A11-positif β-amyloïde oligomère préparation et évaluation à l’aide de Dot Blot Analysis

Résumé

Ce protocole décrit comment préparer des oligomères bêta-amyloïdes d’un peptide synthétique in vitro et d’évaluer les quantités relatives des oligomères bêta-amyloïdes par une dot blot analyse.

Résumé

Β-amyloïde (Aß) est un peptide hydrophobe avec une tendance intrinsèque de s’auto-assembler en agrégats. Parmi les divers agrégats, oligomères bêta-amyloïdes est largement reconnue comme la neurotoxine de premier plan dans la progression de la maladie d’Alzheimer (ma) et est considéré comme l’événement crucial dans la pathogenèse de la ma. Par conséquent, Aβ oligomère inhibiteurs pourraient empêcher la neurodégénérescence et ont le potentiel d’être développé comme modificateurs traitements d’AD. Cependant, protocoles différents formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient conduire à des oligomères présentant des caractéristiques différentes. En outre, il n’y a pas beaucoup de méthodes pour efficacement écran Aβ_1-42 oligomère inhibiteurs. Un anticorps A11 peut réagir avec un sous-ensemble de l’oligomère de_1-42 Aß toxique avec des structures de feuillet β antiparallèle. Dans ce protocole, nous décrivons comment préparer un échantillon de riche en oligomères Aβ A11-positif_1-42 d’un synthétique Aβ_1-42 peptide de vitro et d’évaluer les quantités relatives de l’oligomère_1-42 Aβ A11-positives dans les échantillons en une dot-blot analyse à l’aide de l’A11 et Aβ_1-42-anticorps 6E10 spécifiques. Utilisant ce protocole, inhibiteurs de l’oligomère_1-42 Aβ A11-positif peuvent également projetés de résultats expérimentaux semi-quantitative.

Introduction

La maladie d’Alzheimer (ma) est l’une des plus importantes maladies neurodégénératives touchant les personnes âgées dans le monde¹. Il est largement admis que l’agrégation anormale de la protéine β-amyloïde (Aß) peut être le principal facteur pathologique d’AD. Agrégats de bêta-amyloïdes sont les principaux composants des plaques séniles, un des marqueurs biologiques dans le cerveau des patients atteints de ma. En outre, agrégats de bêta-amyloïdes, notamment les oligomères provoquent une neurotoxicité puissante, qui pourrait être la cause de la mort neuronale au fur et AD. Par conséquent, l’inhibition de la formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourrait empêcher la neurodégénérescence et inhibiteurs d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient être développés comme modificateurs traitements d’AD. De nombreuses études ont utilisé un peptide Aβ synthétique pour former des oligomères in vitro, explorer des morphologies et des structures artificielles oligomères bêta-amyloïdes et enquêter sur les inhibiteurs de l’oligomère Aβ utilisant in vitro modèles^{2,3 , 4}. Toutefois, différentes en vitro protocoles de formation d’oligomères bêta-amyloïdes pourraient entraîner oligomère présentant des caractéristiques morphologiques différentes, qui peut entraîner des résultats incomparables entre les différents groupes de recherche. Par conséquent, un protocole standard de formation d’oligomères bêta-amyloïdes est absolument nécessaire.

