Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.

Resumen

En un corazón intacto, las células adyacentes influyen en cardiomiocitos adultos. Con el método de aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos, es posible una investigación precisa del comportamiento de estas células en tratamientos específicos y ambientes. Este manuscrito presenta un protocolo para acertado aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC).

La rata se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia profunda. A continuación, se extrae el corazón y la aorta se destapa. Posteriormente, se realiza la perfusión en el sistema de perfusión de Langendorff con el agotamiento de calcio y tratamiento de la colagenasa. Luego, tejido ventricular obtiene picada, recircula y filtrado, seguido de tres pasos de centrifugación con incorporación gradual de CaCl₂ hasta que se alcanza la concentración fisiológica de calcio. ARVC se platean en platos de cultivo celular. Después de actualizar el medio de cultivo celular, ARVC pueden cultivar hasta seis días sin cambiar el medio de cultivo que contiene el suero. Aislamiento de ARVC es un proceso sensible del calcio. Pequeños cambios en la concentración de calcio intracelular provocar una disminución en la calidad y viabilidad de las células aisladas.

Recién aislado ARVC son en forma de barra. En los primeros días de cultivo pierden las forma morfología y forma seudópodos-como las estructuras (separarse). Durante esta formación morfológica ARVC degradan inicialmente sus elementos contráctiles seguidas por una reforma a través de fibras de actina estrés y sarcomerogenesis de novo . Después de una semana de cultivo, la mayoría ARVC muestran un aspecto generalizado con una estriación transversal claramente perceptible. Este proceso es sensible a la concentración de calcio intracelular, como tratamiento con ionomycin atenúa separarse. Los marcadores claves en este proceso de - y re - differentiation son cadena pesada de miosina β (β-MHC), Oncostatina M (OSM) y swiprosin-1 (EFHD2). Estudios recientes han sugerido que cardiaco re y de differentiation que ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de ARVC juegan un papel clave en la comprensión de la biología de cardiomiocitos.

Introducción

Cardiomiocitos adultos en vivo funciona como un sincitio eléctrico basado en los contactos célula-célula entre miocitos. Además, están influenciadas por las adyacentes células como fibroblastos cardíacos, células endoteliales, neuronas y células inflamatorias¹. Con el fin de estudiar la capacidad de cardiomiocitos para adaptar su organización intracelular alterado condiciones de carga, como se ve durante la hipertrofia cardiaca, que es un paso inicial hacia la insuficiencia cardíaca, el aislamiento y cultivo de rata adulta ventricular cardiomiocitos (ARVC) es necesario^2,3,4. Históricamente, cardiomiocitos primero fueron aislados de chick embrionario corazones^5,6. Unos años más tarde, el primer aislamiento de cardiomiocitos terminalmente diferenciadas fue descrito por medio del agotamiento de calcio⁷. Sin embargo, estos cardiomiocitos adultos no eran tolerantes de calcio y por lo tanto no se podían utilizar para ensayos funcionales. Finalmente, en 1976 un nuevo protocolo permitió a Powell y toque investigar cardiomiocitos ventriculares adultos bajo condiciones fisiológicas⁸. Como primer paso, aislaron cardiomiocitos adultos bajo concentraciones bajas de calcio y posteriormente aumento calcio a concentraciones fisiológicas en un procedimiento paso a paso. Hoy, mayoría de los protocolos para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos trabaja con este protocolo de calcio y uso de colagenasa para la digestión enzimática de la célula densa contactos¹.

Para un exitoso cultivo, suero fetal de ternero (FCS) u Oncostatina M (OSM) se requiere. ARVC realizar un de - y re - differentiation con extensos cambios estructurales incluyendo sarcómero desmontaje y reforma^9,10,11,12. Este proceso es acompañado por una nueva expresión de los genes de tipo fetal, como la cadena pesada de miosina β (β-MHC), como la hipertrofia y formación de seudópodos-como las estructuras, también llamado extensión de^{4,11, 13}. Además, swiprosin-1 (EFHD2), una proteína recientemente identificada, desempeña un papel importante en el proceso de rediferenciación de ARVC cultivadas¹¹. Como resultado, ARVC en cultura se transforman en células generalizadas, polimorfas, que espontáneamente muestran contracciones después de dos a tres semanas de cultura^2,4,14.

