إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

Summary

ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد ليغومرات Aβ من ببتيد اصطناعية في المختبر وتقييم الكميات النسبية من Aβ oligomer بنقطة النشاف التحليل.

Abstract

اميلويد بيتا (Aβ) ببتيد مسعور مع اتجاه جوهرية لتجميع ذاتي في المجاميع. بين مجاميع مختلفة، Aβ oligomer مقبول على نطاق واسع عصبي الرائدة في التقدم لمرض الزهايمر (AD) ويعتبر أن الحدث الحاسم في الآلية المرضية للإعلان. ولذلك، قد منع نيوروديجينيريشن مثبطات oligomer Aβ ويمكن أن توضع كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. ومع ذلك، تشكيل مختلف بروتوكولات Aβ oligomer قد تؤدي إلى ليغومرات ذات خصائص مختلفة. وعلاوة على ذلك، لا توجد العديد من الطرق لفعالية الشاشة Aβ_1-42 مثبطات أوليجومير. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية أوليجومير_1-42 Aβ السمية مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية إعداد نموذج Aβ A11-إيجابية غنية أوليجومير_1-42 من اصطناعية Aβ_1-42 ببتيد في المختبر وتقييم كميات نسبية من أوليجومير_1-42 Aβ A11-إيجابية في عينات من النشاف دوت تحليل استخدام A11 و Aβ_1-42-الأجسام المضادة 6E10 محددة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أيضا فحص مثبطات أوليجومير_1-42 Aβ A11-إيجابية من النتائج التجريبية شبه كمي.

Introduction

مرض الزهايمر (ميلادي) واحد من أهم الأمراض الأعصاب التي تؤثر على كبار السن في جميع أنحاء العالم¹. من المقبول على نطاق واسع أن التجميع غير طبيعي من بيتا-اميلويد (Aβ) قد يكون العامل المرضية الرائدة للإعلان. Aβ المجاميع هي المكونات الرئيسية من لويحات خرف، واحدة من علامات بيولوجية في أدمغة المرضى الإعلانية. وعلاوة على ذلك، تنتج المجاميع Aβ، بما في ذلك ليغومرات على وجه الخصوص، السمية العصبية القوية، التي قد يكون سبب الوفاة العصبية كما تقدم الإعلانية. ولذلك، قد منع تثبيط تشكيل oligomer Aβ نيوروديجينيريشن، ويمكن وضع مثبطات oligomer Aβ كالمرض--تعديل علاجات للإعلان. واستخدمت العديد من الدراسات ببتيد Aβ اصطناعية لتشكل ليغومرات في المختبر، واستكشاف مورفولوجيس وهياكل اصطناعية Aβ ليغومرات، والتحقيق مثبطات oligomer Aβ تستخدم في المختبر نماذج^{2،3 , 4}-ولكن مختلفة في المختبر تكوين بروتوكولات Aβ oligomer يمكن أن يؤدي إلى أوليجومير مع الخصائص المورفولوجية المختلفة، مما قد يؤدي إلى نتائج لا تضاهي بين المجموعات البحثية المختلفة. ولذلك، ثمة حاجة ملحة بروتوكول تكوين قياسي ل Aβ oligomer.

حتى الآن، أبلغ عن أساليب كثيرة غير مباشرة الكشف عن ليغومرات Aβ. مجهر إلكتروني (TEM) غير يشوه التفريد جل والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ودوت النشاف التحليل يمكن استخدامها لدراسة كمية و/أو مورفولوجية Aβ oligomer في المختبر^{5، 6}. على سبيل المثال، يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا وهيكل Aβ oligomer في TEM. ويمكن قياس الكميات النسبية والحجم الجزيئي لتجميعات Aβ بالتفريد جل غير يشوه. أليسا يمكن استخدامها لتحديد oligomer Aβ في المصل والبلازما، ومقتطفات من أنسجة المخ. وأخيراً، دوت النشاف التحليل، تقنية تستخدم للكشف عن، تحليل وتحديد البروتينات، يمكن استخدامها لتقييم تركيز نسبي oligomer Aβ في عينات مختلفة مع المساعدة من الأجسام المضادة أوليجومير و Aβ محددة. وعلاوة على ذلك، يوفر نقطة النشاف المقايسة قدرا كبيرا من الوقت وفورات، التفريد جل وإجراءات بلوتينج للمواد الهلامية غير مطلوبة. ولذلك، يستخدم هذا الفحص عادة مثبطات oligomer Aβ المحتملة في الشاشة. والهدف العام من هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا وموثوق بها، واستنساخه لإعداد نموذج غنية أوليجومير_1-42 Aβ، لتحليل كميات أوليجومير_1-42 Aβ دوت النشاف التحليل، وعلى الشاشة Aβ oligomer مثبطات استخدام النتائج التجريبية شبه كمي.

Protocol

1-حل إعداد

ملاحظة: انظر الجدول للمواد لمصادر كاشف.