Jusqu'à présent, pas beaucoup de méthodes ont été signalés à détecter directement les oligomères bêta-amyloïdes. Microscopie électronique à transmission (TEM), non-dénaturisation électrophorèse sur gel, immuno enzymatique (ELISA) et dot blot analyse permet d’examiner la quantité et/ou la morphologie des oligomères bêta-amyloïdes in vitro^{5, 6}. par exemple, la morphologie et la structure de l’oligomère Aβ peuvent être observées en TEM. Les quantités relatives et la taille moléculaire des agrégations d’Aβ pouvaient être mesurés par électrophorèse sur gel non dénaturant. ELISA peut servir à déterminer des oligomères bêta-amyloïdes dans le sérum, le plasma et des extraits de tissus cérébraux. Enfin, dot blot analyse, une technique utilisée pour la détection, analyse et identification des protéines, pourrait servir à évaluer la concentration relative des oligomères bêta-amyloïdes dans différents échantillons à l’aide d’anticorps spécifiques Aβ et oligomère. En outre, une dot blot assay offre gain de temps considérable, comme l’électrophorèse sur gel et les procédures de transfert pour les gels ne sont pas nécessaires. Par conséquent, cette analyse permet normalement d’écran Aβ oligomère des inhibiteurs potentiels. L’objectif général du présent protocole est de décrire une méthode relativement simple, fiable et reproductible pour préparer un échantillon de la riche en oligomères bêta-amyloïdes_1-42 , pour analyser les montants de l’oligomère_1-42 Aβ par dot blot analyse et oligomère Aβ écran inhibiteurs à l’aide des résultats expérimentaux semi-quantitative.

Protocole

1. préparation de la solution

Remarque : Consultez la Table des matières pour les sources de réactif.

1. Préparer une solution de 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) en ajoutant 5 g de BSA à 100 mL d’eau bidistillée. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.
2. Préparer une solution de A11 des anticorps anti-oligomère (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de la solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.
3. Préparer une solution de 6E10 d’anticorps anti-bêta-amyloïdes (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.
4. Préparer une solution OC d’anticorps anti-fibrillaire oligomère (1:1, 000) en ajoutant 10 µL de solution d’anticorps à 10 mL de solution de BSA de 5 %. Mélangez-les complètement au vortex. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.
5. Préparer une Tris-buffered saline (SCT) solution en ajoutant 24 g de base Tris et 88 g de NaCl à 1 000 mL d’eau bidistillée. Ajuster le pH à 7,4. Conserver la solution à 4 ° C pendant 3 mois.
6. Préparer une solution de Tween-20 (TBST) et un tampon Tris salin en ajoutant 1 mL de Tween-20 à 100 mL du SCT stock solution et 900 mL d’eau bidistillée.
7. Préparer une solution d’anticorps secondaire en ajoutant 10 µL de raifort peroxydase de raifort (HRP) chèvre anti-lapin IgG (H + L) à 10 mL de solution TBST. Mélangez-les complètement au vortex eux. Conserver la solution à 4 ° C pendant environ 1 mois.
8. Dissoudre 3,68 g de curcumine dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour former une solution stock de curcumine de 10 mM.
9. Dissoudre 5 mg de synthétique Aβ_1-42 dans 2 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour former une solution de monomère de bêta-amyloïdes de 2,5 mg/mL. Mettre à température ambiante (25 ° C) pendant 20 min. faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C jusqu'à 6 mois.
   Remarque : Cette procédure doit être exécutée aussi vite que possible. Il faut couper les pointes de pipette pour s’assurer de pipetage précis.
10. Préparer le liquide par électrochimiluminescence (ECL) en mélangeant ECL fluide A et B avec un rapport de volume de 1:1. Cette solution doit être préparée juste avant utilisation.

2. préparation de l’échantillon

Remarque : Effectuez la préparation de l’échantillon 2 jours avant le dot blot analyse.