Recientes descubrimientos han revelado que cardiaca differentiation re y de como ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca^10,15. Remodelación cardiaca es un proceso clave en enfermedades cardíacas¹⁶. Enfermedades cardíacas siguen siendo la principal causa de muerte en las sociedades industrializadas, una mejor comprensión de la biología de cardiomiocitos adultos es importante (que; 2015). Aislamiento y cultivo de ARVC pueden ayudar a desarrollar nuevas estrategias y medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardíacas. Con este manuscrito, se proporciona un protocolo para el aislamiento y cultivo de ARVC. Además, se destacan algunas partes esenciales de este método en la sección de discusión.

Protocolo

la investigación se lleva a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por nosotros Instituto Nacional de salud (NIH publicación no. 85-23, revisada en 1996). En general, ratas wistar macho de 3 a 4 meses de edad y con un peso promedio de 250-350 g se utilizan para este protocolo. Un corazón de rata es suficiente para 20 platos de cultura (1 mL por plato; diámetro interior: 35 mm) con una densidad celular aproximada de 1.5 x 10 ⁴ células/1000 mm ².

1. preparación de medios y reactivos

1. carnitina-creatina-taurina (CCT medio)
   Nota: CCT medio es un medio complejo basado en medio 199 con el agregado de creatina, carnitina y taurina.
   1. Preparar 1 L de medio 199: Añadir 3,6 g Hepes y mezcla durante 1 hora. Luego añadir 655,5 mg creatina (5 mM), 395,4 mg de carnitina (2 mM) y taurina mg 625,5 (5 mM). Carnitina y taurina cambian pH a < 7. Con el fin de inhibir el crecimiento de células contaminantes, por ejemplo, las células endoteliales o los fibroblastos, añadir 10 μm citosina β-D-arabinofuranoside al medio. Ajustar el pH con NaOH (2 mM) filtro estéril y 7.4 el medio. Almacenar el medio CCT a 4 ° C.
2. Medio de Powell
   1. para 1 medio L Powell, disolver 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0.16 g KH ₂ PO ₄ (1,2 mM), 0,3 g de MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) y 1,98 g D (+ )-Glucosa monohidrato (10 mM) en Aqua estéril. Ajustar el pH con NaOH (2 M) a 7,4 y estéril el filtro del medio. Medio de Powell tienda a 4 ° C.
3. Cloruro de calcio (CaCl ₂)
   1. preparar una solución de 100 mM CaCl ₂ (50 mL) y preparar alícuotas conteniendo 500 μl de CaCl ₂. Congelar en alícuotas a -20 ° C.
4. Preparación de medio de cultivo
   1. Prepare tres medios de cultivo celular: pre-galjanoplastia medio, galjanoplastia de medio y medio de lavado. Utilizar el medio CCT como base para todos los tres medios (tabla 1). Calcular medio CCT con 1 mL por placa de cultivo. Por lo tanto, preparar medio CCT 20 mL para 20 platos de cultura (diámetro interior: 35 mm).
   2. De la célula cultura placas: cada placa de cultivo de células de la capa (diámetro interior: 35 mm) con 1 mL pre-galjanoplastia medio. Almacenar las placas recubiertas a 37 ° C durante la noche o durante al menos 2 h antes de usar.

