Isolement et culture des Cardiomyocytes de Rat adulte

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement et la culture du rat adulte cardiomyocytes ventriculaires (CVDA). CVDA isolé peut être utilisé pour la culture à courte et à long terme. L’isolement et la culture de CVDA peuvent jouer un rôle clé dans l’élaboration de nouveaux schémas thérapeutiques pour les maladies cardiaques.

Résumé

Dans un coeur intact, cellules adjacentes influencent les cardiomyocytes adultes. Avec la méthode d’isolement et culture des cardiomyocytes adultes, une enquête précise sur le comportement de ces cellules sous traitements spécifiques et des environnements est possible. Ce manuscrit présente un protocole pour la réussite de l’isolement et culture des cardiomyocytes ventriculaires de rat adulte (CVDA).

Le rat est sacrifié par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Puis, le cœur est extraite et l’aorte est découvert. Par la suite, une perfusion sur le système de perfusion de Langendorff avec épuisement de calcium et le traitement de la collagénase est effectuée. Par la suite, tissu ventriculaire obtient haché, rediffusée et filtré, suivi de trois étapes de centrifugation avec ajout graduel de CaCl₂ jusqu'à ce que la concentration de calcium physiologique est atteinte. CVDA sont plaquées sur les récipients de culture cellulaire. Après avoir actualisé le milieu de culture cellulaire, CVDA peut être cultivé pendant six jours, sans changer le milieu de culture contenant du sérum. Isolement de CVDA est un processus délicat de calcium. Petits changements dans la concentration de calcium intracellulaire provoque une diminution de la qualité et la viabilité des cellules isolées.

Fraîchement isolées CVDA sont en forme de tige. Dans les premiers jours de culture, ils perdent les bâtonnet morphologie et forme pseudopodes structures semblables (propagation). Au cours de cette formation morphologique CVDA dégrader initialement leurs éléments contractiles, suivies d’une réforme par le biais de fibres de stress d’actine et de novo sarcomerogenesis. Après une semaine de la culture, la plupart CVDA montrent un aspect généralisé avec une striation transversale clairement décelable. Ce processus est sensible à la concentration de calcium intracellulaire, comme traitement avec ionomycine atténue la propagation. Les marqueurs clés dans ce processus de - et re - differentiation sont la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), oncostatine M (OSM) et swiprosin-1 (EFHD2). Des études récentes ont suggéré que cardiaque re - et de - differentiation survenant dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque. Par conséquent, l’isolement et culture des CVDA jouent un rôle clé dans la compréhension de la biologie des cardiomyocytes.

Introduction

Les cardiomyocytes adultes en vivo fonctionne comme un syncytium électrique basé sur les contacts des cellules entre les myocytes. En outre, ils sont influencés par des cellules adjacentes comme les fibroblastes cardiaques, cellules endothéliales, les neurones et les cellules inflammatoires¹. Afin d’étudier la capacité des cardiomyocytes à adapter leur organisation intracellulaire à modifié les conditions de charge, comme on le voit au cours de l’hypertrophie cardiaque, qui est une première étape conduisant à une insuffisance cardiaque, l’isolement et la culture du rat ventriculaire adulte cardiomyocytes (CVDA) est nécessaire^2,3,4. Historiquement, les cardiomyocytes ont d’abord été isolés de l’embryon de poulet coeurs^5,6. Quelques années plus tard, le premier isolement des cardiomyocytes différenciées en phase terminale a été décrite à l’aide de calcium appauvrissement de la couche⁷. Toutefois, ces cardiomyocytes adultes n’étaient pas calcique tolérant et ne pouvait donc pas être utilisés pour les tests fonctionnels. Enfin, en 1976, un nouveau protocole activé Powell et Twist d’enquêter sur des cardiomyocytes ventriculaires adultes sous des conditions physiologiques⁸. Dans un premier temps, ils ont isolement les cardiomyocytes adultes sous de faibles concentrations de calcium et par la suite une augmentation de calcium à des concentrations physiologiques dans une procédure par étapes. Aujourd'hui, la plupart des protocoles d’isolement et de culture des cardiomyocytes adultes travaillent avec ce protocole de calcium et utilisent collagénase pour la digestion enzymatique de la cellule-cellule dense contacts¹.

