Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

Özet

Burada, yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı için bir iletişim kuralı mevcut. İzole R.V.C kısa ve uzun vadeli tarım için kullanılabilir. Yalıtım ve R.V.C ekimi kalp hastalıkları için yeni tedavi rejimlerinin geliştirilmesi önemli bir rol oynayabilir.

Özet

Sağlam bir kalp içinde yetişkin cardiomyocytes bitişik hücreleri etkiler. Bu hücre spesifik tedaviler ve ortamları altında davranışının kesin bir soruşturma yalıtım yöntemi ve yetişkin cardiomyocytes ekimi ile mümkündür. Bu el yazması için bir protokolü başarılı yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı sunar.

Sıçan tarafından derin anestezi altında servikal çıkığı feda etti. O zaman, kalp çıkarılan ve aort damarı ortaya olduğunu. Daha sonra perfüzyon Langendorff perfüzyon sistemi kalsiyum azalması ve collagenase tedavi ile gerçekleştirilir. Daha sonra ventrikül doku kıyılmış, yeniden sirküle ve filtre, üç Santrifüjü adım CaCl₂ kademeli eklenmesi ile fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu ulaşılana kadar izledi. R.V.C hücre kültür yemekleri üzerinde kaplama. Hücre kültür orta yenilemeden sonra R.V.C altı güne kadar serum içeren kültür orta değiştirmeden ekili olabilir. R.V.C yalıtım kalsiyum hassas bir işlemdir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu küçük değişiklikler kalite ve canlılığı izole hücrelerinin azalmasına neden.

Taze izole R.V.C çubuk şeklinde uygulanır. Ekimi ilk gün içinde (yayılan) çubuk şeklinde morfoloji ve form pseudopodia benzeri yapıları kaybediyorlar. Bu morfolojik oluşumu sırasında R.V.C başlangıçta bir reformasyon aktin stres lifleri ve de novo sarcomerogenesis ardından contractile öğelerini bozulmasına yol açar. Ekimi bir hafta sonra en R.V.C yaygın bir görünümü ile açıkça tespit çapraz striation göster. İonomycin ile tedavi yaymak zayıflar gibi bu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için hassas bir işlemdir. Bu süreçte, de - ve yeniden - differentiation anahtar işaretleri β-myosin ağır zincir (β-MHC), oncostatin M (OSM) ve swiprosin-1 (EFHD2) vardır. Son çalışmalarda kalp re ve de differentiation kültür koşullarda meydana gelen özellikler görüldü vivo içinde kalp tadilat sırasında taklit olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, yalıtım ve R.V.C ekimi cardiomyocytes Biyoloji anlamada önemli bir rol oynar.

Giriş

Yetişkin cardiomyocytes in vivo hücre-hücre kişiler arasında miyositler dayalı bir elektrik syncytium olarak çalışıyorum. Buna ek olarak, kardiyak fibroblastlar, endotel hücreleri, sinir hücreleri ve inflamatuar hücre¹gibi bitişik hücreleri tarafından etkilenmektedir. Cardiomyocytes onların hücre içi kuruluşa uyum yeteneği çalışma için iş yükü koşullarının, hangi bir ilk adım kalp yetmezliği, yalıtım ve yetişkin ventrikül sıçan tarımı için lider kalp hipertrofisi sırasında görüldüğü gibi değişmiş cardiomyocytes (R.V.C) gerekli^2,3,4' tür. Tarihsel olarak, cardiomyocytes ilk embriyonik piliç kalpler^5,6ile izole edildi. Birkaç yıl sonra ölümcül farklılaşmış cardiomyocytes ilk yalıtım kalsiyum azalması⁷kullanarak tanımlanmıştır. Ancak, bu yetişkin cardiomyocytes kalsiyum dayanıklı değildi ve bu nedenle işlev deneyleri için kullanılamadı. Son olarak, 1976 yılında Powell ve Twist yetişkin Ventriküler cardiomyocytes fizyolojik şartlarda⁸altında incelemek için yeni bir iletişim kuralı etkinleştirilmiş. İlk adım olarak, onlar yetişkin cardiomyocytes düşük kalsiyum konsantrasyonu ve kademeli bir yordam fizyolojik konsantrasyonları bundan sonra artan kalsiyum altında izole. Bugün, yalıtım ve yetişkin cardiomyocytes ekimi için çoğu protokoller bu kalsiyum protokolü ile iş ve yoğun hücre-hücre kişiler¹Enzimatik sindirim için collagenase kullanın.