2. Aislamiento de cardiomiocitos adultos

1. sistema de preparación de Langendorff perfusión
   1. calor medio forro y lavado medio a 37 ° C. descongelar un tubo 500 μl de CaCl ₂ y pesan de 25 mg de colagenasa.
   2. Ras del sistema de perfusión de Langendorff con aqua estéril, luego dejar medio Powell circulan el sistema por 5 min
   3. Llene el sistema de perfusión de Langendorff con 80 mL de medio de Powell sin cualquier aire burbujas y gas el medio con oxígeno del 95%.
   4. Preparar un tubo (50 mL) con 40 mL de medio de Powell, calentar a 37 ° C y gas con el oxígeno del 95%.
   5. Preparar un hilo de unos 25 cm de longitud para atar el corazón quitado a la cánula de.
   6. Desengrasar una cuchilla con alcohol (70% por volumen) y fijarlo a la picadora. Un disco de plástico de la abrazadera en la picadora.
2. Extracción de corazón
   1. anestesiar una rata wistar macho con 4% a 5% isoflurano y sacrificio con la dislocación cervical. Abierto el abdomen detrás del arco costal con un corte abdominal y, con el mismo par de tijeras, corte a través del diafragma para abrir la cavidad torácica.
   2. Quitar el corazón, junto con el pulmón y timo, cortando por encima del timo muy craneal en la cavidad torácica. Transferir el material a una solución salina helada inmediatamente.
   3. Saque el pulmón y timo, el corazón con una tijera de disección (grande) y por fijación del material con pinzas para cápsula, transferir éste a una nueva solución salina.
3. Aislamiento
   1. Eliminar exceso de tejido, como residuos de timo, la tráquea, la grasa y tejido conectivo del corazón usando fórceps cápsula y una tijera de disección (grande o pequeño). Descubrir la aorta y cortar con una tijera de disección (grande o pequeño) entre el primer y segundo lugar branchial arquitecto
   2. Iniciar el goteo del sistema de perfusión de Langendorff. Coloque el corazón en la cánula del sistema de perfusión de Langendorff y fijar primero con una pinza de cocodrilo y luego con el hilo preparado. Enjuague el corazón hasta que quede libre de sangre.
   3. Disolver 25 mg de colagenasa en el cálido medio de Powell 5-6 mL y añadir 12.5 μl CaCl ₂ (30 μm).
   4. Cierre de circulación moviendo un embudo de cristal, que está conectado con el sistema de perfusión de Langendorff, sobre el corazón de goteo y añadir la colagenasa solucionado para el sistema de perfusión. Iniciar la perfusión de 25 min con una velocidad de caída de 1 gota por segundo.
      Nota: Durante la perfusión, el corazón se hinche y conseguir un aspecto céreo.
   5. Detener la perfusión después de 25 minutos y retirar el corazón del sistema de perfusión de Langendorff. Quitar la aorta, aurícula y tejido conectivo del corazón y abrir los ventrículos izquierdos y derecho.
   6. Picar el corazón dos veces en un ángulo de 90° (ancho de corte: 0,7 mm, velocidad: 0.15 cm/s). Repita este proceso manualmente con dos bisturíes para 10 s cada lado.
   7. Transferir 12 mL del medio de perfusión a un tubo nuevo (50 mL). Vierta la mezcla de células en este medio y digerir las células por otros cinco minutos a 37 ° C. mezcla la solución cada minuto.
   8. Filtrar la solución con el corazón digerido a través de una malla de nylon (200 μm) en un tubo nuevo (50 mL).
   9. Centrifugar la solución filtrada a 29 x g durante 3 min descartar el sobrenadante y añada 6 mL caliente Powell medio incluyendo 12,5 μl CaCl ₂ (250 μm) para el sedimento celulares. Resuspender el precipitado a través de movimientos de agitación suave. Centrifugar nuevamente a 29 x g durante 2 min descartar el sobrenadante y añadir 6 mL caliente medio Powell sustituido con 25 μl de CaCl ₂ (500 μm). Disolver el precipitado de células a través de suaves movimientos de agitación y añadir 12 mL caliente Powell medio incluyendo 120 μl CaCl ₂ (1 mM). Centrifugar por tercera vez en 16 x g durante 1 minuto. Otra vez, eliminar el sobrenadante.
   10. Mezclar el sedimento celular con el galjanoplastia precalentado medio.
   11. Retire placas previos medio placas de cultura. Transferir 1 mL de medio, incluyendo los cardiomiocitos aislados, a cada placa de cultivo de la galjanoplastia. Incubar los cardiomiocitos aislados fresca a 37 ° C por 1 h.
   12. Quitar el medio de placas de placas de. Añadir 1 mL de medio a cada placa de cultivo de lavado y almacenar las placas a 37 ° C hasta 6 días sin cambiar el medio.
   13. Para investigar la influencia de diferentes productos químicos y tratamientos en ARVC, primero actualizar chapado en medio medio de lavado y después añadiendo diferentes productos químicos.
       Nota: La evaluación con microscopía de luz: con la preparación de cada célula, deben controlarse cardiomiocitos de 150 a 300 por día por microscopia ligera. Subdividir todo contado cardiomiocitos en grupos según su aspecto (por ejemplo, " en forma ", " redondo abajo ", " separarse ", y " aspecto inusual "). La categoría " separarse " incluye todos los cardiomiocitos con seudópodos como las estructuras. " Aspecto inusual " incluye todos ARVC con una superficie irregular y no detectable membrana intacta de la célula.

3. Ejemplo Experimentos

1. de la fluorescencia de la inmunofluorescencia, tinción de cardiomiocitos adultos
   1. analizar morfológicas y estructurales las conversiones de ARVC durante el cultivo mediante microscopía láser confocal. Utilice Phalloidin-TRITC para investigar las estructuras de la F-actina en " en forma ", " redondo abajo ", y " difundir " ARVC. Realizar la coloración según el fabricante ' protocolo de s. Se da un ejemplo para la tinción de Phalloidin-TRITC en referencia Nippert et al. ¹¹. con la tinción de fluorescencia de la inmunofluorescencia, las diferencias en el de - y re - differentiation del aparato contráctil en cardiomiocitos adultos cultivados entre tratamientos experimentales (por ejemplo, con Swiprosin-1, ionomycin) puede ser investigado.
2. RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
   1. realizar qRT-PCR para investigar cambios en la expresión del mRNA de genes diferentes (por ejemplo, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante el cultivo de ARVC. Tamaño de muestra suficiente, utilizar platos más grandes de la cultura (diámetro interior: 60 mm) con 2 mL de volumen. ARVC de cinco platos de cultura produce una muestra. Realizar aislamiento del mRNA y la transformación del cDNA según el fabricante ' Protocolo s.
3. Técnicas de inmunoblot
   1. realizar Western Blots para investigar cambios en la expresión de la proteína (por ejemplo, para Swiprosin-1) durante el cultivo de ARVC. Utilizar una placa de cultivo (1 mL) por ejemplo.

Resultados

Cardiomiocitos adultos en la cultura: La figura 1 muestra un resumen de cardiomiocitos adultos recién aislado 2 h después del último lavado. Aproximadamente el 75% de los cardiomiocitos tenía una morfología en forma de barra. El 25% restante demostrado un aspecto inusual con una morfología circular y no detectable intacto membrana de la célula (figura 1). Al final del cultivo (día 6), hasta 15% de los car...

Discusión

El comportamiento de los cardiomiocitos adultos en vivo está influenciado por muchas interacciones con otras células (p. ej., neuronas, células endoteliales, fibroblastos, células inflamatorias) y el sincicio eléctrico que forman¹. Por lo tanto, estudiando la adaptación de la tensión de cardiomiocitos adultos exclusivamente requiere el aislamiento y cultivo de ARVC. Los principales efectos de aislar y cultivar ARVC son: 1) desconexión de la matriz extracelular y célula-c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177