Изоляция и выращивания взрослых крыс кардиомиоцитов

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC). Изолированные ARVC может использоваться для краткосрочной и долгосрочной перспективе выращивания. Изоляции и выращивания ARVC могут играть ключевую роль в разработке новых схем лечения сердечных заболеваний.

Аннотация

В неповрежденной сердце смежные ячейки влияние взрослых кардиомиоцитов. С метод изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов точное расследование поведения этих клеток под конкретные процедуры и сред возможен. Эта рукопись представляет собой протокол для успешной изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC).

Крыса приносится в жертву шейки матки дислокации глубокой анестезию. Затем сердце извлекается и аорты открыт. Впоследствии перфузии на Langendorff перфузии системы с истощения кальция и коллагеназы лечение проводится. Впоследствии желудочковая ткани получает фарша, повторно распространяется и фильтруют, следуют три центрифугирования шаги с постепенным добавлением CaCl₂ до концентрации физиологического кальция. ARVC покрытие на блюдах культуры клеток. После обновления среды культуры клеток, ARVC можно выращивать до шести дней без изменения сыворотки содержащих питательной среды. Изоляция ARVC является сложный процесс кальция. Небольшие изменения внутриклеточной концентрации кальция вызывает снижение качества и жизнеспособность изолированных клеток.

Свеже изолированные ARVC являются стержня в форме. В течение первых дней культивирования они теряют палочковидные морфологии и формы Псевдоподия подобных структур (распространения). При этом морфологическими формирования ARVC первоначально ухудшить их сократительная элементы следуют Реформации через актина стресс волокна и sarcomerogenesis de novo . После одной недели культивирования большинство ARVC показать широкое появление с явно обнаруживаемая крест полосе. Этот процесс является чувствительным к внутриклеточной концентрации кальция, как лечение с ionomycin ослабляет распространения. Ключевые маркеры в этом процессе де и повторно differentiation являются β-миозина тяжелой цепи (β-MHC), oncostatin М (OSM) и swiprosin-1 (EFHD2). Недавние исследования показали, что сердечная ре и де differentiation происходит в условиях культуры имитирует функции видели, в естественных условиях во время Ремоделирование сердца. Таким образом изоляции и выращивания ARVC играют ключевую роль в понимании биологии кардиомиоцитов.

Введение

Взрослый кардиомиоцитов в естественных условиях работают как электрические синцития, основанный на ячейке контактов между миоцитов. Кроме того они находятся под влиянием соседних ячеек как сердечная фибробластов, эндотелиальных клеток, нейронов и воспалительные клетки¹. С целью изучения кардиомиоцитов способность адаптировать их внутриклеточного Организации изменены условия нагрузки, как видно при гипертрофии сердца, что первый шаг приводит к сердечной недостаточности, изоляции и выращивания взрослых желудочков крыса кардиомиоцитов (ARVC) является необходимым^2,3,4. Исторически кардиомиоцитов впервые были изолированы от зародышевых куриных сердец^5,6. Несколько лет спустя, первый изоляции неизлечимо дифференцированной cardiomyocytes был описан с помощью истощения кальция⁷. Однако эти взрослые кардиомиоцитов были не кальция терпимая(ый) и поэтому могут не использоваться для функциональных анализов. Наконец в 1976 году новый протокол включен, Пауэлл и твист расследовать взрослых кардиомиоцитов желудочков при физиологических условиях⁸. В качестве первого шага они изолированы взрослых кардиомиоцитов под низким содержанием кальция концентрации и затем увеличение кальция физиологические концентрации в ступенчатой процедуры. Сегодня большинство протоколов для изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов работать с настоящим Протоколом кальция и использовать коллагеназы для ферментативного пищеварения плотной ячеек контактов¹.