Başarılı bir tarım için fetal buzağı serum (FCS) veya oncostatin M (OSM) gereklidir. R.V.C gerçekleştirmek bir de - ve yeniden - differentiation sarcomere demontaj ve reformasyon^9,10,11,12de dahil olmak üzere kapsamlı yapısal değişiklikler ile. Bu işlem türü fetal genlerin, β-myosin ağır zincir (β-MHC) gibi yeniden ifadeye göre hipertrofisi ve yayılan^4,11, olarak da bilinir, pseudopodia benzeri yapıların oluşumu Bilindiği gibi eşlik ediyor ¹³. swiprosin-1 (EFHD2), yeni saptanan protein, Ayrıca, ekili R.V.C¹¹yeniden farklılaşma sürecinde önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, R.V.C kültür kendiliğinden kültür^2,4,142-3 hafta sonra kasılmalar göstermek yaygın, polimorfik hücrelere dönüşümü.

Son keşifler taklit eder kültür koşullar altında gerçekleştiği sırada kalp re ve de differentiation görülen vivo içinde kalp remodeling¹⁰sırasında^,15bulunduğunu ortaya çıkardı. Kardiyak remodeling anahtar işlemi sırasında kalp hastalıkları¹⁶' dır. Olarak kalp hastalıkları hala ölüm sanayileşmiş toplumlarda ana nedeni, Yetişkin cardiomyocytes Biyoloji daha iyi anlamak önemlidir (kim; 2015). Yalıtım ve R.V.C ekimi yeni stratejiler ve kalp hastalıklarının tedavisi için ilaç geliştirmek için yardımcı olabilir. Bu makale ile yalıtım ve R.V.C ekimi için bir protokol sağlanır. Ayrıca, bu yöntemin bazı kritik bölümleri tartışma bölümünde vurgulanır.

Protokol

soruşturma bakım ve kullanım laboratuvar bize Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (NIH yayın No 85-23, 1996 revize) Yayınlanan Hayvanlar için kılavuzuna göre yapılır. Genel olarak, erkek wistar fareler 3-4 ay yaşlı ve 250-350 g bir ortalama ağırlığı ile bu iletişim kuralı için kullanılır. Bir sıçan kalp 20 kültür yemekleri için yeterli (çanak başına 1 mL; iç çap: 35 mm) 1.5 x 10 ⁴ hücreleri/1000 mm ² yaklaşık hücre yoğunluğu ile.

1. medya hazırlık ve Kimyasalları

1. kreatin-karnitin-taurin orta (CCT orta)
   Not: SKK orta orta 199 kreatin, karnitin ve taurin ilavesi ile dayalı karmaşık bir orta olduğunu.
   1. Hazırlamak 1 L orta 199: 3,6 g Hepes ekleyip karıştırın 1 h için. O zaman 655.5 mg kreatin (5 mM), 395.4 mg karnitin (2 mM) ve 625.5 mg taurin (5 mM) ekleyin. Karnitin ve taurin değiştirmek için pH < 7. Herhangi bir bulaşıcı hücreleri, örneğin endotel hücreleri veya fibroblastlar büyümesini inhibe için 10 µM sitozin β-D-arabinofuranoside Orta olarak ekleyin. NaOH (2 mM) ile pH 7.4 ve steril filtre orta ayarlayın. Saat 4'te SKK orta saklamak ° C.
2. Powell orta
   1. 1 L Powell orta için 6,43 g NaCl (110 mM) 0,19 g KCl (2.5 mM), 0,16 g KH ₂ PO ₄ (1,2 mM), 0.3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1,2 mM), ile 5.96 g Hepes (25 mM), dağıtılması ve 1.98 g D (+ )-Aqua steril glukoz monohidrat (10 mM). NaOH (2 M) ile pH 7.4 ve steril filtre orta ayarlayın. Mağaza Powell orta 4 ° C.
3. Kalsiyum klorür (CaCl ₂)
   1. 100 mM CaCl ₂ çözüm (50 mL) ve aliquots içeren 500 µL CaCl ₂ hazırlayın. Aliquots -20, dondurma ° C.
4. Hazırlanması kültür orta
   1. hazırla üç hücre kültür ortamları: Orta, kaplama orta ve çamaşır orta Pre-Kaplama. SKK orta için tüm üç ortamlarda (Tablo 1) temel. SKK orta kültür çanak başına 1 mL ile hesaplayın. Bu nedenle, 20 mL SKK orta 20 kültür yemekleri için hazırlamak (İç Çap: 35 mm).
   2. Hücre kültür plakaları: her hücre kültür plaka kat (İç Çap: 35 mm) 1 mL orta Pre-Kaplama ile. Kaplamalı plakalar gecede 37 ° C'de veya en az 2 h için kullanmadan önce mağaza.

