A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

Zusammenfassung

Β-Amyloid (Aβ) ist eine hydrophobe Peptid mit innewohnende Tendenz zu Aggregaten selbst zusammenstellen. Unter den verschiedenen Aggregaten Aβ Oligomer ist weithin anerkannt als der führende Nervengift in der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) und gilt als das entscheidende Ereignis in der Pathogenese der AD. Daher könnte Aβ-Oligomer-Inhibitoren verhindern Neurodegeneration und haben das Potenzial, als Disease modifying entwickelt werden Behandlungen von AD. Jedoch führen verschiedene Bildung Protokolle von Aβ Oligomer Oligomere mit unterschiedlichen Eigenschaften. Darüber hinaus gibt es nicht viele Methoden, um effektiv Bildschirm Aβ_1-42 Oligomer-Inhibitoren. Ein A11 Antikörper reagieren mit einer Teilmenge der giftige Aβ-_1-42 -Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zur Vorbereitung einer A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer-reiche Probe aus einem synthetischen Aβ_1-42 Peptid in Vitro und relative Mengen der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer in Proben von einem Dot-Blot auswerten Analyse mit A11 und Aβ_1-42-spezifischen 6E10 Antikörper. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Inhibitoren der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer auch von semi-quantitativen experimentellen Ergebnisse gezeigt.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen weltweit¹. Es ist weithin anerkannt, dass die abnorme Ansammlung von β-Amyloid (Aβ) möglicherweise der führenden pathologischen Faktor von AD. Aβ-Aggregate sind die Hauptbestandteile der senilen Plaques, eines biologischen Markern in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus produzieren Aβ-Aggregate, insbesondere Oligomere potente Neurotoxizität, die möglicherweise die Ursache des neuronalen Tod AD Fortschreiten. Daher könnte die Hemmung der Aβ Oligomer Bildung Neurodegeneration verhindern und Aβ-Oligomer-Inhibitoren entwickelt werden könnte, als krankheitsmodifizierende Therapien von AD. Viele Studien haben eine synthetische Aβ-Peptid bilden Oligomere in Vitro, Morphologien und Strukturen der künstlichen Aβ Oligomere erkunden und untersuchen die Inhibitoren von Aβ-Oligomer mit in-vitro- Modelle^2,3 verwendet ^{, 4}. jedoch verschiedene in-vitro- Bildung-Protokolle von Aβ Oligomer könnte zu Oligomer mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften, die die unvergleichliche Ergebnisse unter verschiedenen Forschungsgruppen verursachen könnten. Ein standard-Formation-Protokoll für Aβ Oligomer ist daher dringend erforderlich.

Bis jetzt wurden nicht viele Methoden berichtet, Aβ Oligomere direkt zu erkennen. Übertragung elektronischer Mikroskopie (TEM), nicht Denaturierung Gelelektrophorese, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und Dot-Blot-Analyse lässt sich die Menge und/oder die Morphologie von Aβ Oligomer in-vitro-^5, prüfen ⁶. Z. B. die Morphologie und Struktur der Aβ Oligomer in TEM beobachtet werden. Die relativen Mengen und Molekülgröße Aβ Aggregationen konnte nicht Denaturierung Gelelektrophorese gemessen werden. ELISA konnte zur Aβ Oligomer in Serum, Plasma und Auszüge aus Hirngewebe herangezogen werden. Zu guter Letzt Dot-Blot-Analyse, eine Technik zur Erfassung, Analyse und Identifizierung von Proteinen, ließe sich die relative Konzentration der Aβ Oligomer in verschiedenen Proben mit Hilfe von Oligomer-spezifische und Aβ-spezifische Antikörper zu bewerten. Darüber hinaus bietet ein Dot Blot Assay deutliche Zeitersparnis, wie Gelelektrophorese und den befleckenden Verfahren für Gele nicht erforderlich sind. Daher wird dieser Test normalerweise Bildschirm potenzielle Aβ Oligomer-Inhibitoren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Vorbereitung einer Aβ_1-42 Oligomer-reiche Probe, die Mengen von Aβ-_1-42 -Oligomer von Dot-Blot-Analyse und Bildschirm Aβ Oligomer analysieren zu beschreiben Inhibitoren mit semi-quantitativen experimentellen Ergebnissen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Lösung

Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Reagenz Quellen.

1. Bereiten Sie eine 5 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Zugabe von 5 g BSA zu 100 mL bidestilliertem Wasser. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
2. Bereiten Sie eine Anti-Oligomer Antikörperlösung A11 (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper zu 10 mL der Lösung 5 % BSA. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
3. Bereiten Sie eine Anti-Aβ Antikörper 6E10 Lösung (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
4. Bereiten Sie eine Anti-Fibrillären Oligomer Antikörperlösung OC (1:1 000) durch Zugabe von 10 µL der Stammlösung Antikörper bis 10 mL einer 5 % BSA Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
5. Bereiten Sie eine Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) Stammlösung 1.000 mL bidestilliertem Wasser 24 g Tris-Base und 88 g NaCl hinzu. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 3 Monaten.
6. Bereiten Sie ein Tris gepufferte Kochsalzlösung und Tween-20 (TBST) Lösung durch Zugabe von 1 mL Tween-20 bis 100 mL von TBS Lager Lösung und 900 mL bidestilliertem Wasser.
7. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörper-Lösung durch Hinzufügen von 10 µL Meerrettich Peroxidase (HRP) Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) auf 10 mL TBST Lösung. Mischen Sie sie vollständig durch Vortexen sie. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
8. Lösen Sie 3,68 g von Curcumin in 1 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO), eine 10-mM-Curcumin-Stammlösung zu bilden.
9. 5 mg von synthetischen Aβ-_1-42 in 2 mL 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) zu einer 2,5-mg/mL Aβ Monomer Lösung zu lösen. Legen Sie sie bei Raumtemperatur (25 ° C) für 20 min. machen 100 µL Aliquots und bei-20 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren.
   Hinweis: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich ausgeführt werden. Die Pipettenspitzen sollten abgeschnitten werden, um genaues pipettieren zu gewährleisten.
10. Bereiten Sie Electrochemiluminescence (ECL) Flüssigkeit durch ECL Flüssigkeit A und B mit einem Volumenverhältnis von 1:1 mischen. Diese Lösung sollte kurz vor dem Einsatz vorbereitet werden.

2. die Probenvorbereitung

Hinweis: Führen Sie die Probenvorbereitung 2 Tage vor dem Dot-Blot-Analyse.

1. Ein Rohr von Aβ-_1-42 -Monomer-Lösung 900 µL bidestilliertem Wasser hinzufügen; die Konzentration von Aβ-_1-42 werden 0,25 mg/mL. Legen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 min.
2. Verdampfen Sie die Lösung mit hochreinen Stickstoffgas, bis sein Volumen ungefähr 850 µL ist. Die Konzentration der Aβ-_1-42 -Lösung werden 0,29 mg/mL.
   Hinweis: Die Lösung muss von Zeit zu Zeit geschüttelt werden, um sicherzustellen, dass die HFIP vollständig verdunstet ist. Normalerweise ist das Volumen der verbleibende Lösung nach 30 min der Verdunstung, ca. 850 µL.
3. Verdünnen Sie Curcumin-Stammlösung zu einer Curcumin Lösung (0,2 und 2 µM) mit bidestilliertem Wasser. Mischen Sie die Aβ-_1-42-Lösung und Curcumin arbeiten Lösung mit einem Volumenverhältnis von 1:1. Die Endkonzentrationen von Curcumin werden 0,1 bis 1 µM.
   Hinweis: Mögliche Oligomer-Hemmer können mit der Aβ-_1-42 -Lösung in jedem Verhältnis bei Bedarf gemischt werden.
4. Schütteln Sie die Lösung kontinuierlich in einen magnetischen Quirl (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Eine Kunststoff-Teiler-Feld, um die magnetischen Rührer zu beheben. Platz 2 magnetische verrühren Bars an 2 Ecken der Box und die Probenröhrchen in der Mitte des Feldes.
   2. Schütteln Sie die Box bei Raumtemperatur (25 ° C) für 48 h.
      Hinweis: Die Geschwindigkeit des magnetischen Rührwerks ist rund 60 Umdrehungen pro Minute.
5. Die Rohre für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und 18.000 x g. sammeln überstand.

(3) Dot Blot Analyse

Hinweis: Auf einem horizontalen Shaker sind alle Inkubationen durchgeführt.

1. Schneiden Sie Nitrozellulose-Membran in 1 cm breite Streifen.
   Hinweis: Die Breite der Nitrozellulose-Membran kann experimentelle Bedürfnissen angepasst werden.
2. Legen Sie 2 µL Proben gleichmäßig auf 2 Streifen (Band 1 und 2) mit jedem punktintervall 0,5 cm.
3. Legen Sie die Streifen bei Raumtemperatur für 5 min, bis die Tropfen auf dem Band trocken ist.
4. Inkubieren Sie die Streifen mit 5 % BSA-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
5. Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
6. Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur Streifen 1 mit einem Anti-Oligomer Antikörper A11 Lösung und Streifen Sie 2 mit einer Anti-Aβ-Antikörper-6E10-Lösung.
7. Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.
8. Aspirieren Sie TBST Lösung. Inkubieren Sie die Streifen mit einer sekundären Antikörperlösung für 40 min bei Raumtemperatur.
9. Spülen Sie die Streifen mit einer TBST Lösung drei Mal, jedes Mal für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Gleichmäßig auftragen der gemischten ECL Flüssigkeit an der Oberfläche der Streifen. Setzen Sie die Streifen in eine automatische Chemilumineszenz imaging-System (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Im Normalfall reicht 300 µL der ECL Flüssigkeit einer Membran. Die Membran muss während der Belichtung feucht gehalten werden. Die Belichtungszeit wird automatisch durch das Abbildungssystem berechnet.
11. Machen Sie eine Graustufen-Analyse mit ImageJ (National Institutes of Health) oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software, um semi-quantitativen Ergebnisse zu erzielen.

Ergebnisse

Um zu untersuchen, ob eine Aβ-_1-42 -Monomer eine Aβ-_1-42 -Oligomer nach der Zubereitung bilden kann, wurde TEM Analyse verwendet. Keine sichtbaren Aggregate wurden in der HFIP aufgelöst Aβ_1-42 Monomer Probe (Abb. 1A) beobachtet. Darüber hinaus vor allem kugelige Aggregate mit einem Durchmesser von rund 10-80 nm beobachtet in der Aβ-_1-42 -Probe nach 48 h schütteln, was darauf hindeutet, dass A...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Vorbereitung von Proben mit Aβ_1-42 Oligomer und die Beträge der A11-positiven Aβ_1-42 Oligomer durch einen Punkt Blot Analyse analysieren berichtet. Obwohl unsere Methoden für die Erstellung von Aβ_1-42 Oligomer-reiche Proben ganz einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind, gibt es noch einige Punkte zu beachten. Erstens wird HFIP verwendet, um synthetische Aβ-_1-42 -Peptid auflösen. Eine aggregierte Aβ-_1-42 -Pep...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi