Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Zusammenfassung

In einem intakten Herzen beeinflussen benachbarte Zellen adulten Kardiomyozyten. Mit der Methode der Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten ist eine genaue Untersuchung des Verhaltens dieser Zellen unter bestimmten Behandlungen und Umgebungen möglich. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC).

Die Ratte ist durch zervikale Dislokation Tiefe Narkose geopfert. Dann, das Herz wird extrahiert und die Aorta ist aufgedeckt. Anschließend wird die Perfusion auf dem Langendorff Perfusion System mit Kalzium Erschöpfung und Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Danach bekommt ventrikuläre Gewebe gehackt, wieder in Umlauf gebracht, und gefiltert, gefolgt von drei Zentrifugation Schritte mit allmählicher Zugabe von CaCl₂ bis physiologischer Calcium-Konzentration erreicht ist. ARVC sind beschichtet, auf Zelle Kultur Gerichte. Nach dem Aktualisieren der Zellkulturmedium, können ARVC kultiviert bis zu sechs Tage lang ohne Änderung der Serum-haltigen Kulturmedium. Isolierung von ARVC ist ein Kalzium sensibler Prozess. Kleine Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration führen eine Abnahme in der Qualität und Rentabilität der isolierten Zellen.

Frisch isolierte ARVC Rod geformt sind. In den ersten Tagen des Anbaus verlieren sie die stabförmige Morphologie und Form Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung). Während dieser morphologischen Bildung ARVC zunächst verschlechtern ihre kontraktile Elemente, gefolgt von einer Reformation durch Aktin Stress Fasern und de Novo Sarcomerogenesis. Nach einer Woche des Anbaus die meisten ARVC zeigen eine weit verbreitete Erscheinung mit einem eindeutig nachweisbar Kreuz Streifenbildung. Dieser Prozess ist empfindlich auf intrazellulären Calcium-Konzentration, wie Behandlung mit Ionomycin Ausbreitung vermindert. Wichtigsten Marker in diesem Prozess der de - und re - differentiation sind β-Myosin heavy Chain (β-MHC), Oncostatin M (OSM) und Swiprosin-1 (EFHD2). Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass kardiale Re und de differentiation Auftritt unter Kulturbedingungen Funktionen gesehen in Vivo bei kardialen remodeling imitiert. Isolierung und Kultivierung ARVC spielen daher eine Schlüsselrolle für das Verständnis der Biologie der Herzmuskelzellen.

Einleitung

Adulten Herzmuskelzellen in Vivo Arbeit als eine elektrische Synzytien nach Zell-Zell-Kontakten zwischen Myozyten. Darüber hinaus werden sie von benachbarten Zellen wie kardialen Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen und Entzündungszellen¹beeinflusst. Um die Fähigkeit der Kardiomyozyten Anpassung ihrer intrazellulären Organisation zu studieren verändert Lastbedingungen, wie gesehen in Herzhypertrophie, die ein erster Schritt zur Herzinsuffizienz, die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen ventrikuläre Ratte führt Herzmuskelzellen (ARVC) ist notwendig^2,3,4. In der Vergangenheit wurden Kardiomyozyten zunächst isoliert von embryonalen Küken Herzen^5,6. Wenige Jahre später, wurde die erste Isolierung der unheilbar differenzierter Herzmuskelzellen mit Kalzium Erschöpfung⁷beschrieben. Allerdings diese adulten Kardiomyozyten waren nicht Kalzium tolerant und daher nicht für funktionelle Assays verwendet werden konnten. Schließlich, im Jahr 1976 ein neues Protokoll aktiviert Powell und Twist Erwachsenen ventrikuläre Herzzellen unter physiologischen Bedingungen⁸zu untersuchen. Als ersten Schritt isoliert sie Erwachsene Herzzellen unter niedrigen Kalzium-Konzentrationen und danach erhöhte Kalzium zu physiologischen Konzentrationen in einem schrittweisen Verfahren. Heute die meisten Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten arbeiten mit diesem Kalzium-Protokoll und Kollagenase für die enzymatische Verdauung von dichten Zell-Zell Kontakte¹verwenden.

Für einen erfolgreichen Anbau ist fetalen Kälberserum (FCS) oder Oncostatin M (OSM) erforderlich. ARVC führen eine de - und re - differentiation mit umfangreichen strukturellen Veränderungen einschließlich Sarkomers Demontage und Reformation^9,10,11,12. Dieser Prozess ist durch einen erneuten Ausdruck der fetalen Typ Gene, wie β-Myosin heavy Chain (β-MHC) begleitet, wie man von Hypertrophie und eine Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen, auch genannt Verbreitung^{4,11, 13}. Darüber hinaus Swiprosin-1 (EFHD2), ein neu identifizierten Protein spielt eine wichtige Rolle bei der erneuten Differenzierung der kultivierten ARVC¹¹. Infolgedessen ARVC in Kultur verwandeln sich in weit verbreiteten, polymorphe Zellen, die Kontraktionen spontan nach zwei bis drei Wochen in Kultur^2,4,14zeigen.

Die jüngsten Entdeckungen haben gezeigt, dass kardiale Re und de differentiation wie sie unter Kulturbedingungen Mimik Auftritt gesehen in Vivo während kardiale Umbau^10,15bietet. Kardialen remodeling ist ein Schlüsselprozess bei Herzkrankheiten¹⁶. Da Herzerkrankungen noch die häufigste Todesursache in den industrialisierten Gesellschaften sind, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der Biologie der adulten Kardiomyozyten (wer, 2015). Isolierung und Kultivierung ARVC können helfen, um neue Strategien und Medikamente für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Mit diesem Manuskript ist ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ARVC zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden einige kritische Teile dieser Methode in die Diskussion Abschnitt hervorgehoben.

Protokoll

die Untersuchung nach der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die US National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-23, revidiert 1996) veröffentlicht. In der Regel männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 bis 4 Monaten und mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250-350 g sind für dieses Protokoll verwendet. Eine Ratte Herz ist ausreichend für 20 Kultur Gerichte (1 mL pro Schale; innen-ø: 35 mm) mit einer ungefähren Zelldichte von 1,5 x 10 ⁴ Zellen/1000 mm ².

1. Vorbereitung der Medien und Reagenzien

1. Kreatin Carnitin Taurin Medium (CCT Medium)
   Hinweis: CCT Medium ist ein komplexes Medium basierend auf Medium 199 mit dem Zusatz von Kreatin, Carnitin und Taurin.
   1. Bereiten Sie 1 L Medium 199: 3,6 g Hepes und Mix hinzufügen und für 1 h. Dann fügen Sie 655,5 mg Kreatin (5 mM), 395,4 mg Carnitin (2 mM) und 625,5 mg Taurin (5 mM). Carnitin und Taurin ändern pH bis < 7. Um das Wachstum von kontaminierenden Zellen, z. B. Endothelzellen und Fibroblasten hemmen, fügen Sie 10 µM Cytosin β-D-Arabinofuranoside auf das Medium. Den pH mit NaOH (2 mM) auf 7,4 und steriler Filter das Medium anpassen. Speichern der CCT-Medium bei 4 ° c
2. Powell Medium
   1. für 1 L Powell Medium lösen 6,43 g NaCl (110 mM) mit 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH ₂ PO ₄ (1,2 mM), 0,3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM), und 1,98 g D (+ )-Glucose-Monohydrat (10 mM) in sterilen Aqua. 7.4 und steriler Filter Medium pH mit NaOH (2 M) passen. Shop-Powell-Medium bei 4 ° c
3. Kalzium-Chlorid (CaCl ₂)
   1. vorbereiten eine 100 mM CaCl ₂-Lösung (50 mL) und bereiten Aliquote mit 500 µL CaCl ₂. Einfrieren der Aliquote bei-20 ° c
4. Vorbereitung Kulturmedium
   1. bereiten drei Zelle Nährböden: Pre-Beschichtung, Medium, Beschichtung, und Waschmedium. Verwenden Sie CCT-Medium für alle drei Medien (Tabelle 1) als Grundlage. CCT-Medium mit 1 mL pro Kulturschale zu berechnen. Daher bereiten 20 mL CCT Medium für 20 Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 35 mm).
   2. Zelle Kultur Platten: jede Kultur Zellplatte zu beschichten (Innendurchmesser: 35 mm) mit 1 mL Pre-plating Medium. Die beschichteten Platten bei 37 ° C über Nacht oder mindestens 2 Stunden vor der Verwendung zu speichern.