Для успешного выращивания требуется плода телячьей сыворотки (FCS) или oncostatin М (OSM). ARVC выполняет де - и повторно - differentiation с обширной структурных изменений, включая Саркомер разборки и Реформации^9,10,,1112. Этот процесс сопровождается повторного экспрессии генов плода типа, как тяжелые цепи β-миозина (β-MHC), как известно из гипертрофия и формирование Псевдоподия как структуры, также называемые распространяя^4,,^{11, 13}. Кроме того, swiprosin-1 (EFHD2), недавно выявленных белков, играет важную роль в процессе восстановления дифференциация культивируемых ARVC¹¹. В результате ARVC в культуре превратить в широко распространенной, полиморфные клетки, которые спонтанно Показать схватки после двух-трех недель в культуре^2,4,14.

Недавние открытия показали, что сердца ре и де differentiation как это происходит в условиях культуры имитирует особенности видели в естественных условиях при сердечной ремоделирования^10,15. Ремоделирование сердца — это ключевой процесс во время болезни сердца¹⁶. Как сердечно-сосудистых заболеваний по-прежнему являются основной причиной смерти в промышленно развитых обществах, более глубокое понимание биологии взрослых кардиомиоцитов важно (который; 2015). Изоляции и выращивания ARVC может помочь в разработке новых стратегий и лекарства для лечения сердечных заболеваний. С этой рукописи предоставляется протокол для изоляции и выращивания ARVC. Кроме того в разделе обсуждение выделяются некоторые критические части данного метода.

протокол

расследование проводится согласно руководству для ухода и использования лабораторных животных, опубликованных нами национального института здравоохранения (низ публикация № 85-23, редакция 1996). В целом крыс Вистара мужчин в возрасте от 3 до 4 месяцев и с средний вес 250-350 g используются для этого протокола. Одно сердце крысы является достаточным для 20 культуры блюд (1 мл на блюдо, внутренний диаметр: 35 мм) с плотностью приблизительное клеток 1,5 х 10 ⁴ клетки/1000 мм-².

1. Подготовка СМИ и реагентов

1. креатин карнитин таурина среднего (ЧМТ средней)
   Примечание: CCT среднего является средством сложные, основанные на среде 199 с добавлением карнитин, креатин и таурин.
   1. Подготовить 1 Л среде 199: добавить 3.6 g Hepes и смеси на 1 ч. Затем добавьте 655.5 мг Креатин (5 мм), карнитин 395.4 мг (2 мм) и 625.5 мг таурина (5 мм). Карнитин и таурина изменить рН для < 7. Для того, чтобы препятствовать росту любой загрязняющих ячеек, например эндотелиальных клеток и фибробластов, добавьте 10 мкм цитозина β-D-arabinofuranoside на носитель. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH (2 мм) фильтр 7.4 и стерильной среды. Хранить средство CCT на 4 ° C.
2. Пауэлл среднего
   1. за 1 Л Пауэлл средний, растворить 6,43 г NaCl (110 мм) с 0,19 г KCl (2,5 мм), 0,16 г х ₂ PO ₄ (1,2 мм), 0,3 г MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 мм), 5.96 g Hepes (25 мм) и 1,98 g D (+ )-Глюкозы моногидрата (10 мм) в Aqua стерильные. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH (2 М) фильтр 7.4 и стерильной среды. Средний магазин Пауэлл на 4 ° C.
3. Кальция хлорид (₂ CaCl)
   1. приготовляют раствор 100 мм CaCl ₂ (50 мл) и подготовить аликвоты, содержащий 500 мкл CaCl ₂. Заморозить аликвоты при -20 ° с.
4. Приготовления питательной среды
   1. подготовить три клетки культуры средах: Предварительное покрытие среднего, обшивка средних и стиральные среднего. CCT среды можно используйте в качестве основы для всех трех сред (Таблица 1). Рассчитайте средний ЧМТ с 1 мл на культуры блюдо. Таким образом, подготовить 20 мл ЧМТ средней для 20 культуры блюд (внутренний диаметр: 35 мм).
   2. Клетки культуры пластин: Пальто каждой пластины культуры клеток (внутренний диаметр: 35 мм) с 1 мл Предварительное покрытие среднего. Хранить пластины с покрытием при 37 ° C на ночь или по крайней мере 2 часов перед использованием.