1. تعد حلاً ألبومين مصل بقرى 5% (BSA) عن طريق إضافة 5 غ من جيش صرب البوسنة إلى 100 مل الماء المقطر مزدوجة. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. تعد حلاً A11 oligomer المضادة الأجسام المضادة (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل حل جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. تعد حلاً 6E10 الأجسام المضادة-Aβ (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
4. تعد حلاً OC الأجسام المضادة أوليجومير المضادة فيبريلار (1:1، 000) بإضافة 10 ميليلتر من جسم حل الأسهم إلى 10 مل من محلول جيش صرب البوسنة 5%. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
5. إعداد تريس مخزنة مالحة (تبس) أسهم حلاً عن طريق إضافة ز 24 قاعدة تريس و 88 جرام من كلوريد الصوديوم إلى 1,000 مل من الماء المقطر مزدوجة. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
6. تعد تريس مخزنة المالحة والحل توين-20 (تبسة) عن طريق إضافة 1 مل من توين-20 إلى 100 مل TBS مخزون المياه المقطرة مزدوجة الحل و 900 مل.
7. تحضير حلاً جسم ثانوية بإضافة ميليلتر 10 من الفجل البيروكسيديز (HRP) الماعز المضادة أرنب مفتش (H + L) إلى 10 مل من محلول تبست. الخلط بينهما تماما من فورتيكسينج لهم. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
8. حل ز 3.68 من الكركمين في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أن يشكل حلاً أسهم الكركمين 10 ملم.
9. حل 5 ملغ Aβ الاصطناعية_1-42 في 2 مل من 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورو-2-بروبانول (هفيب) تشكل حلاً مونومر Aβ 2.5 ملغ/مل. ووضعه في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) عن 20 دقيقة تجعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
   ملاحظة: يجب تشغيل هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن. وينبغي قطع نصائح ماصة لضمان بيبيتينج دقيقة.
10. تحضير السائل اليكتروتشيميلومينيسسينسي (القامة) بخلط مسافنة السوائل A و B بنسبة 1:1 حجم. وينبغي إعداد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.

2. إعداد نموذج

ملاحظة: إجراء إعداد عينة أيام 2 قبل النقطة النشاف التحليل.

1. إضافة 900 ميليلتر من الماء المقطر مزدوجة إلى أنبوب Aβ_1-42 مونومر الحل؛ وسيكون تركيز Aβ_1-42 0.25 مغ/مل. ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
2. تتبخر الحل مع غاز النيتروجين عالي النقاء حتى يصل حجمه حوالي 850 ميليلتر. وسيكون تركيز الحل_1-42 Aβ حول 0.29 mg/mL.
   ملاحظة: الحل يجب أن تهتز من وقت لآخر لضمان كامل يتبخر في هفيب. عادة، هو حجم الحل المتبقي بعد 30 دقيقة من التبخر، حوالي 850 ميليلتر.
3. تمييع الحل الكركمين الأسهم لإيجاد حل عملي الكركمين (0.2 و 2 ميكرومتر) مع الماء المقطر مزدوجة. مزيج Aβ الحل_1-42والكركمين يعمل الحل مع حجم نسبة 1:1. وسيكون النهائي تركيزات الكركمين 0.1 و 1 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن أن تكون مختلطة مثبطات أوليجومير المحتملة مع الحل_1-42 Aβ في أي نسبة إذا لزم الأمر.
4. اهتز الحل باستمرار في المحرض مغناطيسي (انظر الجدول للمواد).
   1. إصلاح مربع مقسم بلاستيك للمحرض المغناطيسية. 2 مكان المغناطيسي يحرك الحانات في زوايا المربع 2 ووضع الأنابيب العينة في مركز المربع.
   2. اهتز المربع في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ح 48.
      ملاحظة: سرعة المحرض المغناطيسي هو حوالي 60 لفة في الدقيقة.
5. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية و 18,000 خ زاي جمع المادة طافية.

3-تحليل النشاف دوت

ملاحظة: تجري جميع إينكوبيشنز شاكر أفقي.

1. قطع غشاء النيتروسليلوز إلى شرائح 1 سم على نطاق واسع.
   ملاحظة: يمكن ضبط عرض الغشاء النيتروسليلوز وفقا للاحتياجات التجريبية.
2. وضع العينات 2-ميليلتر بالتساوي على شرائط 2 (قطاع 1 و 2) مع الفاصل الزمني لكل نقطة في 0.5 سم.
3. ضع الشرائط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى الحبرية في الفرقة الجافة.
4. احتضان الشرائط مع حل جيش صرب البوسنة 5% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. شطف الشرائط مع حل تبست لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. نضح الحل تبسة. 1 ح في درجة حرارة الغرفة، لاحتضان قطاع 1 مع جسم أوليجومير المضادة حل A11 وقطاع 2 مع حل 6E10 الأجسام المضادة-Aβ.
7. شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. نضح الحل تبسة. احتضان الشرائط مع حل جسم ثانوية لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. شطف الشرائط مع حل تبسة ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. تطبيق بالتساوي السائل مسافنة مختلطة إلى سطح الشرائط. يعرض الشرائط في تشيميلومينيسسينسي تلقائية نظام التصوير (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: عادة، 300 ميليلتر من السوائل يصدرون ما يكفي لغشاء واحد. يجب أن يبقى الغشاء رطبة خلال التعرض. ويحسب وقت التعرض تلقائياً بنظام التصوير.
11. القيام بتحليل درجات رمادي باستخدام إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة) أو برنامج معالجة الصور آخر للحصول على نتائج شبه كمي.

النتائج

للتحقيق في ما إذا كان مونومر_1-42 Aβ يمكن أن تشكل أوليجومير_1-42 Aβ بعد إعداد، تم استخدام تحليل ال. لا تظهر المجاميع لوحظت في العينة مونومر Aβ حل هفيب_1-42 (الشكل 1أ). وعلاوة على ذلك، أساسا كروي المجاميع التي يبلغ قطرها حوالي 10-80 نانومتر وقد...

Discussion

في هذا البروتوكول، أبلغنا طريقة لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير_1-42 Aβ، وتحليل كميات أوليجومير_1-42 Aβ A11-الإيجابية بنقطة النشاف تحليل. على الرغم من أن لدينا أساليب لإعداد العينات الغنية أوليجومير_1-42 Aβ بسيط جداً، ويمكن الاعتماد عليها، واستنساخه، لا تزال هناك بعض النق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi