절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

요약

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

초록

그대로 마음에 인접 한 셀 성인 cardiomyocytes 영향. 격리의 방법 및 성인 cardiomyocytes의 경작, 및 특정 환경에서 이러한 셀의 동작의 정확한 조사 가능 하다. 이 원고는 성공적인 격리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제공합니다.

쥐 자 궁 경부 전위 깊은 마 취에 의해 희생 이다. 그런 다음 심장 추출 되 고 대동맥 적용 되지 않습니다. 그 후, 관류 칼슘 소모와 콜라 치료 Langendorff 관류 시스템에서 수행 됩니다. 나중에, 심 실 조직 되 면 다진, 다시 유통, 필터링, 생리 적인 칼슘 농도 도달할 때까지 점진적 추가 CaCl₂ 3 원심 분리 단계 뒤. ARVC 셀 문화 요리에 도금 된다. 세포 배양 후, ARVC 수 재배 최대 6 일 동안 혈 청에 포함 된 문화 매체를 변경 하지 않고. ARVC의 격리 칼슘 민감한 과정 이다입니다. 세포내 칼슘 농도 있는 작은 변화 일으킬 품질 및 고립 된 세포의 생존 능력에 있는 감소.

갓 절연 ARVC 막대 모양입니다. 재배의 첫 번째 일 이내 그들은 손실 막대 모양의 형태와 양식 pseudopodia 같은 구조 (확산). 이 형태 형성 동안 ARVC는 처음 이어서 걸 스트레스 섬유와 드 노 보 sarcomerogenesis 통해 개혁 그들의 수축 성 요소 저하. 재배의 1 주일 후 대부분 ARVC 명확 하 게 감지 크로스 줄무늬와 광범위 한 모습을 보여줍니다. 이 과정은 ionomycin와 치료 약하게 확산으로 세포내 칼슘 농도에 민감 하다. 이 과정을의 드-하 고 다시-differentiation 키 표식은 β myosin 무 겁 사슬 (β-MHC), oncostatin M (OSM), 및 swiprosin-1 (EFHD2) 있습니다. 최근 연구는 심장 개장 동안 기능 본 vivo에서 모방 심장 다시 de differentiation 발생 문화 조건 하에서 제안 했다. 따라서, 절연 및 ARVC의 재배 cardiomyocytes의 생물학 이해에 중요 한 역할을 재생 합니다.

서문

Vivo에서 성인 cardiomyocytes는 전기 syncytium myocytes 사이 셀 연락처를 기반으로 작동 합니다. 또한, 그들은 심장 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 세포, 염증 세포¹같은 인접 한 세포에 의해 영향을 받습니다. 초기 단계를 선도 하 고 심장 마비, 분리와 성인 심 실 쥐의 심장 비 대, 동안 본 부하 조건 변경 cardiomyocytes의 능력을 그들의 세포내 조직 적응을 공부 하기 위하여 cardiomyocytes (ARVC)는 필요한^2,,34. 역사적으로, cardiomyocytes가 했다 미 발달 병아리 마음^5,6에서 격리 된 처음. 몇 년 후, 말기 차별화 cardiomyocytes의 첫 번째 절연 칼슘 고갈⁷을 사용 하 여 설명 했다. 그러나, 이러한 성인 cardiomyocytes 칼슘 허용 되었고 따라서 하지 사용 될 수 있는 기능 분석 실험. 마지막으로, 1976 년에 새로운 프로토콜 활성화 파월과 트위스트 생리 조건⁸에서 성인 심 실 cardiomyocytes 조사. 첫 번째 단계로 서, 그들은 낮은 칼슘 농도 및 생리 적인 농도 단계적 절차에서 그 후 증가 칼슘 성인 cardiomyocytes 고립. 오늘, 분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 대부분의 프로토콜이 칼슘 프로토콜을 사용 하 고 조밀한 셀 연락처¹의 효소 소화에 콜라를 사용 합니다.

