Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Abstract

In un cuore intatto, celle adiacenti influenzano cardiomiociti adulti. Con il metodo di isolamento e coltura dei cardiomiociti adulti, è possibile una valutazione dettagliata del comportamento di queste cellule nell'ambito di trattamenti specifici e di ambienti. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'isolamento di successo e coltivazione dei cardiomyocytes ventricolari di ratto adulto (ARVC).

Il ratto è sacrificato dalla dislocazione cervicale sotto anestesia profonda. Quindi, viene estratto il cuore e l'aorta è scoperto. Successivamente, viene eseguita aspersione sul sistema di perfusione di Langendorff con deplezione di calcio e trattamento collagenasi. In seguito, tessuto ventricolare ottiene macinata, ricircolo e filtrata, seguita da tre fasi di centrifugazione con graduale aggiunta di CaCl₂ finché non viene raggiunta la concentrazione fisiologica di calcio. ARVC sono placcati su piastre di coltura delle cellule. Dopo l'aggiornamento il mezzo di coltura cellulare, ARVC può essere coltivata fino a sei giorni senza cambiare il mezzo di coltura contenente siero. Isolamento di ARVC è un processo delicato di calcio. Piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio causano una diminuzione della qualità e la vitalità delle cellule isolate.

Appena isolato ARVC sono a forma di asta. Entro i primi giorni di coltivazione perdono l'asta-a forma di forma e morfologia pseudopodi-come le strutture (diffusione). Durante questa formazione morfologica ARVC degradare inizialmente loro elementi contrattili, seguite da una riforma attraverso fibre di actina stress e de novo sarcomerogenesis. Dopo una settimana di coltivazione, la maggior parte ARVC mostrano un aspetto diffuso con una striatura trasversale chiaramente rilevabile. Questo processo è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio, come il trattamento con ionomicina attenua la diffusione. Catena pesante β-miosina (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2) sono indicatori chiavi in questo processo di de - e re - differentiation. Studi recenti hanno suggerito che cardiaco re e de differentiation che si verificano in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il ritocco cardiaco. Di conseguenza, isolamento e coltura di ARVC gioca un ruolo chiave nella comprensione della biologia dei cardiomiociti.

Introduzione

Cardiomiociti adulti in vivo funziona come un sincizio elettrico basato su contatti cellula-cellula fra miociti. Inoltre, sono influenzati da celle adiacenti come fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali, neuroni e cellule infiammatorie¹. Al fine di studiare la capacità dei cardiomiociti di adeguare la loro organizzazione intracellulare di alterate condizioni di carico, come si è visto durante l'ipertrofia cardiaca, che è un passo iniziale che porta a insufficienza cardiaca, l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC) sono necessario^2,3,4. Storicamente, cardiomiociti in primo luogo sono stati isolati da pulcino embrionali cuori^5,6. Pochi anni dopo, il primo isolamento di cardiomiociti terminalmente differenziati è stata descritta utilizzando calcio svuotamento⁷. Tuttavia, questi cardiomiociti adulti non erano calcio tollerante e non potevano essere usati per saggi funzionali. Infine, nel 1976 un nuovo protocollo abilitato Powell e Twist per indagare su cardiomiociti adulti ventricolari sotto condizioni fisiologiche⁸. Come primo passo, hanno isolato cardiomiociti adulti sotto le concentrazioni basse del calcio e calcio in seguito aumentato a concentrazioni fisiologiche in una procedura graduale. Oggi, maggior parte dei protocolli per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti lavoro con questo protocollo di calcio e utilizzare collagenasi per la digestione enzimatica della cellula-cellula densa contatti¹.