2. İzolasyon-in yetişkin Cardiomyocytes

1. Langendorff hazırlık perfüzyon sistemi
   1. ısı kaplama orta ve çamaşır orta 37 ° C. 500 µL CaCl ₂ tüp Defreeze ve collagenase içinde 25 mg tartmak.
   2. Floş Langendorff perfüzyon sistemi ile aqua steril, daha sonra Powell orta sistem 5 dakika süreyle dolaşımda izin
   3. Olmadan herhangi hava kabarcıkları ve gaz %95 oksijen ile orta Langendorff perfüzyon sistemi 80 mL Powell orta ile doldurulması.
   4. Bir tüp (50 mL) 40 mL Powell orta ile hazırlamak, 37 ° C ısı ve % 95 oksijen ile gaz.
   5. Kanül için kaldırılan kalp eklemek için bir iş parçacığı yaklaşık 25 cm uzunluğunda hazırlayın.
   6. Jilet alkol (Hacmen % 70) ile Isıtınız ve helikoptere tutturmak. Plastik bir disk helikopter kelepçe.
2. Kalp çıkarımı
   1. % 4-5 isoflurane bir erkek wistar fareyle anestezi ve servikal çıkığı ile kurban. Karın kostal kemerin arkasında bir karın kesme ile açın ve makas aynı çifti ile göğüs boşluğuna açmak için diyafram kesti.
   2. Kalp, akciğer ve timus, ile birlikte göğüs boşluğunda timus son derece beyin yukarıda keserek çıkarın. Malzeme buz gibi tuzlu eriyik-e doğru hemen transfer.
   3. Kessin makas (büyük) ile kalp akciğer ve timus kaldırmak ve malzeme ile kapsül forseps sabitliyor tarafından ikinci yeni bir serum fizyolojik çözüm transfer.
3. Yalıtım
   1. kapsül forseps ve parçalanmış makas (büyük ya da küçük) kullanarak kalp artıkları timus, Trakea, yağ ve bağ dokusu gibi aşırı doku kaldırmak. Aort damarı ortaya çıkarmak ve birinci ve ikinci bransiyal arch. arasında parçalanmış bir makas (büyük ya da küçük) ile sever
   2. Langendorff perfüzyon sistemi damlama başlatın. Kalp Langendorff perfüzyon sistemi kanül yerleştirin ve ilk bir timsah kelepçe ile ve daha sonra hazırlanan iplik ile bağlamak. Kalp kan boşalana kadar yıkayın.
   3. 25 mg Collagenase 5-6 mL sıcak Powell ortamda dağıtılması ve 12.5 µL CaCl ₂ (30 µM) ekleyin.
   4. Kan dolaşımı Langendorff perfüzyon sistemi ile damlama kalp üzerinde bağlı bir cam huni hareket ettirerek kapatın ve perfüzyon sistemi çözüldü collagenase ekleyin. Perfüzyon 25 min için saniyede 1 damla damla hızının başlayın.
      Not: perfüzyon sırasında kalp şişmeye ve balmumu bir görünüm olsun.
   5. 25 min sonra perfüzyon durdurmak ve kalp Langendorff perfüzyon sistemden kaldırmak. Kalpten aort, Kulakçık ve bağ dokusu kaldırın ve sağ ve sol ventriküllerin açın.
   6. Chop 90 ° açılı iki kez kalp (kesme genişliği: 0.7 mm; hız: 0.15 cm/s). 10 için el ile iki neşter ile bu işlemi tekrarlayın s her iki tarafı.
   7. Perfüzyon Orta 12 mL (50 mL) yeni bir tüp içine aktarın. 37 başka bir beş dakikalığına bu orta ve Özet hücrelere hücre Bulamaç dökün ° C. Mix her dakika çözüm.
   8. Naylon mesh (200 µm) yeni tüp (50 mL) içine sindirilmiş kalbine Çözümle filtre.
   9. , 29 x g 3 dk. atma filtre uygulanmış çözüm süpernatant santrifüj kapasitesi ve 12.5 µL CaCl ₂ (250 µM) hücre Pelet için de dahil olmak üzere 6 mL sıcak Powell orta ekleyin. Pelet pürüzsüz sallayarak hareketleri ile resuspend. 29 x g 2 dk. atma süpernatant için de yine santrifüj kapasitesi ve 6 mL sıcak 25 µL CaCl ₂ ile (500 µM) Powell orta yerine ekleyin. Hücre Pelet nazik sallayarak hareketleri aracılığıyla dağıtılması ve 12 mL sıcak Powell orta dahil 120 µL CaCl ₂ (1 mM) ekleyin. Santrifüj 16 x g bir üçüncü kez 1 dk için. Yine, süpernatant kaldırmak.
   10. Hücre Pelet ile Önceden ısıtılmış kaplama orta mix.
   11. Öncesi kaplama orta kültür plakalar kaldırın. 1 mL her kültür plaka için izole cardiomyocytes de dahil olmak üzere Orta, kaplama aktarın. Taze izole cardiomyocytes için 1 h. 37 ° C'de kuluçkaya
   12. Kaplama orta kültür plakalar kaldırın. 1 mL orta ve her kültür plaka yıkama ekleyin ve 37 ° C'de plakaları için altı gün orta değiştirmeden stok ilâ.
   13. Farklı kimyasallar ve R.V.C tedavisi etkisini araştıran için önce yenilemeniz kaplama orta orta yıkama ve bundan sonra farklı kimyasallar ekleyerek.
       Not: Değerlendirme ışık mikroskobu ile: her hücre hazırlık ile 150-300 cardiomyocytes günlük ışık mikroskobu tarafından takip edilmelidir. Tüm sayılan cardiomyocytes görünüşlerine göre gruplar halinde alt bölümlere (Örneğin, " çubuk şeklinde ", " yuvarlak aşağı ", " yayılan ", ve " sıradışı görünümü "). Kategori " yayılan " pseudopodia benzeri yapıları ile tüm cardiomyocytes içerir. " Sıradışı görünümü " tüm R.V.C bir düzensiz yüzeyli ve tespit yok sağlam hücre zarı içerir.