성공적인 재배 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 oncostatin M (OSM)가 필요 합니다. ARVC 수행는 데-그리고 다시-differentiation sarcomere 해체와 개혁^9,10,,1112를 포함 하 여 광범위 한 구조 변경 합니다. Β-myosin 무거운 체인 (β-MHC) 처럼 태아 형 유전자의 재 식이이 과정 동반 비, 및 pseudopodia 같은 구조, 퍼지는^4,11, 이라고의 형성에서 알려진 ¹³. swiprosin-1 (EFHD2), 새로 확인된 된 단백질 재배 ARVC¹¹의 재 분화는 주요 역할을 수행 하는 또한. 그 결과, ARVC 문화에 광범위 하 게, 다형성 셀 문화^2,4,14에서 2 ~ 3 주 후 저절로 수축을 표시 하는 변환.

최근의 발견을 심장 다시 de differentiation 모방 문화 조건 하에서 발생 하는 대로 본 기능 vivo에서 심장 개장^10,15동안 밝혀졌다. 개장 하는 심장 심장 질환¹⁶동안 핵심 과정 이다. 심장 질환은 여전히 산업화 사회에서 죽음의 주요 원인, 성인 cardiomyocytes의 생물학의 더 나은 이해 중요 하다 (누가, 2015). 절연 및 ARVC의 새로운 전략 및 심장 질환의 치료에 대 한 의약품 개발을 도울 수 있다. 이 원고와 분리와 ARVC의 재배에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 방법의 몇 가지 중요 한 부분 토론 섹션에서 강조 표시 됩니다.

프로토콜

조사 관리 및 사용의 실험실 동물은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 의해 출판에 대 한 가이드에 따라 실시 됩니다. 일반적으로, 남성 wistar 쥐 3 ~ 4 개월을 세 고 250-350 g의 평균 무게와 더불어이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다. 한 쥐 마음은 20 문화 요리에 대 한 충분 한 (접시 당 1 mL; 내부 직경: 35mm) 10 ⁴ 셀/1000 m m ² x 1.5의 대략적인 셀 밀도와.

1. 미디어의 준비 및 시 약

1. Creatine-carnitine-황소자리 매체 (CCT 매체)
   참고: CCT 매체는 매체 199 creatine, carnitine, 그리고 황소자리의 추가 따라 복잡 한 매체 이다.
   매체 199의
   1. 준비 1 L: 3.6 g Hepes, 1 시간에 대 한 믹스에 추가. 다음 655.5 mg creatine (5mm), 395.4 mg carnitine (2mm), 625.5 mg 황소자리 (5 m m)를 추가 합니다. Carnitine와 황소자리에 pH를 변경 < 7. 어떤 오염 셀, 예를 들면 내 피 세포 또는 섬유 아 세포의 성장을 억제 하기 위해 매체에 10 µ M 시 토 신 β-D-arabinofuranoside를 추가 합니다. 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 mM)와 pH를 조정 합니다. CCT 매체 저장 4 ° c.
2. 파월 매체
   1. 1 L 파월 매체에 대 한 해산 6.43 g NaCl (110mm) 0.19 g KCl (2.5 m m), 0.16 g KH ₂ 포 ₄ (1.2 m m), 0.3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1.2 m m), 5.96 g Hepes (25 m m), 그리고 1.98 g (+ D )-아쿠아 살 균에서 포도 당 monohydrate (10 mM). 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 M)와 pH를 조정 합니다. 스토어 파월 매체 4 ° c.
3. 칼슘 염화 물 (CaCl ₂)
   1. 100mm CaCl ₂ 솔루션 (50 mL)을 준비 하 고 포함 된 500 µ L CaCl ₂ aliquots를 준비. Aliquots-20에서 동결 ° c.
4. 문화 매체의 준비
   1. 준비 3 셀 문화 매체: 매체, 도금 매체, 및 세척 매체 중 도금. CCT 매체를 사용 하 여 모든 3 개의 매체 (표 1)에 대 한 기준으로. CCT 매체 문화 접시 당 1 mL로 계산 합니다. 따라서, 20 문화 요리 20 mL CCT 매체를 준비 (내부 직경: 35mm).
   2. 셀 문화 접시: 각 셀 문화 플레이트 코트 (내부 직경: 35mm) 사전 도금 매체 1 mL와 함께. 사용 하기 전에 적어도 2 시간 또는 하룻밤 37 ° C에서 코팅된 판 저장.