Pour une culture réussie, sérum de veau foetal (FCS) ou oncostatine M (OSM) est requise. CVDA exécute une de - et re - differentiation avec les importants changements structurels dont sarcomère démontage et réforme^9,10,11,12. Ce processus s’accompagne d’un re-expression des gènes de type fœtal, comme la chaîne lourde de β-myosine (β-MHC), comme dans une hypertrophie et une formation de structures ressemblant à des pseudopodes, également appelé épandage^{4,11, 13}. en outre, swiprosin-1 (EFHD2), une protéine nouvellement identifiée, joue un rôle majeur dans le processus de re-différenciation des cultivés CVDA¹¹. En conséquence, CVDA dans culture transformer en cellules généralisées, polymorphes, qui montrent spontanément des contractions après deux ou trois semaines dans la culture^2,4,14.

Des découvertes récentes ont révélé que cardiaque re - et de - differentiation lorsqu’il produit dans des conditions de culture imite caractéristiques vu in vivo au cours de remodelage cardiaque^10,15. Remodelage cardiaque est un processus clé lors des maladies cardiaques,¹⁶. Comme les maladies cardiaques constituent toujours la principale cause de mortalité dans les sociétés industrialisées, il est important de mieux comprendre la biologie des cardiomyocytes adultes (qui ; 2015). Isolement et culture des CVDA peuvent aider à développer de nouvelles stratégies et médicaments pour le traitement des maladies cardiaques. Ce manuscrit, un protocole pour l’isolement et la culture de CVDA est donné. En outre, certaines parties critiques de cette méthode sont mises en évidence dans la section « discussion ».

Protocole

l’enquête est menée selon le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publiée par le National Institute of Health (NIH Publication n° 85-23, révisée en 1996). En général, les rats wistar mâles âgés de 3 à 4 mois et avec un poids moyen de 250-350 g, sont utilisées pour ce protocole. Un coeur de rat est suffisant pour 20 Pétri (1 mL par plat ; diamètre intérieur : 35 mm) avec une densité cellulaire approximative de 1,5 x 10 ⁴ cellules/1000 mm ².

1. préparation des milieux et réactifs

1. créatine-carnitine-taurine milieu (milieu de la CCT)
   Remarque : milieu de la CCT est un milieu complex issu du milieu 199 additionné de créatine, carnitine et taurine.
   1. Préparer 1 L de milieu 199 : ajouter 3,6 g Hepes et mélanger pendant 1 h. Ajoutez ensuite la créatine 655,5 mg (5 mM), carnitine 395,4 mg (2 mM) et la taurine 625,5 mg (5 mM). Carnitine et taurine changent pH à < 7. Afin d’inhiber la croissance des cellules, par exemple les cellules endothéliales ou fibroblastes contaminantes, ajouter 10 µM cytosine β-D-arabinofuranoside au milieu. Ajuster le pH avec du NaOH (2 mM) à 7,4 et stérile filtre le milieu. Conserver le milieu de la CCT à 4 ° C.
2. Moyen de Powell
   1. pour 1 moyen L Powell, dissoudre 6,43 g NaCl (110 mM) à 0,19 g KCl (2,5 mM), (1,2 mM), 0,3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), 0,16 g KH ₂ PO ₄ 5,96 g Hepes (25 mM) et 1,98 g D (+ )-Monohydrate de glucose (10 mM) en Aqua stérile. Ajuster le pH avec du NaOH (2 M) au filtre 7,4 et stérile du milieu. Conserver le milieu de Powell à 4 ° C.
3. Chlorure de Calcium (CaCl ₂)
   1. préparer une solution de 100 mM CaCl ₂ (50 mL) et de préparer des aliquotes contenant 500 µL CaCl ₂. Congeler des aliquotes à -20 ° C.
4. Préparation du milieu de culture
   1. Prepare trois milieux de culture cellulaire : pré-revêtement médium, médium placage et lavage moyen. Utiliser le moyen du tarif douanier commun comme base pour toutes les trois médiums (tableau 1). Calculer la moyenne du tarif douanier commun avec 1 mL par boîte de Petri. Donc, préparer 20 mL de milieu de CCT pour 20 Pétri (diamètre intérieur : 35 mm).
   2. Cell culture plaques : enduisez chaque plaque de culture cellulaire (diamètre intérieur : 35 mm) avec 1 mL pré-revêtement moyen. Stocker les plaques revêtues à 37 ° C pendant la nuit ou pendant au moins 2 h avant d’utiliser.