3. Örnek Deneyler

1. 1. analiz morfolojik ve yapısal dönüşüm R.V.C ekimi confocal lazer mikroskobu tarafından sırasında Yetişkin cardiomyocytes Floresans/ayirt boyama. F-aktin yapılarını araştırmak için Phalloidin-TRITC kullanın " çubuk şeklinde ", " yuvarlak aşağı ", ve " yayılan " R.V.C. Üreticiye göre boyama gerçekleştirmek ' s protokolü. Phalloidin-TRITC boyama için bir örnek başvuru Nippert ve ark. verilir ¹¹. Floresans/ayirt boyama ile içinde de - ve yeniden - differentiation deneysel tedaviler (Örneğin, ile arasında ekili yetişkin cardiomyocytes contractile cihazları farklılıkları Swiprosin-1, ionomycin) soruşturma olmaktır.
2. Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)
   1. farklı genler mRNA ifadesi değişiklikleri öğrenmek için qRT-PCR gerçekleştirmek (Örneğin, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) R.V.C ekimi sırasında. İçin yeterli örnek boyutu, daha büyük kültür yemekleri kullanın (iç çapı: 60 mm) 2 mL cilt ile. R.V.C beş kültür yemekleri bir örnek verir. MRNA izolasyonu ve cDNA üreticiye göre dönüşümü gerçekleştirmek ' s protokolü.
3. Immunoblot teknikleri
   1. gerçekleştirmek Western protein ifade (Örneğin, Swiprosin-1) R.V.C ekimi sırasında değişiklikleri öğrenmek için engelliyor. Örnek başına bir kültür çanak (1 mL) kullanın.

Sonuçlar

Yetişkin cardiomyocytes kültür: Şekil 1 son yıkandıktan sonra taze izole yetişkin cardiomyocytes 2 h özetini gösterir. Tüm cardiomyocytes yaklaşık % 75'i çubuk şeklinde bir kara delik vardı. Kalan %25 yuvarlak bir morfoloji ve hiçbir tespit sağlam hücre zarı (şekil 1) ile sıradışı bir görünüm gösterdi. Ekimi (6 gün), ilâ sonundaki yayılan, tüm cardiomyocytes % 15 gösterdi yaklaş?...

Tartışmalar

Yetişkin cardiomyocytes in vivo davranışını diğer hücreleri (örneğin, nöronlar, endotel hücreleri, fibroblastlar, inflamatuar hücreler) ve onlar oluşturan elektrik syncytium ile pek çok etkileşimler tarafından etkilenir¹. Bu nedenle, Yetişkin cardiomyocytes uyarlaması stres sadece eğitim yalıtım ve R.V.C ekimi gerektirir. İzole ve R.V.C yetiştirilmesi ana etkileri: 1) kesmeden hücre dışı matriks ve hücre-hücre kişiler; 2) contractile uyaranlara kesme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177