2. Изоляция от взрослых кардиомиоцитов

1. перфузии системы подготовки Langendorff
   1. тепла покрытия средних и стиральные среднего до 37 ° C. размораживать трубки 500 мкл CaCl ₂ и весят в 25 мг коллагеназы.
   2. Флеш Langendorff перфузии системы с aqua стерильные, потом пусть Пауэлл среднего распространить систему для 5 минут
   3. Заполнения Langendorff перфузии системы с 80 мл Пауэлл среднего, без воздушных пузырьков и газ в среду с 95% кислорода.
   4. Подготовить трубку (50 мл) с 40 мл средний Пауэлл, нагреть ее до 37 ° C и газа с 95% кислорода.
   5. Подготовить нить длиной около 25 см для крепления удалены сердце канюли.
   6. Обезжирить лезвием бритвы с алкоголем (70% по объему) и закрепите его на вертолете. Хомут пластиковый диск в измельчитель.
2. Экстракции сердца
   1. анестезировать мужской wistar Крыса с 4% до 5% изофлюрановая и пожертвовать его с шейки матки дислокации. Откройте живота позади реберной дуги с брюшной сдвига и с же пара ножницами, вырезать через диафрагму, чтобы открыть грудной полости.
   2. Удаления сердца, легких и тимуса, резки выше тимуса высоко черепа в грудной полости. Немедленно передать ледяной физиологическим раствором материала.
   3. Удалить легких и тимуса из сердца с рассечения ножниц (большой) и по фиксирующий материал капсулы пинцетом, передать последний новый физиологический раствор.
3. Изоляции
   1. удаления избыточной ткани, как остатки тимуса, трахеи, жира и соединительной ткани из сердца с помощью капсула щипцы и рассечения ножниц (большие или малые). Раскрыть аорты и разорвать его рассечения ножниц (большие или малые) между первой и второй жаберных arch.
   2. Начать капать Langendorff перфузии системы. Сердце на канюля Langendorff перфузии системы и фиксировать его сначала с Зажим крокодил и позднее с подготовленной потоком. Промойте сердце до тех пор, пока это бесплатно крови.
   3. 25 мг коллагеназы в 5-6 мл теплой среде Пауэлл растворить и добавить 12,5 мкл CaCl ₂ (30 мкм).
   4. Закройте циркуляции, перемещая стекло воронки, который связан с системой Langendorff перфузии, через сердце капает и добавьте выполнено коллагеназы перфузии системы. Запустите перфузии для 25 мин с 1 капля в секунду скорость падения.
      Примечание: Во время перфузии, сердце будет набухать и получить вид восковой.
   5. Остановить перфузии после 25 минут и удалите сердце из Langendorff перфузии системы. Удаление аорты, предсердиями и соединительной ткани из сердца и открыть правого и левого желудочков.
   6. Чоп сердце два раза под углом 90 ° (Ширина вырезывания: 0.7 мм; скорость: 0,15 см/сек). Повторите этот процесс вручную с двумя скальпели для 10 s каждая сторона.
   7. Передача 12 мл перфузии среды в новой трубки (50 мл). Залить суспензии клеток в этой среде и дайджест клетки еще пять минут при 37 ° C. Mix решение каждую минуту.
   8. Фильтр решение с переваривается сердца через нейлоновая сетка (200 мкм) в новой трубки (50 мл).
   9. Центрифуга отфильтрованных решение на 29 g x 3 мин удалить супернатант и добавить 6 мл теплой Пауэлл среднего включая 12,5 мкл CaCl ₂ (250 мкм) клетки Пелле. Ресуспензируйте Пелле через гладкой пожимая движения. Центрифуга снова на 29 g x 2 мин удалить супернатант и добавить 6 мл теплой Пауэлл среднего замещенных с 25 мкл CaCl ₂ (500 мкм). Растворяют гранулы клетки через нежный пожимая движения и добавить 12 мл теплой Пауэлл средних включая 120 мкл CaCl ₂ (1 мм). Центрифуги для в третий раз в 16 x g за 1 мин. Опять же, удалить супернатант.
   10. Смесь гранул ячейки с подогретым обшивка среднего.
   11. Удаление Предварительная обшивка среднего из культуры пластин. Передача 1 мл, обшивка среднего, включая изолированных cardiomyocytes, для каждой культуры пластины. Инкубировать свежие изолированных cardiomyocytes при 37 ° C за 1 ч.
   12. Удалить средство покрытия из культуры пластин. Добавьте 1 mL, мытье среднего для каждой культуры пластины и хранить пластины при 37 ° C до шести дней без изменения среднего.
   13. Для изучения влияния различных химических веществ и лечения на ARVC, сначала обновить обшивка среднего мытья среднего и затем добавив различных химических веществ.
       Примечание: Оценки с световой микроскопии: С каждой ячейки подготовка 150 до 300 кардиомиоцитов должно контролироваться в день световой микроскопии. Разделить все подсчитано кардиомиоцитов в группы согласно их внешний вид (например, " палочковидные ", " раунд вниз ", " распространение ", и " необычный внешний вид "). Категория " распространение " включает в себя все кардиомиоцитов с Псевдоподия подобных структур. " Необычный внешний вид " включает в себя все ARVC с Неровная поверхность и не поддающиеся обнаружению нетронутыми клеточной мембраны.