2. Isolement des Cardiomyocytes adultes

1. système de perfusion de préparation de Langendorff
   1. chauffer l’électrodéposition moyen et support de lavage à 37 ° C. Defreeze un tube de 500 µL CaCl ₂ et pèsent de 25 mg de collagénase.
   2. Ras le système de perfusion de Langendorff avec aqua stérile, laisser ensuite moyen de Powell circulent le système pendant 5 min.
   3. Remplir le système de perfusion de Langendorff avec 80 mL de milieu de Powell, sans aucun air bulles et gaz le milieu avec 95 % d’oxygène.
   4. Préparer un tube (50 mL) avec 40 mL de milieu de Powell, chauffez-le à 37 ° C et il gaz avec 95 % d’oxygène.
   5. Préparer un fil d’environ 25 cm de longueur pour fixer le cœur enlevé à la canule.
   6. Dégraisser une lame de rasoir avec de l’alcool (70 % en volume) et l’accrocher à l’hélico. Serrer un disque en plastique dans le hachoir.
2. Extraction du coeur
   1. anesthésier un rat wistar mâles avec 4 à 5 % isoflurane et le sacrifice avec dislocation cervicale. Ouvrir l’abdomen derrière l’arc costal avec un cisaillement abdominal et, avec la même paire de ciseaux, couper à travers le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.
   2. Enlever le cœur, ainsi que les poumons et le thymus, en coupant au-dessus du thymus hautement crânien dans la cavité thoracique. Transférer le matériel à solution saline glacée immédiatement.
   3. Enlever le poumon et le thymus du cœur avec un ciseaux de dissection (grand) et de fixer le matériau avec une pince capsule, transférer ce dernier à une nouvelle solution saline.
3. Isolation
   1. enlever les tissus en excès, comme les résidus de thymus, trachée, la graisse et du tissu conjonctif du fond du cœur à l’aide de forceps capsule et un ciseaux de dissection (grande ou petite). Découvrir l’aorte et il rompre avec un ciseaux de dissection (grande ou petite) entre le premier et le deuxième branchiales arch.
   2. Commencer le dripping du système de perfusion de Langendorff. Placez le coeur sur la canule du système de perfusion Langendorff et se focaliser tout d’abord avec une pince crocodile et ensuite avec le fil préparé. Rincez le cœur jusqu'à ce qu’il est exempt de sang.
   3. Dissoudre 25 mg collagénase dans un milieu Powell chaud 5 à 6 mL et ajouter 12,5 µL CaCl ₂ (30 µM).
   4. Fermer la circulation en plaçant un entonnoir de verre, qui est relié avec le système de perfusion de Langendorff, sur le cœur ruisselant et ajouter la collagénase résolu pour le système de perfusion. Commencer la perfusion pendant 25 min avec une vitesse de chute de 1 goutte par seconde.
      Remarque : Pendant la perfusion, le cœur va gonfler et obtenir un aspect cireux.
   5. Arrêter la perfusion après 25 min et enlever le cœur du système de perfusion de Langendorff. Retirer le cœur de l’aorte, oreillettes et du tissu conjonctif et à ouvrir les ventricules droit et gauche.
   6. Hachez le coeur deux fois à un angle de 90° (largeur de coupe : 0,7 mm, vitesse : 0,15 cm/s). Répétez ce processus manuellement avec deux scalpels pour 10 s chaque côté.
   7. Transférer 12 mL du milieu de perfusion dans un nouveau tube (50 mL). Versez la solution chargée en cellules dans ce médium et digérer les cellules pendant cinq minutes à 37 ° C. mélanger la solution chaque minute.
   8. Filtrer la solution avec le cœur digérée au travers d’une maille en nylon (200 µm) dans un nouveau tube (50 mL).
   9. Centrifuger la solution filtrée à 29 g pendant 3 min. jeter le surnageant et ajouter 6 mL de milieu chaud Powell dont 12,5 µL CaCl ₂ (250 µM) pour le culot cellulaire. Resuspendre le culot par le biais de mouvements secouant. Centrifuger à nouveau à 29 x g pendant 2 min. jeter le surnageant et ajouter 6 mL chaud moyen Powell substitué par 25 µL CaCl ₂ (500 µM). Dissoudre le culot cellulaire par le biais de manœuvres douces et secouant et ajouter 12 mL chaud Powell moyen y compris 120 µL CaCl ₂ (1 mM). Centrifugeuse pour la troisième fois à 16 x g pendant 1 min. Encore une fois, éliminer le surnageant.
   10. Mélanger le culot cellulaire avec le médium placage préchauffé.
   11. Retirer avant électrodéposition moyen de plaques de culture. Transférer 1 mL de support, y compris les cardiomyocytes isolés, pour chaque plaque de culture de placage. Incuber les cardiomyocytes isolés fraîches à 37 ° C pendant 1 h.
   12. Enlever le support de revêtement de plaques de culture. Ajouter 1 mL de lavage moyen pour chaque plaque de culture et de stocker les plaques à 37 ° C jusqu'à six jours sans changer le support de.
   13. Pour étudier l’influence de différents produits chimiques et traitements sur CVDA, tout d’abord actualiser médium placage en lavage moyen et par la suite en ajoutant différents produits chimiques.
       NOTE : Évaluation à la microscopie photonique : avec la préparation de chaque cellule, les cardiomyocytes de 150 à 300 doivent être surveillés par jour au microscope photonique. Subdiviser les cardiomyocytes tous comptés en groupes selon leur apparence (par exemple, " en forme de tige ", " rond vers le bas ", " diffusion ", et " aspect inhabituel "). La catégorie " diffusion " comprend tous les cardiomyocytes avec structures ressemblant à des pseudopodes. " Aspect inhabituel " comprend tous les CVDA avec une surface irrégulière et aucune membrane de cellules intacte détectable.