Per una coltivazione di successo, è necessario il siero fetale di vitello (FCS) o oncostatin M (OSM). ARVC eseguire un de - e re - differentiation con vasti cambiamenti strutturali tra cui sarcomero smontaggio e riforma^9,10,11,12. Questo processo è accompagnato da una ri-espressione dei geni di tipo fetale, come β-miosina catena pesante (β-MHC), come noto da ipertrofia e una formazione di pseudopodi-come le strutture, anche chiamato diffusione^{4,11, 13}. Inoltre, swiprosin-1 (EFHD2), una proteina di recente identificazione, svolge un ruolo importante nel processo di re-differenziazione di coltivato ARVC¹¹. Di conseguenza, ARVC nella cultura trasformare nelle cellule polimorfiche, diffuse, che spontaneamente mostrano contrazioni dopo due o tre settimane nella cultura^2,4,14.

Recenti scoperte hanno rivelato che cardiaco re e de differentiation come si verifica in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il rimodellamento cardiaco^10,15. Rimodellamento cardiaco è un processo chiave durante malattie cardiache¹⁶. Come le malattie cardiache sono ancora la principale causa di morte nelle società industrializzate, una migliore comprensione della biologia dei cardiomiociti adulti è importante (OMS; 2015). Isolamento e coltura di ARVC può aiutare a sviluppare nuove strategie e medicinali per il trattamento delle malattie cardiache. Con questo manoscritto, un protocollo per l'isolamento e la coltura di ARVC è fornito. Inoltre, alcune parti critiche di questo metodo sono evidenziate nella sezione discussione.

Protocollo

l'indagine è condotta secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato da la US National Institute of Health (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). In generale, ratti maschii di wistar invecchiati 3-4 mesi e con un peso medio di 250-350 g vengono utilizzati per questo protocollo. Un cuore di ratto è sufficiente per 20 piastre di coltura (1 mL per ogni piatto; diametro interno: 35 mm) con una densità approssimativa delle cellule di 1.5 x 10 ⁴ cellule/1000 millimetri ².

1. preparazione dei terreni e reagenti

1. Creatina-Carnitina-taurina medio (medio CCT)
   Nota: CCT medium è un mezzo complesso basato su medium 199 con l'aggiunta di creatina, carnitina e taurina.
   1. Preparare 1 L di medium 199: aggiungere 3,6 g Hepes e mescolare per 1 h. Quindi aggiungere 655,5 mg creatina (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina cambiare pH a < 7. Al fine di inibire la crescita di cellule contaminanti, ad es. cellule endoteliali o fibroblasti, aggiungere 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside al mezzo. Regolare il pH con NaOH (2 mM) per filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il mezzo CCT a 4 ° C.
2. Medio di Powell
   1. per 1 medio L Powell, sciogliere 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH ₂ PO ₄ (1,2 mM), 0,3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Glucosio monoidrato (10 mM) in Aqua sterile. Regolare il pH con NaOH (2 M) al filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il medium Powell a 4 ° C.
3. Cloruro di calcio (CaCl ₂)
   1. preparare una soluzione di 100 mM CaCl ₂ (50 mL) e preparare aliquote contenente 500 µ l CaCl ₂. Congelare aliquote a -20 ° C.
4. Preparazione del terreno di coltura
   1. preparare tre cellule di coltura: pre-placcatura medie, medie di placcatura e lavaggio medio. Utilizzo medio CCT come base per tutti i tre Medium (tabella 1). Calcolare medie CCT con 1 mL / piastra di coltura. Quindi, preparare 20 mL di terreno di CCT per 20 piastre di coltura (diametro interno: 35 mm).
   2. Cella cultura piastre: cappotto ogni piastra di coltura delle cellule (diametro interno: 35 mm) con 1 mL pre-placcatura medio. Conservare le piastre a 37 ° C durante la notte o per almeno 2 h prima dell'uso.

2. Isolamento di cardiomiociti adulti

1. sistema di perfusione di preparazione di Langendorff
   1. di calore medio di placcatura e lavaggio medio a 37 ° C. scongelare un tubo di 500 µ l CaCl ₂ e pesare 25 mg di collagenasi.
   2. A filo il sistema di perfusione di Langendorff con aqua sterile, lasciate in seguito medio di Powell circolare del sistema per 5 min.
   3. Riempire il sistema di perfusione di Langendorff con 80 mL di mezzo di Powell senza qualsiasi aria bolle e gas il mezzo con 95% di ossigeno.
   4. Preparare una provetta (50 mL) con 40 mL di mezzo di Powell, riscaldare fino a 37 ° C e gas con 95% di ossigeno.
   5. Preparare un filo di circa 25 cm di lunghezza per il collegamento di cuore rimosso alla cannula.
   6. Sgrassare una lama di rasoio con alcool (70% in volume) e fissarlo all'elicottero. Fissare un disco di plastica nel chopper.
2. Estrazione del cuore
   1. anestetizzare un ratto wistar maschio con 4-5% isoflurane e sacrificalo con dislocazione cervicale. Aprire l'addome dietro l'arco costale con un taglio addominale e, con lo stesso paio di forbici, tagliare attraverso il diaframma per aprire la cassa toracica.
   2. Rimuovere il cuore, insieme con il polmone e timo, tagliando sopra il timo altamente cranico nella cavità toracica. Trasferire il materiale a soluzione salina ghiacciata immediatamente.
   3. Rimuovere il polmone e timo dal cuore con una forbice per dissezione (grande) e di fissazione del materiale con il forcipe capsula, trasferire a quest'ultimo a una nuova soluzione salina.
3. Isolamento
   1. rimuovere il tessuto in eccesso, come residui di timo, della trachea, grasso e tessuto connettivo dal cuore utilizzando capsule pinze e forbici per dissezione (grandi o piccole). Scoprire l'aorta e si divide con una forbice per dissezione (grande o piccola) tra il primo e in secondo luogo branchial Arch.
   2. Avviare il gocciolamento dell'apparato di aspersione di Langendorff. Posto nel cuore della cannula dell'apparato di aspersione di Langendorff e fissare lo sguardo in primo luogo con un morsetto a coccodrillo e successivamente con il thread pronto. Sciacquare il cuore fino a quando non è priva di sangue.
   3. Sciogliere 25 mg collagenasi in 5-6 mL di liquido caldo di Powell e aggiungere 12,5 µ l CaCl ₂ (30 µM).
   4. Chiudere circolazione spostando un imbuto di vetro, che è collegato con il sistema di perfusione di Langendorff, sopra il cuore di gocciolamento e aggiungere la collagenosi risolto per il sistema di perfusione. Iniziare la perfusione per 25 min con una velocità di discesa di 1 goccia al secondo.
      Nota: Durante l'aspersione, il cuore si gonfiano e ottenere un aspetto ceroso.
   5. Interrompere la perfusione dopo 25 min e togliere il cuore del sistema di aspersione di Langendorff. Rimuovere l'aorta, atrii e tessuto connettivo dal cuore e aprire i ventricoli destro e sinistro.
   6. Tritare il cuore due volte ad un angolo di 90° (larghezza di taglio: mm 0,7; velocità: 0,15 cm/s). Ripetere questo processo manualmente con due bisturi per 10 s ogni lato.
   7. Trasferire 12 mL di terreno di aspersione in una nuova provetta (50 mL). Versare i residui delle cellule in queste cellule medie e digest per altri cinque minuti a 37 ° C. Mix la soluzione ogni minuto.
   8. Filtrare la soluzione con il cuore digerito attraverso una rete di nylon (200 µm) in una nuova provetta (50ml).
   9. Centrifugare la soluzione filtrata a 29 x g per 3 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL di terreno caldo Powell cui 12,5 µ l CaCl ₂ (250 µM) per il pellet cellulare. Risospendere il pellet attraverso movimenti di agitazione. Centrifugare nuovamente a 29 x g per 2 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL caldo medio Powell sostituito con 25 µ l CaCl ₂ (500 µM). Sciogliere il pellet cellulare attraverso delicati movimenti di agitazione e aggiungere 12 mL caldo Powell media tra cui 120 µ l CaCl ₂ (1 mM). Centrifuga per la terza volta a 16 x g per 1 min. Ancora una volta, rimuovere il sopranatante.
   10. Mescolare il pellet cellulare con il mezzo di placcatura preriscaldata.
   11. Rimuovere il mezzo di pre-placcatura da piastre di coltura. Trasferire 1 mL di mezzo, compresi i cardiomiociti isolati, per ogni piastra di coltura di placcatura. Incubare i cardiomiociti isolati freschi a 37 ° C per 1 h.
   12. Togliere la soluzione di placcatura da piastre di coltura. Aggiungere 1 mL di media per ogni piastra di coltura di lavaggio e memorizzare le piastre a 37 ° C fino a sei giorni senza cambiare mezzo.
   13. Per indagare l'influenza di diverse sostanze chimiche e trattamenti su ARVC, prima di aggiornare placcatura media media di lavaggio e successivamente aggiungendo diverse sostanze chimiche.
       Nota: Valutazione con microscopia chiara: con ogni preparazione delle cellule, devono essere monitorati cardiomyocytes 150 a 300 al giorno da microscopia chiara. Suddividere tutti contati cardiomiociti in gruppi secondo il loro aspetto (ad es., " asta-a forma di ", " arrotondare per difetto ", " diffusione ", e " apparenza insolita "). La categoria " diffusione " include tutti i cardiomiociti con pseudopodi-come le strutture. " Apparenza insolita " comprende tutti i ARVC con una superficie irregolare e non rilevabile membrana cellulare intatta.

3. Esempio Esperimenti

1. fluorescenza/immunofluorescenza di cardiomiociti adulti
   1. analizza le conversioni morfologiche e strutturale di ARVC durante la coltivazione da microscopia laser confocale. Utilizzare falloidina-TRITC per indagare strutture di F-actina in " asta-a forma di ", " arrotondare per difetto ", e " diffusione " ARVC. Eseguire la colorazione secondo il produttore ' protocollo s. Un esempio per la colorazione falloidina-TRITC è dato in riferimento Nippert et al. ¹¹. con fluorescenza/immunofluorescenza, differenze in differentiation de e re dell'apparato contrattile nei cardiomyocytes coltivati adulto tra trattamenti sperimentali (ad es., con Swiprosin-1, Ionomicina) possono essere investigate.
2. Real-Time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)
   1. eseguire qRT-PCR per studiare i cambiamenti nell'espressione di mRNA di geni diversi (ad es., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante la coltivazione di ARVC. Per dimensione del campione sufficiente, utilizzare piastre di coltura più grandi (diametro interno: 60 mm) con 2 mL di volume. ARVC di cinque piatti di cultura produce un campione. Eseguire l'isolamento di mRNA e la trasformazione del cDNA secondo il produttore ' protocollo s.
3. Tecniche Immunoblot
   1. eseguire Western Blots per studiare i cambiamenti nell'espressione della proteina (ad es., per Swiprosin-1) durante la coltivazione di ARVC. Utilizzare una piastra di coltura (1 mL) per esempio.

Risultati

Adulti cardiomiociti in coltura: La figura 1 Mostra una panoramica di recente isolate cardiomiociti adulti 2 h dopo l'ultimo lavaggio. Circa il 75% di tutti i cardiomiociti aveva una morfologia a forma di bastoncello. Il restante 25% ha mostrato un aspetto insolito con una morfologia rotonda e non rilevabile membrana intatta di cella (Figura 1). Alla fine della coltivazione (giorno 6), fino al 15% di tutti i card...

Discussione

Il comportamento di cardiomiociti adulti in vivo è influenzato da molte interazioni con altre cellule (ad es., neuroni, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule infiammatorie) e il sincizio elettrico che formano¹. Pertanto, studiare esclusivamente adattamento allo stress dei cardiomiociti adulti richiede l'isolamento e la coltura di ARVC. I principali effetti di isolare e coltivare ARVC sono: 1) disconnetterli dalla matrice extracellulare e contatti cellula-cellula; 2) eseguire...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177