2. 성인 Cardiomyocytes의 절연

1. Langendorff 준비 관류 시스템
   1. 열 도금 매체 및 세척 매체 37 ° C. Defreeze 500 µ L CaCl ₂의 튜브와 콜라의 25 mg에 무게.
   2. 플러시 Langendorff 관류 시스템과 아쿠아 살 균, 이후에 파월 중간 5 분에 대 한 시스템을 순환 하 게
   3. Langendorff 관류 시스템을 80 mL 파월 매체 채울 없이 어떤 공기 거품 및 가스 95% 산소 매체.
   4. 40 mL 파월 매체와 튜브 (50 mL)를 준비 하 고, 37 ° C에가 열 하 고 95% 산소 가스.
   5. 길이 약 25 ㎝의 스레드는 정 맥을 제거 마음을 연결에 대 한 준비.
   6. Degrease 면도날 알코올 (볼륨 70%) 하 고 헬기에 그것을 건다. 헬기에 플라스틱 디스크 클램프.
2. 심장의 추출
   1. 4% ~ 5 %isoflurane 남성 wistar 쥐를 Anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위와 희생. 늑 골 아치 뒤에 복 부는 복 부 전단으로 열고, 흉 강 여 다이어 프 램을 통해 잘라가 위의 동일한 쌍.
   2. 흉 강에 매우 두개골 thymus 위에서 절단 하 여 폐와 흉 선, 심 혼을 제거합니다. 얼음 처럼 차가운 소금물에 자료를 즉시 전송.
   3. 해 시저 (대형)와 심장에서 폐와 흉 선 제거 및 캡슐 집게와 자료를 편집증으로 전송 후자 새로운 염.
3. 격리
   1. 캡슐 집게 해 시저 (크거나 작은)을 사용 하 여 심장에서 thymus, 기관, 지방, 결합 조직의 잔류물 처럼 과잉 조직을 제거. 대동맥을 폭로 하 고 첫 번째 및 두 번째 아가미 arch. 사이 해 시저 (크거나 작은)와 그것을 끊다
   2. 는 Langendorff 관류 시스템의 떨어지는 시작. Langendorff 관류 시스템의 정에 마음을 놓고 먼저 준비 스레드 나중 악어 클램프와 그것을 흥분 시키는. 그것은 혈액의 무료 때까지 마음을 린스.
   3. 25mg 콜라 5-6 mL 따뜻한 파월 매체에 녹이 고 12.5 µ L CaCl ₂ (30 µ M).
   4. 는 떨어지는 마음 위에 Langendorff 관류 시스템과 연결 되어 유리 깔때기를 이동 하 여 순환 닫고 관류 시스템 해결된 콜라를 추가 합니다. 초당 1 방울의 드롭 속도 25 분 동안 관류 시작.
      참고: 관류, 하는 동안 심장 팽창 되며 밀랍 모양의 얻을.
   5. 25 분 후 관류를 중지 하 고 마음 Langendorff 관류 시스템에서 제거. 심장에서 대동맥, 심 방, 및 결합 조직 제거 하 고 오른쪽과 왼쪽 심 열.
   6. 잘라 두 번 90 °의 각도에서 심장 (절단 폭: 0.7 m m, 속도: 0.15 cm/s). 10 두 scalpels와 수동으로이 과정을 반복 s 각 면.
   7. 새 튜브 (50 mL)에 관류 매체의 12 mL를 전송합니다. 37 또 다른 5 분 동안이 매체 및 다이제스트 셀에 셀 슬러리를 붓고 ° C. 믹스 솔루션 매분마다.
   8. 새 튜브 (50 mL)에 나일론 메쉬 (200 µ m)를 통해 소화 마음으로 솔루션 필터.
   9. 원심 29 x g 3 분 삭제에 필터링된 솔루션은 상쾌한 고 12.5 µ L CaCl ₂ (250 µ M) 셀 펠 릿을 포함 하 여 6 mL 따뜻한 파월 매체를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 펠 릿 resuspend 다시 2 분 삭제는 상쾌한 29 x g에서 원심을 6 mL 따뜻한 파월 매체 대체 25 µ L CaCl ₂ (500 µ M)를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 셀 펠 릿을 녹이 고 12 mL 따뜻한 파월 중간 포함 120 µ L CaCl ₂ (1 mM) 추가. 1 분 16 x g에서 3 시간 동안 원심 분리기. 다시는 상쾌한 제거.
   10. 미리 따뜻하게 도금 매체와 셀 펠 릿 혼합.
   11. 배양 배지에서 사전 도금 매체를 제거합니다. 전송 매체, 절연된 cardiomyocytes 각 문화 접시를 포함 하 여 도금 1 mL. 1 헤 37 ° C에서 신선한 절연된 cardiomyocytes 품 어
   12. 배양 배지에서 도금 매체를 제거합니다. 각 문화 접시를 세척 1 mL를 추가 하 고 매체를 변경 하지 않고 6 일 37 ° C에서 접시를 저장.
   13. 다른 화학 물질과 ARVC에 치료의 영향 조사, 먼저 매체를 세척 하 고 그 후 다른 화학 물질을 추가 하 여 도금 매체를 새로.
       참고: 가벼운 현미경 검사 법 평가: 각 셀 준비, 150 ~ 300 cardiomyocytes 모니터링 해야 하루 가벼운 현미경 검사 법에 의해. 모든 계산된 cardiomyocytes 그들의 모양에 따라 그룹으로 세분화 (예를 들어, " 막대 모양 ", " 다운 라운드 ", " 확산 ", 및 " 특이 한 모양을 "). 카테고리 " 확산 " pseudopodia와 같은 구조를 가진 모든 cardiomyocytes 포함. " 특별 한 모양을 "는 불규칙 한 표면 가진 모든 ARVC 및 없음 감지 그대로 세포 막.