3. Exemple de Expériences

1. Fluorescence/Immunofluorescence souillant des cardiomyocytes adultes
   1. analyser les conversions morphologiques et structurales de CVDA pendant la culture par microscopie confocal laser. Phalloïdine-TRITC permet d’enquêter sur les structures de l’actine F en " en forme de tige ", " rond vers le bas ", et " diffusion " CVDA. Effectuer une coloration selon le fabricant ' protocole s. Un exemple pour la coloration de la phalloïdine-TRITC est donné en référence Nippert et al. ¹¹. avec fluorescence/immunofluorescence souillant, les différences dans la de - et re - differentiation de l’appareil contractile dans les cardiomyocytes adultes cultivés entre (par exemple, avec des traitements expérimentaux Swiprosin-1, ionomycine) peuvent être l’objet d’une enquête.
2. En temps réel RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
   1. effectuer qRT-PCR pour étudier les changements dans l’expression de l’ARNm de gènes différents (p. ex., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) pendant la culture de CVDA. Pour la taille de l’échantillon suffisant, utiliser des plats de culture plus grands (diamètre intérieur : 60 mm) avec volume de 2 mL. CVDA de cinq plats de culture donne un échantillon. Effectuer l’isolement d’ADN messagère et la transformation de l’ADNc selon le fabricant ' protocole de s.
3. Techniques d’immunotransfert
   1. effectuer des Western Blots pour étudier les changements dans l’expression de la protéine (par exemple, pour Swiprosin-1) au cours de la culture de CVDA. Utilisez une boîte de Petri (1 mL) par exemple.

Résultats

Des cardiomyocytes adultes dans la culture : La figure 1 présente un aperçu des cardiomyocytes adultes fraîchement isolées 2 h après le dernier lavage. Environ 75 % des cardiomyocytes tous avaient une morphologie en forme de bâtonnet. Les 25 % restants ont montré un aspect inhabituel avec une morphologie ronde et la membrane de la cellule intacte de pas détectable (Figure 1). À la fin de la culture (jou...

Discussion

Le comportement des cardiomyocytes adultes in vivo est influencé par de nombreuses interactions avec les autres cellules (par exemple, les neurones, les cellules endothéliales, fibroblastes, cellules inflammatoires) et le syncytium électrique qu’ils composent¹. Par conséquent, étudier le stress adaptation des cardiomyocytes adultes exclusivement nécessite l’isolement et la culture de CVDA. Les principaux effets d’isoler et de cultiver CVDA sont : 1) les déconnecter ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177