Isolamento e cultivo de rato adulto Cardiomyocytes

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC). ARVC isolado pode ser usado para o cultivo de curto e longo prazo. O isolamento e cultivo da ARVC podem desempenhar um papel chave no desenvolvimento de novos esquemas de tratamento para doenças cardíacas.

Resumo

Em um coração intacto, células adjacentes influenciam cardiomyocytes adulto. Com o método de isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes, uma investigação precisa do comportamento dessas células sob ambientes e tratamentos específicos é possível. Este manuscrito apresenta um protocolo para a bem sucedido isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC).

O rato é sacrificado por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Então, é extraído o coração e a aorta é descoberta. Posteriormente, a perfusão do sistema de perfusão de Langendorff com depleção de cálcio e tratamento de colagenase é executada. Depois, tecido ventricular Obtém picado recirculado e filtrado, seguido por três etapas de centrifugação com adição gradual de CaCl₂ até que seja alcançada a concentração de cálcio fisiológica. ARVC são banhados em pratos de cultura de células. Após atualizar o meio de cultura celular, ARVC pode ser cultivada por até seis dias sem alterar o meio de cultura contendo soro. Isolamento da ARVC é um processo sensível de cálcio. Pequenas alterações da concentração de cálcio intracelular causar uma diminuição na qualidade e viabilidade das células isoladas.

Recentemente isolado ARVC são em forma de haste. Nos primeiros dias de cultivo, eles perdem os bacilares morfologia e forma pseudópodos estruturas (espalhar). Durante esta formação morfológica ARVC inicialmente degradar seus elementos contráteis, seguidos por uma reforma através de fibras de estresse de actina e sarcomerogenesis de novo . Após uma semana de cultivo, a maioria ARVC mostrar uma aparência generalizada com uma faixa transversal claramente detectável. Este processo é sensível à concentração de cálcio intracelular, como tratamento com ionomycin atenua a propagação. Marcadores chaves neste processo de - e re - differentiation são cadeia pesada de miosina-β (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2). Estudos recentes têm sugerido que cardíaca re e de differentiation ocorrendo em condições de cultura imita características visto na vivo durante a remodelação cardíaca. Portanto, isolamento e cultivo da ARVC desempenham um papel chave na compreensão da biologia dos cardiomyocytes.

Introdução

Cardiomyocytes adulto na vivo funciona como um sincício elétrico baseado em contatos de celular entre myocytes. Além disso, eles são influenciados por células adjacentes como cardíacos fibroblastos, células endoteliais, neurônios e células inflamatórias¹. Para estudar a capacidade dos cardiomyocytes para adaptar sua organização intracelular para alterou as condições de carga, como visto durante a hipertrofia cardíaca, que é um passo inicial levando a insuficiência cardíaca, o isolamento e cultivo de adulto rato ventricular cardiomyocytes (ARVC) é necessário^2,3,4. Historicamente, cardiomyocytes primeiro foram isoladas de garota embrionárias corações^5,6. Alguns anos mais tarde, o primeiro isolamento de cardiomyocytes terminalmente diferenciada foi descrito por meio de depleção de cálcio⁷. No entanto, esses adultos cardiomyocytes não eram tolerantes de cálcio e, portanto, não podiam ser utilizados para os ensaios funcionais. Finalmente, em 1976, um novo protocolo habilitado Powell e torcer para investigar adulto cardiomyocytes ventricular sob condições fisiológicas⁸. Como primeiro passo, isolaram cardiomyocytes adulto sob concentrações baixas de cálcio e cálcio posteriormente aumentado para concentrações fisiológicas em um processo gradual. Hoje, a maioria dos protocolos para isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes trabalharcom com este protocolo de cálcio e usam colagenase para a digestão enzimática da célula-célula densa contatos¹.