2. Isolierung von adulten Kardiomyozyten

1. Vorbereitung von Langendorff Perfusion System
   1. erhitzen, Beschichtung und Waschmedium auf 37 ° c ein Rohr von 500 µL CaCl ₂ aufzutauen und wiegen 25 mg Kollagenase.
   2. Bündig Langendorff Perfusion System mit Aqua-steril, danach lassen Sie Powell Medium zirkuliert das System für 5 min.
   3. 80 mL Powell Medium Langendorff Perfusion System einfüllen, ohne irgendwelche Bläschen und Gas das Medium mit 95 % Sauerstoff air.
   4. Bereiten Sie eine Tube (50 mL) mit 40 mL Powell Medium, auf 37 ° C erwärmen und mit 95 % Sauerstoff gas.
   5. Bereiten Sie einen Thread von ca. 25 cm Länge zur Befestigung entfernt mitten auf die Kanüle.
   6. Entfetten eine Rasierklinge mit Alkohol (70 % nach Volumen) und befestigen Sie ihn an den Häcksler. Klemmen Sie eine Kunststoffscheibe in den Häcksler.
2. Extraktion des Herzens
   1. eine männliche Wistar-Ratten mit 4 % bis 5 % Isofluran zu betäuben und mit zervikale Dislokation zu opfern. Öffnen Sie den Bauch hinter den Rippenbögen mit einem Bauch Scherkräften und mit der gleichen Schere, Schnitt durch die Membran der Brusthöhle öffnen.
   2. Entfernen Sie das Herz mit der Lunge und Thymus, durch Schneiden oben hoch kranialen Thymus in der Brusthöhle. Übertragen Sie das Material sofort auf eiskalten Salzlösung.
   3. Der Lunge und Thymus aus dem Herzen mit einer sezierenden Schere (groß) zu entfernen und durch das Material mit der Kapsel Pinzette fixieren, letztere auf eine neue Kochsalzlösung übertragen.
3. Isolation
   1. entfernen überschüssiges Gewebe, wie Rückstände aus Thymus, Luftröhre, Fett und Bindegewebe aus dem Herzen mit Kapsel Zange und einen sezierenden Schere (groß oder klein). Aufdecken die Aorta und trennen Sie es mit einer sezierenden Schere (groß oder klein) zwischen der ersten und zweiten Kiemen Arch
   2. Starten das Abtropfen von Langendorff Perfusion System. Platzieren Sie das Herz an der Kanüle von Langendorff Perfusion System und fixieren Sie es zuerst mit einem Krokodil-Klemme und später mit dem vorbereiteten Thread. Spülen Sie das Herz, bis es frei von Blut ist.
   3. 25 mg Kollagenase in 5-6 mL warmen Powell Medium auflösen und Hinzufügen von 12,5 µL CaCl ₂ (30 µM).
   4. Verkehr in unmittelbarer Nähe ein Glastrichter, verbunden mit dem Langendorff Perfusion System, über das tropfende Herz bewegt und die Perfusion System gelöst Kollagenase hinzufügen. Starten Sie die Durchblutung für 25 min mit einer Drop-Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde.
      Hinweis: Während der Perfusion, das Herz wird anschwellen und eine wachsartige aussehen.
   5. Die Perfusion nach 25 min zu stoppen und das Herz aus dem Langendorff Perfusion System entfernen. Der Aorta, Atrien und Bindegewebe aus dem Herzen zu entfernen, und öffnen Sie die Rechte und linke Ventrikel.
   6. Hacken das Herz zweimal in einem Winkel von 90° (Schnittbreite: 0,7 mm; Geschwindigkeit: 0,15 cm/s). Wiederholen Sie diesen Vorgang manuell mit zwei Skalpelle für 10 s pro Seite.
   7. 12 mL des Mediums Perfusion überführen in ein neues Gefäß (50 mL). Gießen Sie die Zelle Gülle in dieses Medium und Digest Zellen für weitere fünf Minuten bei 37 ° C. Mix Lösung jede Minute.
   8. Die Lösung mit dem verdauten Herzen durch eine Nylon-Mesh (200 µm) in ein neues Gefäß (50 mL) zu filtern.
   9. Zentrifugieren die filtrierte Lösung bei 29 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und 6 mL warmen Powell Medium darunter 12,5 µL CaCl ₂ (250 µM), die Zelle Pellet hinzufügen. Das Pellet durch glatte zitternden Bewegungen aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie wieder bei 29 X g für 2 min. überstand verwerfen und 6 mL warmen Powell Medium mit 25 µL CaCl ₂ (500 µM) ersetzt. Auflösen der Zelle Pellet durch sanftes Schütteln Bewegungen und fügen 12 mL warmen Powell mittlere einschließlich 120 µL CaCl ₂ (1 mM). Zentrifuge für ein drittes Mal bei 16 X g für 1 min. Wieder entfernen des Überstands.
   10. Mischen die Zelle Pellet mit dem vorgewärmten Beschichtung Medium.
   11. Pre-Beschichtung Medium aus Kultur Platten entfernen. 1 mL Plattieren Medium, einschließlich der isolierten Kardiomyozyten auf jede Kultur-Platte zu übertragen. Inkubieren Sie frische isolierte Kardiomyozyten bei 37 ° C für 1 h
   12. Entfernen der Beschichtung Medium von Kultur-Platten. Fügen Sie 1 mL Waschmedium auf jede Kultur-Platte und die Platten bei 37 ° C bis zu sechs Tage ohne Ändern des Mediums speichern.
   13. Zur Untersuchung des Einfluss der verschiedenen Chemikalien und Behandlungen auf ARVC, zuerst aktualisieren Beschichtung Medium indem Waschmedium und danach verschiedene Chemikalien.
       Hinweis: Auswertung mit Lichtmikroskopie: mit jeder Zelle Vorbereitung, 150 bis 300 Kardiomyozyten sollte pro Tag von Lichtmikroskopie überwacht werden. Alle gezählte Kardiomyozyten nach ihrem Auftritt in Gruppen zu unterteilen (z. B. " stabförmigen ", " abrunden ", " Verbreitung ", und " ungewöhnliches Aussehen "). Die Kategorie " Verbreitung " umfasst alle Herzmuskelzellen mit Pseudopodien-ähnlichen Strukturen. " Ungewöhnliches Aussehen " umfasst alle ARVC mit einer unregelmäßigen Oberfläche und keine nachweisbaren intakte Zellmembran.

3. Beispiel Experimente

1. 1. Analyze morphologischen und strukturelle Umwandlungen von ARVC während des Anbaus durch konfokale Lasermikroskopie Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung der adulten Kardiomyozyten. Mithilfe von Phalloidin-TRITC F-Aktin Strukturen untersuchen " stabförmigen ", " abrunden ", und " verbreiten " ARVC. Führen Sie nach Angaben des Herstellers Färbung ' s-Protokoll. Ein Beispiel für Phalloidin-TRITC Färbung erhält in Referenz Nippert Et al. ¹¹. mit Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung, Unterschiede in der de - und re - differentiation des kontraktilen Apparates in kultivierten adulten Kardiomyozyten zwischen experimentelle Behandlungen (z. B. mit Swiprosin-1, Ionomycin) untersucht werden können.
2. Echtzeit-quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
   1. durchführen qRT-PCR um Veränderungen in der mRNA Expression verschiedener Gene zu untersuchen (z. B. OSM, Swiprosin-1, β-MHC) während des Anbaus der ARVC. Für ausreichende Stichprobengröße verwenden größere Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 60 mm) mit 2 mL Volumen. ARVC fünf Kultur Gerichte ergibt eine Probe. Isolierung von mRNA und Transformation der cDNA nach Angaben des Herstellers durchführen ' s Protokoll.
3. Immunoblot-Techniken
   1. führen Western Blots, Änderungen im Protein-Expression (z. B. für Swiprosin-1) während des Anbaus der ARVC zu untersuchen. Verwenden einer Kulturschale (1 mL) pro Probe.

Ergebnisse

Erwachsenen Herzzellen in Kultur: Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über frisch isolierte adulten Kardiomyozyten 2 h nach dem letzten waschen. Etwa 75 % aller Herzzellen hatte eine stabförmige Morphologie. Die restliche 25 % zeigten eine ungewöhnliche Erscheinung mit einer Runde Morphologie und keine nachweisbaren intakte Zellmembran (Abbildung 1). Am Ende des Anbaus (6. Tag), bis zu 15 % der alle Herzmuskelze...

Diskussion

Das Verhalten der Erwachsenen Herzzellen in Vivo ist beeinflusst durch viele Interaktionen mit anderen Zellen (z.B.Neuronen, Endothelzellen, Fibroblasten, Entzündungszellen) und die elektrischen Synzytien bilden sie¹. Studium Stress Anpassung der adulten Kardiomyozyten ausschließlich erfordert daher, die Isolierung und Kultivierung ARVC. Die wichtigsten Auswirkungen der Isolierung und Kultivierung ARVC sind: 1) trennen sie von der extrazellulären Matrix und Zell-Zell Kontakte;...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177