3. 예를 들어 실험

1. 1. 분석 형태학 및 구조 변환 ARVC의 공초점 레이저 현미경 검사 법에 의해 재배 중 형광/면역 형광 성인 cardiomyocytes의 얼룩. Phalloidin-TRITC를 사용 하 여 F-말라 구조 조사 " 막대 모양 ", " 다운 라운드 ", 및 " 확산 " ARVC. 제조 업체에 따라 얼룩 수행 ' s 프로토콜. Phalloidin-TRITC 얼룩에 대 한 예로 참조 Nippert 외에 주어진 ¹¹. 면역 형광 형광/얼룩과 차이에 드-하 고 다시-differentiation 재배 성인 cardiomyocytes 실험적 치료 (예를 들어,와 사이에서 수축 성 기구의 Swiprosin-1, ionomycin) 조사 수.
2. 실시간 양적 RT-PCR (qRT-PCR)
   1. 다른 유전자의 mRNA 표현에서 변화를 조사 하기 위해 qRT-PCR을 수행 (예를 들어, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) ARVC의 재배 중. 충분 한 샘플 크기에 대 한 더 큰 문화 요리 사용 (내부 직경: 60 m m) 2 mL 볼륨. 5 문화 요리 ARVC 한 샘플을 생성합니다. MRNA의 절연 및 변환 제조 업체에 따르면 cDNA의 수행 ' s 프로토콜.
3. Immunoblot 기법
   1. 수행 서 몰아내고 단백질 식 (예를 들어, Swiprosin-1) ARVC의 경작 동안에 변화를 조사. 샘플 당 하나의 문화 접시 (1 mL)을 사용 하 여.

결과

문화에서 성인 cardiomyocytes: 그림 1 마지막 세척 후 갓 절연된 성인 cardiomyocytes 2 h에 대 한 개요를 보여 줍니다. 모든 cardiomyocytes의 약 75%는 막대 모양의 형태를 했다. 나머지 25%는 둥근 형태와 전혀 감지 그대로 세포 막 (그림 1) 특이 한 모습을 보여주었다. 최대 재배 (6 일)의 끝에 pseudopodia 같은 구조 없이 둥근 형태에 ...

토론

성인 cardiomyocytes에 vivo에서 의 행동은 다른 셀 (예:신경 세포, 내 피 세포, 섬유 아 세포, 염증 세포)와 그들이 형성 하는 전기 syncytium 많은 상호 작용에 의해 영향을¹. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 스트레스 적응을 독점적으로 공부 해야 분리와 ARVC의 재배 합니다. 분리 하 고 ARVC를 재배의 주요 효과: 1) 기질과 셀 연락처;에서 그들을 분리 2) 수축 자극;에서 그들을 분리 3...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177