Para um cultivo bem sucedido, é necessário soro fetal bezerro (FCS) ou oncostatin M (OSM). ARVC executar um de - e re - differentiation extensas alterações estruturais, incluindo o sarcômero desmontagem e reforma^9,10,11,12. Este processo é acompanhado por uma re-expressão de genes fetais-tipo, como β-miosina de cadeia pesada (MHC-β), como conhecido de hipertrofia e uma formação de pseudópodos-como estruturas, também chamado de espalhamento^{4,11, 13}. Além disso, swiprosin-1 (EFHD2), uma proteína recém identificada, desempenha um papel importante no processo de re-diferenciação de cultivada ARVC¹¹. Como resultado, ARVC na cultura transformar-se em células generalizadas, polimórficas, que mostram espontaneamente contrações após duas a três semanas em cultura^2,4,14.

Descobertas recentes têm revelado que cardíaca differentiation re e de como ocorre em condições de cultura imita possui visto na vivo durante cardíaca remodelação^10,15. Remodelação cardíaca é um processo chave durante doenças cardíacas¹⁶. Como doenças cardíacas ainda são a principal causa de morte nas sociedades industrializadas, uma melhor compreensão da biologia da cardiomyocytes adulto é importante (quem; 2015). Isolamento e cultivo da ARVC podem ajudar a desenvolver novas estratégias e medicamentos para o tratamento de doenças cardíacas. Com este manuscrito, é fornecido um protocolo para o isolamento e cultivo da ARVC. Além disso, algumas partes críticas deste método são destacadas na seção de discussão.

Protocolo

a investigação é conduzida de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório publicado por nos National Institute of Health (NIH publicação n º 85-23, revista em 1996). Em geral, ratos wistar machos com 3 a 4 meses de idade e com um peso médio de 250-350 g são utilizados para este protocolo. Um coração de rato é suficiente para 20 pratos de cultura (1 mL por prato; diâmetro interno: 35 mm) com uma densidade celular aproximada de 1,5 x 10 ⁴ células/1000 mm ².

1. preparação de meios e reagentes

1. meio de creatina-carnitina-taurina (meio CCT)
   Nota: CCT medium é um meio complexo, baseado no meio 199 com a adição de creatina, carnitina e taurina.
   1. Preparar 1 L de meio 199: Adicione 3,6 g Hepes e misture por 1h. Em seguida, adicione creatina 655,5 mg (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina alteram o pH a < 7. A fim de inibir o crescimento de células, por exemplo, células endoteliais ou fibroblastos contaminante, adicione 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside ao meio. Ajuste o pH com NaOH (2 mM) ao filtro de 7,4 e estéril o meio. Armazenar o meio CCT em 4 ° C.
2. Médio de Powell
   1. por meio de 1 L Powell, dissolver 6,43 g NaCl (110 mM) com 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH ₂ PO ₄ mM (1,2), 0,3 g de MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Monohydrate da glicose (10 mM) no Aqua estéril. Ajuste o pH com NaOH (M 2) 7.4 e estéril filtro o meio. Médio de Powell loja a 4 ° C.
3. De cloreto de cálcio (CaCl ₂)
   1. preparar uma solução de 100 mM CaCl ₂ (50 mL) e preparar alíquotas contendo 500 µ l de CaCl ₂. Congelar as alíquotas a -20 ° C.
4. Preparação do meio de cultura
   1. preparar três meios de cultura celular: Pré-chapeamento médio, chapeamento médio e médio de lavagem. Use meio de CCT como a base para todas as três mídias (tabela 1). Calcule a média CCT com 1ml por prato de cultura. Portanto, prepare-se 20 mL de meio de CCT para 20 pratos de cultura (diâmetro interno: 35mm).
   2. Célula cultura placas: revestir cada placa de cultura de células (diâmetro interno: 35mm) com 1 mL Pré-chapeamento médio. Armazenar as placas revestidas a 37 ° C durante a noite ou pelo menos 2 h antes de usar.

2. Isolamento de adulto Cardiomyocytes

1. sistema de preparação de Langendorff perfusão
   1. calor médio de chapeamento e lavagem médio a 37 ° C. um tubo de 500 µ l de CaCl ₂ de descongelar e pesar em 25 mg de colagenase.
   2. Irrigue o sistema de perfusão de Langendorff com aqua estéril, depois deixe médio Powell circular o sistema 5 min.
   3. Encher o sistema de perfusão de Langendorff com 80 mL de meio de Powell, sem qualquer ar bolhas e gás médio com 95% de oxigênio.
   4. Preparar um tubo (50 mL) com 40 mL de meio de Powell, aquecê-lo a 37 ° C e gás-com 95% de oxigênio.
   5. Preparar um segmento de cerca de 25 cm de comprimento para prender o coração removido para a cânula.
   6. Desengordurar uma lâmina de barbear com álcool (70% em volume) e aperte-o para o helicóptero. Fixar um disco de plástico no helicóptero.
2. Extração de coração
   1. anestesiar um rato wistar machos com 4 a 5% de isoflurano e sacrificá-lo com deslocamento cervical. Abrir o abdômen para trás o arco costal com uma tesoura abdominal e, com a mesma tesoura, corte através do diafragma para abrir a cavidade torácica.
   2. Remover o coração, junto com o pulmão e o timo, cortando acima o Timo altamente craniano na cavidade torácica. Transferir o material para solução salina gelada imediatamente.
   3. Remover o pulmão e Timo do coração com uma tesoura de dissecação (grande) e pela fixação do material com cápsula fórceps, transferir este último para uma nova solução salina.
3. Isolamento
   1. remover o excesso de tecido, como resíduos de timo, traqueia, gordura e tecido conjuntivo do coração usando fórceps da cápsula e uma tesoura de dissecação (grande ou pequena). Descubra a aorta e é cortar com uma tesoura de dissecação (grande ou pequena) entre o primeiro e segundo branquial arq
   2. Começar a pingar do sistema de perfusão de Langendorff. Coloque o coração sobre a cânula do sistema de perfusão de Langendorff e fixá-lo primeiro com uma pinça de crocodilo e mais tarde com o segmento preparado. Enxágue o coração até que ele está livre do sangue.
   3. Dissolver 25 mg colagenase em 5-6 mL de meio de Powell quente e adicionar 12,5 µ l CaCl ₂ (30 µM).
   4. Fechar a circulação movendo um funil de vidro, que é conectado com o sistema de perfusão de Langendorff, sobre o coração de gotejamento e adicionar a colagenase resolvido para o sistema de perfusão. Iniciar a perfusão para 25 min com uma velocidade de queda de 1 gota por segundo.
      Nota: Durante a perfusão, o coração vai inchar e obter uma aparência cerosa.
   5. Parar a perfusão após 25 min e retirar o coração do sistema de perfusão de Langendorff. Remover a aorta, átrios e tecido conjuntivo do coração e abrir os ventrículos direito e esquerdos.
   6. Corta o coração duas vezes em um ângulo de 90° (largura de corte: 0,7 mm; velocidade: 0,15 cm/s). Repita este processo manualmente com dois bisturis para 10 s cada lado.
   7. Transferir 12 mL do meio de perfusão para um novo tubo (50 mL). Despeje o chorume de célula este médio e digerir células por mais cinco minutos a 37 ° C. Mix a solução cada minuto.
   8. Filtrar a solução com o coração digerido através de uma malha de nylon (200 µm) para um tubo novo (50 mL).
   9. Centrifugar a solução filtrada em 29 x g, durante 3 min. descartar o sobrenadante e adicionar 6 mL quente Powell de meio incluindo 12,5 µ l CaCl ₂ (250 µM) para o centrifugado. Resuspenda o pellet através de movimentos de agitação suaves. Centrifugar novamente a 29 x g por 2 min. descartar o sobrenadante e adicionar 6 mL quente médio Powell substituído com 25 µ l CaCl ₂ (500 µM). Dissolver o centrifugado através de movimentos suaves de agitação e adicione 12 mL quente Powell médio incluindo 120 µ l CaCl ₂ (1 mM). Centrífuga para uma terceira vez em 16 x g por 1 min. Novamente, remover o sobrenadante.
   10. Misturar o centrifugado com o médio pré-aquecido chapeamento.
   11. Remover Pré-chapeamento médio de placas de cultura. Transferi 1 mL do chapeamento médio, incluindo o cardiomyocytes isolada, para cada placa de cultura. Incube fresco cardiomyocytes isolado a 37 ° C por 1 h.
   12. Remover o meio de chapeamento de placas de cultura. Adicione 1 mL de lavagem média para cada placa de cultura e armazenar as placas a 37 ° C até seis dias sem alterar o meio.
   13. Para investigar a influência de diferentes produtos químicos e tratamentos na ARVC, primeiro atualizar o chapeamento médio médio de lavagem e posteriormente adicionando produtos químicos diferentes.
       Nota: Avaliação com microscopia de luz: com preparação cada célula, 150 a 300 cardiomyocytes deve ser monitorados por dia por microscopia de luz. Subdividir a cardiomyocytes todos contados em grupos de acordo com a sua aparência (por exemplo, " em forma de haste ", " redonda para baixo ", " espalhando ", e " aparência incomum "). A categoria " espalhando " inclui todos cardiomyocytes com pseudópodos-como estruturas. " Aparência incomum " inclui todos ARVC com uma superfície irregular e não detectável intacta da membrana celular.

3. Exemplo de Experimentos

1. fluorescência/imunofluorescência coloração dos adultos cardiomyocytes
   1. análise morfológicas e estruturais conversões da ARVC durante o cultivo por microscopia confocal do laser. Use a faloidina-TRITC para investigar estruturas F-Actina em " em forma de haste ", " redonda para baixo ", e " espalhando " ARVC. Realizar a coloração de acordo com o fabricante ' protocolo s. Um exemplo para a faloidina-TRITC coloração é dada em referência Nippert et al ¹¹. com coloração de fluorescência/imunofluorescência, diferenças no de - e re - differentiation do aparato contrátil em cardiomyocytes adultos cultivadas entre tratamentos experimentais (por exemplo, com Swiprosin-1, ionomycin) pode ser investigado.
2. RT-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
   1. executar qRT-PCR para investigar alterações na expressão do mRNA de genes diferentes (por exemplo, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante o cultivo da ARVC. Para o tamanho de amostra suficiente, use pratos de cultura maiores (diâmetro interno: 60 mm) com volume de 2 mL. ARVC de cinco pratos de cultura produz uma amostra. Realizar isolamento do mRNA e a transformação do cDNA de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
3. Immunoblot técnicas
   1. realizar borrões ocidentais para investigar alterações na expressão de proteínas (por exemplo, para Swiprosin-1) durante o cultivo da ARVC. Use um prato de cultura (1 mL) por exemplo.

Resultados

Adulto cardiomyocytes na cultura: A Figura 1 mostra uma visão geral dos cardiomyocytes adultos recentemente isolado 2 h após a última lavagem. Aproximadamente 75% de todos os cardiomyocytes tinha uma morfologia de forma cilíndrica. Os restantes 25% mostrou uma aparência incomum com uma morfologia redonda e não detectável membrana celular intacta (Figura 1). No final do cultivo (dia 6), até 15% de todos os...

Discussão

O comportamento do adulto cardiomyocytes na vivo é influenciado por muitas interações com outras células (por exemplo, os neurônios, células endoteliais, fibroblastos, células inflamatórias) e o sincício elétrico que formam¹. Portanto, estudar a adaptação de estresse de adultos cardiomyocytes exclusivamente requer o isolamento e cultivo da ARVC. Os principais efeitos de isolar e cultivar ARVC são: 1) desconectá-los de matriz extracelular e contatos do celular; 2) de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177