1. Ajouter 900 µL d’eau bidistillée à un tube de solution de monomère Aβ_1-42 ; la concentration de bêta-amyloïdes_1-42 soit 0,25 mg/mL. Placer le mélange à température ambiante pendant 20 min.
2. Faire évaporer la solution à l’azote de haute pureté jusqu'à ce que son volume est d’environ 850 µL. La concentration de la solution de_1-42 Aβ sera environ 0,29 mg/mL.
   Remarque : La solution doit être secouée de temps en temps pour assurer que le HFIP est complètement évaporé. Normalement, après 30 min d’évaporation, le volume de la solution résiduelle est environ 850 µL.
3. Diluer la solution mère de curcumine à une solution de travail de curcumine (0,2 à 2 µM) avec de l’eau bidistillée. Mélanger la solution_1-42Aβ et curcumine solution avec un rapport 1:1 volume de travail. Les concentrations finales de curcumine sera de 0,1 à 1 µM.
   NOTE : Les inhibiteurs potentiels d’oligomère peuvent être mélangés avec la solution_1-42 de bêta-amyloïdes dans n’importe quel rapport si nécessaire.
4. Agiter la solution en permanence dans un agitateur magnétique (voir Table des matières).
   1. Fixer un boîtier séparateur en plastique à l’agitateur magnétique. Place 2 magnétique remuer des barres à 2 coins de la boîte et placer les tubes à échantillon au centre de la boîte.
   2. Secouer la boîte à température ambiante (25 ° C) pendant 48 h.
      Remarque : La vitesse de l’agitateur magnétique est environ 60 t/mn.
5. Centrifuger les tubes pendant 15 min à 4 ° C et 18 000 x g. récupérer le surnageant.

3. dot blot Analysis

Remarque : Tous les incubations sont effectuées sur un agitateur horizontal.

1. Couper une membrane de nitrocellulose en bandes larges de 1 cm.
   NOTE : La largeur de la membrane de nitrocellulose peut être ajustée selon les besoins expérimentaux.
2. Placer 2 µL échantillons uniformément sur 2 bandes (bande 1 et 2) avec chaque intervalle de point à 0,5 cm.
3. Placer les bandes à température ambiante pendant 5 min jusqu'à ce que la goutte sur la bande est sec.
4. Incuber les bandes avec une solution de BSA de 5 % pendant 30 min à température ambiante.
5. Rincer les bandes avec une solution TBST pendant 5 min à température ambiante.
6. Aspirer la solution TBST. Pendant 1 h à température ambiante, incuber 1 la bande avec un anticorps anti-oligomère solution A11 et bande 2 avec une solution de 6E10 d’anticorps anti-bêta-amyloïdes.
7. Rincer les bandes avec une solution TBST trois fois, chaque fois pendant 5 min à température ambiante.
8. Aspirer la solution TBST. Incuber les bandes avec une solution d’anticorps secondaire pendant 40 min à température ambiante.
9. Rincer les bandes avec une solution TBST trois fois, chaque fois pendant 5 min à température ambiante.
10. Appliquer uniformément le fluide ECL mixte à la surface des bandes. Exposer les bandes dans une système d’imagerie de la chimiluminescence automatique (voir Table des matières).
    Remarque : Normalement, 300 µL de liquide ECL est suffisant pour une des membranes. La membrane doit être maintenue humide pendant l’exposition. Le temps d’exposition est calculé automatiquement par le système d’imagerie.
11. Faites une analyse de niveaux de gris en utilisant ImageJ (National Institutes of Health) ou un autre logiciel de traitement d’image pour obtenir des résultats semi-quantitatifs.

Résultats

Afin de vérifier si un monomère_1-42 de bêta-amyloïdes peut former un oligomère de_1-42 Aβ après préparation, analyse TEM a été utilisée. Aucun agrégat visibles ont été observées dans l’échantillon de monomère Aβ HFIP-dissous_1-42 (Figure 1A). En outre, les agrégats principalement globulaires avec un diamètre de près de 10 à 80 nm ont été observées dans l’échantillon de_1-42

Discussion

Dans ce protocole, nous avons rapporté une méthode pour préparer les échantillons contenant des oligomères Aβ_1-42 et analyser les montants de l’oligomère_1-42 Aβ A11-positif par une dot blot analyse. Bien que nos méthodes pour la préparation des échantillons de riche en oligomères bêta-amyloïdes_1-42 sont assez simples, fiables et reproductibles, il y a encore quelques points pour être remarqué. Tout d’abord, HFIP est utilisée pour dissoudre synthétique peptide Aβ

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi