. 각 잘을 300 µ L 찬 80% 아세톤을 추가 하 고 10 분은 정착 액을 제거 하 고 공기 접시 건조 허용에 대 한 실 온에서 품 어.
    2. ELISA
      1. 1 차적인 항 체 추가
        참고: 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체 사용 되어야 한다 초과에서 ELISA에 1 차 항 체로. 미네소타에 있는 항 체 titrations를 수행 하 여 기본 항 체의 각 주차장에 대 한 최적의 항 체 희석을 결정 합니다. 최상의 신호 대 배경 비와 초과에서 기본 항 체 농도 선택 합니다.
        1. 희석제 항 체에서 대상 농도에 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체 (1 차적인 항 체)를 희석 (예: 추가 30 µ L 1 차적인 항 체의 항 체 1:1000의 대상 희석에 대 한 희석제의 30 mL).
        2. 3 번 워시 버퍼의 300 µ L로 세척 접시. 각 잘을 100 µ L 희석된 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
      2. 이차 항 체 추가
        참고: 염소 마우스 IgG 말 무에 활용 된 안티 과산화 효소 (HRP)로 사용 해야 초과에서 ELISA에서 이차 항 체. 항 체 titrations를 수행 하 여 각 많이 이차 항 체에 대 한 최적의 항 체 희석을 결정 합니다. 최상의 신호 대 배경 비 초과에서 2 차 항 체 농도 선택 합니다.
        1. 염소-마우스 IgG HRP 항 체 (이차 항 체)를 활용 (30 ml 희석제 대상 1:4000 희석에 대 한 항 체의 이차 항 체의예: 추가 7.5 µ L)에 항 체 희석제에 대상의 농도에 희석.
        2. 3 회 300 µ L 워시 버퍼와 접시 세척. 각 잘을 100 µ L 희석된 이차 항 체를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
      3. 기판 추가 및 판 읽기
        1. 5 회와 300 µ L 워시 버퍼 보풀 지우기에 꼭지 격판덮개를 세척.
        2. 각 우물에 갓된 기판의 100 µ L을 추가 하 고 색상 개발 포화 될 때까지 실 온과 세포 제어 우물의 광학 밀도 (OD)에서 품 어 < 0.2.
        3. 모든 우물을 정지 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 490에서 우물의 OD 읽기 nm microplate 분 광 광도 계를 사용 하 여.
  4. TCID 50 계산
    1. 셀 컨트롤 (열 12)의 메디아 OD490 을 계산 합니다.
    2. OD490 와 잘 테스트를 두 번 중간 "긍정적인";로 CC 우물의 OD490 보다 큰 고려 그렇지 않으면, 그것은 "부정적인" 간주 됩니다.
    3. 13의 리드 Muench 메서드 사용 하 여 바이러스의 TCID50 을 계산 합니다.
      1. 확실성 그리고 네거티브 각 희석에의 수를 결정 합니다.
      2. "누적 긍정", "누적 부정적인", "비율", 그리고 "긍정적인"으로 % 표 1에 나와 있는 계산 합니다.
      3. 희석 보여주는 사이 "비례 거리" 계산 > 50% 확실성 및 희석 표시 < 50% 긍정 다음을 사용 하 여:
        figure-protocol-10964
        참고: ½ 로그 희석에 대 한 수정 계수는 0.5. 예를 들어 표 1에: (80 − 50) /(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. > 50% 긍정적인 보여주는 희석에 비례 거리를 추가 하 여 바이러스 TCID50 을 계산 합니다.
        참고: 예를 들어 표 2, TCID50 는 10-5+(-0.25) 10-5.25=. 이것은 100 µ L (또는 10-5.25/100 µ L) 바이러스의 TCID50 note.
    4. 바이러스 희석을 계산 합니다. MN 분석 실험, 대 한 바이러스 200 TCID50/100 µ L (잘 당 100 TCID50/50 µ L에 해당)를 희석.
      주: 표 1에서 예제 1 TCID50 100 µ L에 10-5.25 이며 200 TCID50/100 µ L를 달성 하기 위해 희석 1:891 계산에 따라: 200 x 10-5.25 10-2.95 = 1/102.95 = = 1 / 891

5. 미네소타 분석 결과 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여

  1. 주 1: 테스트 및 제어 세라 준비와 접시 레이아웃
    1. 37 ° C 물 목욕에서 세라를 녹여 고 녹고 후 즉시 제거 합니다. 약 테스트; 하는 세라의 금액 수 원래 세라의 10 µ L의 최소 일 중에 하나의 바이러스 테스트 필요 합니다. 중복에서 세라를 가능 하면 테스트.
    2. 열 비활성화 단계 1.12.1 에서처럼 56 ° C 물 욕조에 30 분에 대 한 인간의 세라. 얼음에 장소 세라 열 비활성화, 1시 10분을 달성 하는 세라를 바이러스 희석제를 추가 사전 희석.
    3. RDE 취급 하 고 미리 동물 세라 1.12.2 당 컨트롤 사용 하 여 1:10 희석.
      참고: 해 동된 대우 인간과 동물 세라 이상 24 h. 보다 세라 저장 되어야 한다-20 ° C에서 냉동 또는 추운 경우 더 이상 저장 기간 분석 결과 이전 필요 4 ° C에 저장할 수 없습니다.
    4. 한 바이러스를 테스트 하려면 추가 100 µ L 1시 10분 희석 A10 a 1 열을 세라 (그림 4). 행 B 열 11 및 12 (그림 4)를 제외 하 고 H 통해 바이러스 희석제의 50 µ L를 추가 합니다. 2-fold 직렬 희석 행 A H을 통해 수행 하 고 삭제는 마지막 50 µ L 행 H (그림 4).
      참고: 지금까지 여러 바이러스 테스트할 때에 세라 titer 튜브에 희석 수 있습니다. 혈 청 희석 잘 a에서 혈 청 titer를 결정의 목적에 대 한 1:10, 잘 B 1시 20분, C 1:40, 잘 D 1:80 E 1:160 잘 잘, 잘 F 1:320, G 1:640 잘 잘 H 1:1,280 (그림 4).
    5. 바이러스 컨트롤 추가 바이러스 희석제의 50 µ L 웰 스 A12, B12, C12, 그리고 D12 (세라). 셀 컨트롤 추가 바이러스 희석제의 100 µ L 우물 E12, F12, G12, 및 H12 (아니 바이러스, 아니 세라).
    6. 제어 세라 (예를 들어 흰 족제비 세라 컨트롤)에 대 한 잘 열 11를 하 고 바이러스 희석제의 50 µ L 우물 B11-H11 희석된 제어 세라의 100 µ L를 추가 합니다. 시리얼 다운 희석입니다.
    7. 커버 플레이트, 37 ° c, 5% CO2 바이러스 추가 대 한 준비까지 품 어.
  2. 제 1 일: 바이러스 추가
    1. 희석제 바이러스 바이러스 100 TCID50/50 µ L 희석.
    2. 다시 적정 (BT) 접시에 모든 플레이트 (그림 4)에 셀 제어 우물 E12, F12, G12, 및 H12 11 열 제외한 모든 우물에 50 µ L 희석된 바이러스를 추가 합니다. 열 11에서 제어 세라와 그 번호판에 대 한 열 11에 바이러스를 추가 합니다.
    3. 다시 적정 (BT)
      1. (예를 들어 접시 1A 및 1B) 중복 격판덮개의 1 세트의 열 11에에서는 BT를 포함 합니다. 11 열에 있는 모든 우물에 바이러스 희석제의 50 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 우물 (A11)를 100 TCID50/50 µ L에서 바이러스의 50 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합.
      2. 혼합 하 고 50 µ L 2-fold 직렬 희석을 수행 하기 위해 연속 웰 스 전송. 피 펫 팁을 피하기 위해 바이러스 월 우물 사이 변경 합니다. 잘 H11에서 50 µ L를 삭제 합니다.
      3. 바이러스 열 100 µ L. 최종 볼륨을가지고 11 희석제의 50 µ L를 섞어 판 탭을 추가 합니다.
    4. 37 ° C, 5% CO2 1 h에서 접시를 품 어.
    5. 하루에 1 MDCK-SIAT1 셀 추가 및 ELISA 하루에 2 단계 4.2 및 4.3 (또한 5.3 및 5.4에 설명 된)에 설명 된 대로 수행
  3. 제 1 일: MDCK SIAT1 셀 추가
    1. 4.2 단계에서 설명한 대로 MDCK SIAT1 셀을 준비 합니다. 각 잘 (104 셀/잘 x 1.5)를 1.5 x 105 셀/mL에서 100 µ L MDCK SIAT1 셀을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 18-20 h에서 번호판을 품 어.
  4. 제 2 일: 애 란
    1. 4.3 단계에서 설명한 대로 두 번째 날, 하룻밤 부 화 후 80% 찬 아세톤과 셀을 수정.
    2. 1 차적인 항 체 추가
      1. 3 회 300 µ L 워시 버퍼와 접시 세척. 적정 항 체 희석 액에 의해 결정으로 최적 농도를 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체 (1 차적인 항 체)를 희석 (예: 추가 30 µ L 1 차적인 항 체의 항 체 1:1000의 대상 희석에 대 한 희석제의 30 mL).
        참고: 기본 항 체의 100 µ L가 잘 당 필요 합니다. ~ 10 mL 접시 당 필요 하다.
      2. 각 잘을 100 µ L 희석된 1 차적인 항 체를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
    3. 이차 항 체 추가
      1. 세척 접시 3 번 300 µ L 워시 버퍼. 염소를 희석 안티 마우스 IgG 항 체 희석 액 (예: 추가 7.5 µ L의 이차 항 체 항 체 대상 1:4000에 대 한 희석제의 30 ml.)에서 대상 농도에 HRP 항 체 (이차 항 체)를 활용
        참고: 이차 항 체의 100 µ L가 필요 당 96 잘 합니다. ~ 10 mL 접시 당 필요 하다.
      2. 각 잘을 100 µ L 희석된 이차 항 체를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
    4. 기판 추가 및 판 읽기
      1. 5 번와 300 µ L 워시 버퍼 지우기 보풀에 꼭지 격판덮개를 세척 하십시오.
      2. 각 우물에 갓된 기판의 100 µ L을 추가 하 고 바이러스 컨트롤 우물 OD490 에 도달할 때까지 실 온에서 품 어 = 0.8-3, 낮은 셀 컨트롤과 배경 OD490 < 0.2.
      3. 모든 우물을 정지 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 490에서 우물의 OD 읽기 nm microplate 분 광 광도 계를 사용 하 여.
  5. 데이터 분석
    참고: 미네소타 계산 결정 됩니다 각 접시에 대 한 개별적으로.
    1. 각 혈 청 샘플의 중화 항 체 titer를 결정 합니다.
      1. 다음 수식을 사용 하 여 각 접시에 대 한 50% 바이러스 중립화의 OD490 컷 계산:
        figure-protocol-15586
        참고: 여기 x = 중화 컷오프의 50%. OD490 으로 높은 희석에 해당 상호 혈 청 희석 컷오프 (50% 억제)의 50% 미만 그 혈 청 샘플 (그림 5)에 대 한 중화 항 체 titer를 간주 됩니다.
    2. 셀 컨트롤 우물 OD490 확인 < 0.2와 바이러스 컨트롤 웰 스는 OD490 = 0.8-3.
    3. 각 분석 결과 (100 x TCID50) BT의 바이러스 BT. 허용 가능한 범위에에서 바이러스 infectivity은 50, 100, 또는 200 TCID를 확인 합니다. 4.4.2 단계에서 정의 된 동일한 커트 오프를 사용 하 여, 경우는 커트 오프의 위 세는 BT 열에 높은 바이러스 희석 우물 E11, F11, G11에에서 있어야 합니다.
      주: 혈 청 긍정적인 컨트롤 줘야 내 titers 2-fold 이전 테스트에서 얻은 값의. OD490 부정적인 혈 청 컨트롤의 유사한 바이러스 컨트롤에 대 한 관찰 해야 합니다.