3. Пример Эксперименты

1. 1. Анализ морфологической и структурные преобразования ARVC во время культивирования Конфокальная лазерная микроскопия флуоресцирования/иммунофлюоресценции окрашивание взрослых кардиомиоцитов. Использовать Фаллоидин-TRITC для изучения F-актина структуры в " палочковидные ", " раунд вниз ", и " распространение " ARVC. Выполняют окрашивание по заявлению производителя ' протокол s. Пример для окрашивания Фаллоидин-TRITC приводится в справочнике Нипперт и др. ¹¹. с флуоресцентным/иммунофлюоресценции окрашивание, различия в де - и повторно - differentiation сократительная аппарата в культивируемых взрослых кардиомиоцитов между экспериментальные методы лечения (например, с Swiprosin-1, ionomycin) могут расследоваться.
2. В реальном времени количественного RT-PCR (qRT ПЦР)
   1. выполняют qRT ПЦР для изучения изменений в выражение mRNA различных генов (например, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) во время выращивания ARVC. Для достаточного размера выборки, используйте большие блюда культуры (внутренний диаметр: 60 мм) с объемом 2 мл. ARVC пять блюд культуры дает один образец. Выполнение изоляции мРНК и трансформация cDNA, по словам производителя ' протокол s.
3. Immunoblot методы
   1. выполнения западных помарок для изучения изменений в выражении протеина (например, для Swiprosin-1) во время выращивания ARVC. Использование одной культуры блюдо (1 мл) на сэмпл.

Результаты

Взрослый кардиомиоцитов в культуре: Рисунок 1 показывает обзор свежевыделенных взрослых кардиомиоцитов 2 ч после последней промывки. Приблизительно 75% всех cardiomyocytes был палочковидные морфологии. Оставшиеся 25% показали необычный внешний вид с ?...

Обсуждение

Поведение взрослых кардиомиоцитов в vivo находится под влиянием многих взаимодействия с другие ячейки (например, нейроны, эндотелиальных клеток, фибробластов, воспалительных клеток) и электрические синцития, который они формируют¹. Таким образом изучая стресс ада?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177