عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.

Abstract

في قلب سليمة، وتأثير الخلايا المجاورة cardiomyocytes الكبار. مع طريقة العزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار، إجراء تحقيق دقيق لسلوك هذه الخلايا ضمن بيئات وعلاجات محددة أمر ممكن. ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول لعزل ناجحة وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك).

هو التضحية بالفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العميق. ثم، يتم استخراج القلب والشريان الاورطي كشف. وفي وقت لاحق، يتم نضح على نظام التروية لانجيندورف مع نضوب الكالسيوم والعلاج كولاجيناز. بعد ذلك، أنسجة البطين يحصل مفروم، إعادة توزيع، وتصفيتها، تليها ثلاث خطوات استخدام الطرد المركزي مع الإضافة التدريجية كاكل₂ حتى يتم التوصل إلى تركيز الكالسيوم الفسيولوجية. يتم مطلي أرفك في خلية ثقافة الأطباق. بعد تحديث مستنبت الخلية، أرفك يمكن أن تزرع لمدة تصل إلى ستة أيام دون تغيير وسيلة الثقافة التي تحتوي على المصل. عزل أرفك عملية حساسة كالسيوم. التغييرات الصغيرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا يسبب نقصان في الجودة والسلامة للخلايا المعزولة.

أرفك على شكل قضيب طازجة معزولة. في الأيام الأولى للزراعة فإنها تفقد على شكل قضيب مورفولوجيا ونموذج pseudopodia مثل هياكل (نشر). خلال هذا التكوين المورفولوجي أرفك في البداية تتحلل عناصرها الهوس متبوعاً إصلاح عن طريق ألياف الأكتين الإجهاد و حيثياته ساركوميروجينيسيس. بعد أسبوع واحد من زراعة، تظهر معظم أرفك مظهر على نطاق واسع مع سترييشن عبر وضوح قابلة للاكتشاف. هذه العملية حساسة لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا، كما يخفف العلاج مع إيونوميسين نشر. هي علامات رئيسية في هذه العملية دي وإعادة ديفيرينتييشن β-الميوسين سلسلة ثقيلة (β-MHC) و oncostatin م (OSM) سويبروسين-1 (EFHD2). وأشارت الدراسات الأخيرة أن القلب re ودو ديفيرينتييشن التي تحدث في ظروف الثقافة يحاكي ميزات ينظر في فيفو أثناء إعادة عرض القلب. ولذلك، عزل وزراعة أرفك تلعب دوراً أساسيا في فهم بيولوجيا كارديوميوسيتيس.

Introduction

كارديوميوسيتيس الكبار في فيفو العمل سينسيتيوم كهربائية استناداً إلى خلية خلية الاتصالات بين ميوسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي تتأثر بالخلايا المجاورة مثل القلب الليفية والخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الملتهبة¹. من أجل دراسة قدرة كارديوميوسيتيس على التكيف مع تلك المنظمة داخل الخلايا لتغيير ظروف الحمل، كما رأينا خلال تضخم القلب، الذي هو خطوة أولية مما يؤدي إلى قصور القلب، والعزلة وزراعة الفئران البطين الكبار كارديوميوسيتيس (أرفك) هو اللازمة^2،،من³⁴. تاريخيا، كانت أولاً cardiomyocytes معزولة من الفرخ الجنينية قلوب^5،6. بضع سنوات في وقت لاحق، وصفت الأولى عزل cardiomyocytes الميؤوس من شفائهم المتباينة باستخدام الكالسيوم استنفاد⁷. بيد أن هذه كارديوميوسيتيس الكبار لم تكن الكالسيوم متسامح ولذلك لا يمكن استخدامها لفحوصات فنية. وأخيراً، تمكين بروتوكول جديد في عام 1976 بأول وتطور التحقيق في cardiomyocytes البطين الكبار تحت الظروف الفسيولوجية⁸. وكخطوة أولى، أنها معزولة cardiomyocytes الكبار تحت تركيزات منخفضة من الكالسيوم والكالسيوم بعد ذلك زيادة التركيزات الفسيولوجية في إجراء التدرجي. اليوم، معظم البروتوكولات لعزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار يعمل بهذا البروتوكول الكالسيوم واستخدام كولاجيناز الهضم الأنزيمي من اتصالات كثيفة خلية-خلية¹.

زراعة ناجحة، مطلوب مصل العجل الجنين (FCS) أو oncostatin م (OSM). أرفك أداء دي-وإعادة-differentiation مع تغييرات هيكلية واسعة النطاق بما في ذلك ساركومير التفكيك واصلاحهم^9،10،،من¹¹¹². هذه العملية هو مصحوبا بتعبير إعادة جينات نوع الجنين، مثل سلسلة ثقيلة β-الميوسين (β-MHC)، كما يعرف من تضخم، وتشكيل هياكل مثل بسيودوبوديا، وتسمى أيضا نشر^{4،11، 13}-وعلاوة على ذلك، سويبروسين-1 (EFHD2)، بروتين محددة حديثا، دوراً رئيسيا عملية التفريق بين إعادة زراعتها أرفك¹¹. نتيجة لذلك أرفك في ثقافة تحويل الخلايا على نطاق واسع، والأشكال التي تظهر تقلصات تلقائية بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع في الثقافة^2،،من⁴¹⁴.

الاكتشافات الأخيرة قد كشفت عن أن القلب re ودو differentiation كما يحدث في ظروف الثقافة يقلد الميزات ينظر في فيفو خلال القلب يعيد^10،15. إعادة عرض القلب عملية رئيسية خلال أمراض القلب¹⁶. كما لا تزال أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في المجتمعات الصناعية، من المهم فهم أفضل لبيولوجيا cardiomyocytes الكبار (الذين؛ عام 2015). عزل وزراعة أرفك يمكن أن تساعد على وضع استراتيجيات جديدة وأدوية لعلاج أمراض القلب. ويرد مع هذه المخطوطة، بروتوكولا لعزل وزراعة أرفك. وعلاوة على ذلك، سلط الضوء على بعض الأجزاء الهامة من هذا الأسلوب في جزء المناقشة.

Protocol

ويجري التحقيق وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها "لنا المعهد الوطني للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). وبصفة عامة، ويستار الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 4 أشهر، ومع متوسط وزن 250-350 جرام وتستخدم لهذا البروتوكول. قلب فأر واحد غير كافية من أجل 20 ثقافة الأطباق (1 مل كل طبق؛ والقطر الداخلي: 35 ملم) مع بكثافة خلية تقريبي 1.5 × 10 ⁴ خلايا/1000 مم ²-

1. إعداد الوسائط والمواد الكاشفة

1. الكرياتين-كارنيتيني-توراين المتوسطة (المتوسطة CCT)
   ملاحظة: CCT المتوسطة وسيلة معقدة تستند إلى المتوسطة 199 بالإضافة إلى الكرياتين والكارنيتين وتوراين.
   1. ل 1 إعداد متوسطة 199: إضافة 3.6 غ حبيس ومزيج ح 1. ثم قم بإضافة ملغ 655.5 الكرياتين (5 ملم)، 395.4 ملغ كارنيتيني (2 مم) و 625.5 ملغ توراين (5 مم). كارنيتيني وتوراين تغيير درجة الحموضة إلى < 7. كي تمنع نمو أي تلويث الخلايا، مثل خلايا بطانية أو الليفية، إضافة 10 ميكرون السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي إلى المتوسط. ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم (2 مم) إلى تصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. تخزين متوسطة CCT في 4 ° C.
2. المتوسطة بأول
   1. لأول ل متوسطة الحجم، تذوب ز 6.43 كلوريد الصوديوم (110 مم) مع ز 0.19 بوكل (2.5 مم)، 0.16 ز خ ₂ ص ₄ (1.2 مم)، 0.3 ز مجسو ₄ 7 ح ₂ س (1.2 مم)، ز 5.96 حبيس (25 مم)، و 1.98 غ د (+ )-مونوهيدرات (10 ملم) من الجلوكوز في أكوا العقيمة. ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم (2 م) لتصفية 7.4 وعقيمة المتوسط. المتوسطة بأول متجر في 4 ° C.
3. كلوريد الكالسيوم (كاكل ₂)
   1. إعداد حل 100 مم كاكل ₂ (50 مل) وإعداد مختبرين تحتوي على 500 ميليلتر كاكل ₂. تجميد مختبرين في-20 درجة مئوية.
4. إعداد متوسطة الثقافة
   1. تحضير ثلاث وسائل الثقافة الخلية: قبل التصفيحات المتوسطة والمتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل. استخدام CCT المتوسطة كالأساس لجميع وسائل الإعلام الثلاثة (الجدول 1). حساب CCT المتوسطة مع 1 مل كل طبق الثقافة. لذلك، إعداد 20 مل CCT المتوسطة 20 ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 35 ملم)-
   2. خلية ثقافة لوحات: معطف كل لوحة الثقافة الخلية (القطر الداخلي: 35 ملم) مع 1 مل قبل التصفيحات المتوسطة. تخزين لوحات المغلفة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو على الأقل 2 ح قبل استخدام.

2. عزل Cardiomyocytes الكبار

1. نظام التروية "إعداد لانجيندورف"
   1. الحرارة المتوسطة والطلاء والمتوسطة الغسيل إلى 37 درجة مئوية. رفع التجميد عن أنبوب 500 ميليلتر كاكل ₂ وتزن 25 ملغ كولاجيناز.
   2. طرد نظام التروية لانجيندورف مع أكوا العقيمة، بعد ذلك اسمحوا المتوسطة بأول تعميم نظام الحد الأدنى 5
   3. تعبئة نظام التروية لانجيندورف مع 80 مل المتوسطة بأول دون أي الهواء فقاعات والغاز المتوسطة مع الأكسجين 95%.
   4. إعداد أنبوب (50 مل) مع 40 مل بأول متوسط والحرارة عليه إلى 37 درجة مئوية، والغاز أنه مع الأكسجين 95%.
   5. إعداد مؤشر ترابط حوالي 25 سم في الطول لربط قلب إزالتها إلى القنية.
   6. ديجريسى شفرة حلاقة مع الكحول (70 في المائة من حيث الحجم)، وربط ذلك بالمروحية. المشبك قرص بلاستيك إلى المروحية.
2. استخراج القلب
   1. تخدير ذكور جرذان ويستار مع isoflurane 4% إلى 5% والتضحية به مع التفكك عنق الرحم. فتح البطن خلف قوس الساحلي مع قص البطن، ومع نفس زوج من مقص، قطع طريق الحاجز لفتح تجويف الصدر.
   إزالة
   2. القلب، جنبا إلى جنب مع الرئة والغدة الصعترية، بالقطع أعلاه الغدة الصعترية الجمجمة عاليا في تجويف الصدر. نقل هذه المواد إلى المحلول الملحي المثلج فورا.
   3. إزالة الرئة والغدة الصعترية من القلب مع مقص تشريح (كبير) والتي فيكساتينج المواد مع الملقط كبسولة، نقل الأخير إلى حل مالحة جديد.
3. عزلة
   1. إزالة الأنسجة الزائدة، مثل مخلفات الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والدهون والنسيج الضام من القلب باستخدام الملقط الكبسولة ومقص تشريح (كبيرة أو صغيرة). كشف الشريان الاورطي وقطع عليه مع مقص تشريح (كبيرة أو صغيرة) بين المهندس الأول والثاني التطور
   2. بدء نازف نظام التروية لانجيندورف. مكان القلب في قنية نظام التروية لانجيندورف ويحملق أولاً مع المشبك التماسيح ولاحقا مع الصفحات المعدة. شطف القلب حتى أنها خالية من الدم.
   3. حل 25 ملغ كولاجيناز في 5-6 مل المتوسطة بأول الحارة وإضافة 12.5 ميليلتر كاكل ₂ (30 ميكرومتر).
   إغلاق الدورة الدموية عن طريق تحريك قمع زجاج، الذي يرتبط بنظام التروية لانجيندورف، عبر قلب نازف
   4. وإضافة كولاجيناز حل لنظام التروية. تبدأ نضح لمدة 25 دقيقة سرعة قطره قطره 1 في الثانية الواحدة.
      ملاحظة: أثناء التروية، القلب سوف تضخم والحصول على مظهر شمعي.
   5. توقف التروية بعد 25 دقيقة وإزالة القلب من نظام التروية لانجيندورف. إزالة الشريان الاورطي، الاذينين، والنسيج الضام من القلب وفتح البطينين الأيمن والأيسر.
   6. يقطع القلب مرتين بزاوية مقدارها 90 درجة (خفض العرض: 0.7 مم؛ والسرعة: 0.15 سم/ثانية). كرر هذه العملية يدوياً مع المشارط هما 10 s كل جانب.
   7. نقل 12 مل الوسط التروية في أنبوب جديد (50 مل). صب ملاط الخلية في هذه الخلايا المتوسطة وملخص لآخر خمس دقائق في 37 درجة جيم ميكس الحل كل دقيقة-
   8. تصفية الحل مع قلب هضمها من خلال شبكة نايلون (200 ميكرومتر) في أنبوب جديد (50 مل)-
   9. الطرد المركزي الحل الذي تم تصفيته في 29 س ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل المتوسطة بأول الحارة بما في ذلك 12.5 ميليلتر كاكل ₂ (250 ميكرومتر) إلى بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه من خلال حركات الهز السلس. الطرد المركزي مرة أخرى في 29 س ز 2 دقيقة تجاهل المادة طافية وإضافة 6 مل الحارة المتوسطة بأول محل 25 ميليلتر كاكل ₂ (500 ميكرومتر). حل بيليه الخلية من خلال حركات الهز لطيف وإضافة 12 مل الحارة بأول المتوسط بما في ذلك 120 ميليلتر كاكل ₂ (1 مم). أجهزة الطرد المركزي لمرة ثالثة في 16 x ز لمدة 1 دقيقة. ومرة أخرى، إزالة المادة طافية.
   10. ميكس بيليه الخلية مع متوسط حرارة قبل الطلاء.
   11. إزالة الطلاء قبل المتوسطة من لوحات الثقافة. نقل 1 مل تصفيح المتوسطة، بما في ذلك كارديوميوسيتيس معزولة، لكل لوحة الثقافة. احتضان الطازجة cardiomyocytes معزولة في 37 درجة مئوية حاء 1
   إزالة
   12. المتوسطة الطلاء من لوحات الثقافة. أضف 1 مل غسل المتوسطة لكل لوحة الثقافة وتخزين لوحات عند 37 درجة مئوية إلى ستة أيام دون تغيير في المتوسط-
   13. للتحقيق في تأثير المواد الكيميائية المختلفة والعلاجات في أرفك، أولاً تحديث المتوسطة والطلاء بغسل المتوسطة وبعد ذلك إضافة مواد كيميائية مختلفة-
       ملاحظة: التقييم بالفحص المجهري الخفيفة: مع كل إعداد الخلية، ينبغي رصد cardiomyocytes 150 إلى 300 يوميا بالفحص المجهري الخفيفة. تقسيم cardiomyocytes جميع الأصوات التي تم فرزها في مجموعات حسب مظهرها (مثلاً، " على شكل قضبان "، " جولة أسفل "، " نشر "، و " مظهر غير عادي "). الفئة " نشر " يشمل جميع كارديوميوسيتيس مع هياكل مثل بسيودوبوديا. " مظهر غير عادي " ويشمل جميع أرفك مع سطح غير نظامية وغشاء الخلية لا يمكن كشفها سليمة.

3. مثال تجارب

1. Fluorescence/الفلورة تلوين للكبار كارديوميوسيتيس
   1. تحليل التحويلات البنيوية والهيكلية من أرفك أثناء زراعة بالليزر [كنفوكل] مجهرية. استخدام فالويدين-تريتك للتحقيق فيها الهياكل واكتين في " على شكل قضبان "، " جولة أسفل "، و " نشر " أرفك. القيام بتلوين وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s. ويرد مثال لتلطيخ فالويدين-تريتك في إشارة نبيرت et al. ¹¹-مع تلطيخ الأسفار/الفلورة، الاختلافات في دي-وإعادة-differentiation جهاز الهوس في cardiomyocytes الكبار المزروعة بين العلاجات التجريبية (مثلاً، مع Swiprosin-1، إيونوميسين) يمكن أن يحقق.
2. (قرة-PCR) الكمية في الوقت الحقيقي RT-PCR
   1. أداء بكر قرة للتحقيق في التغيرات في التعبير مرناً من جينات مختلفة (مثل OSM، سويبروسين-1، β-MHC) أثناء زراعة أرفك. لحجم عينة كاف، استخدام أكبر ثقافة الأطباق (القطر الداخلي: 60 ملم) بحجم 2 مل. أرفك من خمسة ثقافة الأطباق غلة عينة واحدة. إجراء عزل مرناً والتحول من كدنا وفقا للشركة المصنعة ' بروتوكول s-
3. تقنيات إيمونوبلوت
   1. "أداء اسطوانات الغربية يقوم" التحقيق في تغيرات في التعبير البروتين (مثلاً، سويبروسين-1) أثناء زراعة أرفك. استخدام الثقافة صحن واحد (1 مل) كل عينة.

النتائج

Cardiomyocytes الكبار في الثقافة: ويبين الشكل 1 نظرة عامة cardiomyocytes الكبار طازجة معزولة ح 2 بعد الغسيل الأخير. وكان حوالي 75% من جميع كارديوميوسيتيس التشكل على شكل قضيب. وأظهرت نسبة 25 في المائة المتبقية مظهر غير عادية مع مورفولوجيا جولة وغشاء الخلية لا يمكن ...

Discussion

يتأثر سلوك cardiomyocytes الكبار في فيفو بكثير من التفاعلات مع خلايا أخرى (مثلاً، الخلايا العصبية، خلايا بطانية، والخلايا الليفية، الخلايا الملتهبة) وسينسيتيوم الكهربائية التي تشكل¹. ولذلك يتطلب دراسة التكيف مع الإجهاد من كارديوميوسيتيس الكبار حصرا بالعزلة وزراعة أرفك. ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177