결과

바이러스 주식의 infectivity의 결정만 분석 결과 첫 번째 단계입니다. 그림 2 에서는 접시 레이아웃을 바이러스 주식의 TCID50 결정을 보여 줍니다. 알 수 없는 infectivity 바이러스 주식, 대 한 바이러스 바이러스의 infectivity 계산을 최고의 적정 곡선을 캡처하기 위해 여러 사전 희석, 예 10-2 와 10-3에서 적정 수 있습니다. MN 분석 결?...

토론

MN 분석 결과 인플루엔자 혈 청 학에 대 한 인플루엔자 감염이 나 예방 접종을 다음과 같은 항 체 응답을 검색 하는 데 사용 하는 주요 분석 실험 중 하나입니다. 많은 인플루엔자 seroepidemiology 연구의 주요 결과 titers MN 분석 실험에서 생성 된 자주 사용 됩니다. MN 분석 sero 진단 및 백신 immunogenicity의 평가 또한 널리 사용 됩니다. 국제 간 연구소 연구14여러 실험실 수행 하는 미네소?...

공개

저자는 충돌의 관심을 보고. 결과 및 결론을이 책에서 저자는 고 반드시 센터의 질병 통제 및 예방 및 자금 지원 기관에 대 한 대표 하지 않습니다.

감사의 말

우리이 원고 준비 박사 Xiuhua Lu, 박사 펭 류, 및 그들의 중요 한 검토 및 지원에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 양 애슐리 버로우즈 감사합니다. 우리는 그림 3의 그래픽을 준비 하 고 그의 도움에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 박사 아드리안 Reber 감사. 마지막으로, 우리는 박사 M. Matrosovich, Marburg, 독일 MDCK SIAT1 세포를 제공 하기 위한 감사 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high GlucoseLife Science11965A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30070.03
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase FreeSigma-Aldrich3117332001
L-GlutamineLife Science25030-081
Sodium pyruvateLife Science11360-070
Geneticin G-418 disulfate salt Sigma-AldrichA1720-5G  
HEPESLife Science15630-080
Penicillin/StreptomycinLife Science15140-122
AcetoneVWR67-64-1Used at an 80% concentration
Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate Sigma-AldrichSLBF2806V
O-Phenylenediamine Dihydrochloride tabletSigma-AldrichSLBQ1086V1 tablet per 100ml of cell culture grade water
Sulfuric AcidFisher ScientificA510-P500Used 0.5M final concentration
Ethanol, Denatured, 4LVWREM-AX0422-3Used at an 70% concentration
Trypsin-EDTALife Science1748048
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
Tween 20Sigma-AldrichP1379-500ml
Anti-NP mouse monoclonal AbMillipore poolMAB 8257 MAB 8258
Anti-mouse IgG HRP KPL074-1802
96-well flat-bottom platesThermo Scientific3455
Plate readerMolecular DeviceSpectromax 384 plus
Cell Culture Flask 162 cm2/Vent CapCorning/VWR3151

참고문헌

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