A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

Resumen

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

Resumen

Β-amiloide (Aβ) es un péptido hidrofóbico con una tendencia intrínseca a la uno mismo-montar en agregados. Entre los diversos agregados, oligómero Aβ es ampliamente aceptado como la neurotoxina líder en el progreso de la enfermedad de Alzheimer (EA) y es considerado como el evento crucial en la patogenia de la EA. Por lo tanto, inhibidores de oligómero Aβ podrían prevenir la neurodegeneración y tienen el potencial para desarrollarse como modificadores de la enfermedad tratamientos de AD. Sin embargo, protocolos de formación diferentes de oligómero Aβ pueden dar oligómeros con diferentes características. Por otra parte, no hay muchos métodos con eficacia pantalla Aβ_1-42 oligómero inhibidores de. Un anticuerpo A11 puede reaccionar con un subconjunto de tóxicos oligómero Aβ_1-42 con estructuras de β-hoja de la URL. En este protocolo, se describe cómo preparar una muestra de ricos oligómero A11 positivo Aβ_1-42 de un sintético Aβ_1-42 péptido en vitro y para evaluar las cantidades relativas de oligómero de A11 positivo Aβ_1-42 en muestras frotando un punto Análisis usando A11 y Aβ_1-42-6E10 específico anticuerpos. Mediante este protocolo, inhibidores de oligómero de A11 positivo Aβ_1-42 pueden también proyectará a partir de resultados experimentales semi-cuantitativo.

Introducción

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las más importantes enfermedades neurodegenerativas que afectan a personas mayores en todo el mundo¹. Es ampliamente aceptado que la agregación anormal de β-amiloide (Aβ) puede ser el factor patológico principal del anuncio. Agregados de Aß son los principales componentes de las placas seniles, uno de los marcadores biológicos en el cerebro de pacientes con EA. Por otra parte, agregados de Aß, oligómeros en particular producen neurotoxicidad potente, que pudo ser la causa de la muerte neuronal como progresa AD. Por lo tanto, la inhibición de la formación de Aß oligómero puede prevenir la neurodegeneración, e inhibidores del oligómero de Aß podrían desarrollarse como modificadores de la enfermedad tratamientos de AD. Muchos estudios han utilizado un péptido Aß sintético para formar oligómeros en vitro, explorar morfologías y estructuras de oligómeros de Aß artificiales e investigar los inhibidores de oligómero Aβ usando in vitro modelos^{2,3 , 4}. sin embargo, diferentes en vitro protocolos de formación de oligómero Aβ podrían conducir a oligómero con características morfológicas diferentes, que pueden causar los resultados incomparables entre diferentes grupos de investigación. Por lo tanto, un protocolo de formación estándar de oligómero Aβ es urgente.

Hasta ahora, no muchos métodos se han divulgado para detectar directamente los oligómeros de Aß. Microscopía electrónica de transmisión (TEM), no desnaturalizando electroforesis del gel, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y dot blotting análisis pueden usarse para examinar la cantidad y morfología de Aβ oligómero en vitro^{5, 6}. por ejemplo, la morfología y estructura del oligómero Aβ pueden observarse en TEM. Las cantidades relativas y tamaño de agregados de Aβ podrían medirse por electroforesis en geles no desnaturalizantes. ELISA puede utilizarse para determinar oligómero Aβ en suero, plasma y extractos de tejido cerebral. Por último, dot Blot análisis, una técnica usada para la detección, análisis y la identificación de proteínas, podría utilizarse para evaluar la concentración relativa de oligómero Aβ en diferentes muestras con la ayuda de anticuerpos específicos de Aß y oligómero. Por otra parte, un dot Blot ensayo ofrece ahorro de tiempo significativo, como electroforesis en gel y los Blot procedimientos para los geles no son necesarios. Por lo tanto, este ensayo se usa normalmente para los inhibidores potenciales de oligómero la Aß pantalla. El objetivo general de este protocolo es describir un método relativamente simple, confiable y reproducible para preparar una muestra Aβ_1-42 oligómero-ricos, para analizar las cantidades de oligómero Aβ_1-42 por dot Blot análisis y oligómero de Aß de pantalla inhibidores mediante resultados experimentales semi-cuantitativos.

Protocolo

1. preparación de la solución

Nota: Ver Tabla de materiales para fuentes de reactivo.

1. Preparar una solución 5% albúmina de suero bovino (BSA) mediante la adición de 5 g de BSA 100 ml de agua destilada doble. Mezclar completamente por Vortex ellos. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes.
2. Preparar una solución anticuerpo anti-oligómero de A11 (1:1, 000) agregando 10 μl de la solución madre de anticuerpo a 10 mL de la solución de BSA de 5%. Mezclar completamente por Vortex ellos. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes.
3. Preparar una solución de 6E10 del anticuerpo de anti-Aß (1:1, 000) agregando 10 μl de la solución madre de anticuerpo a 10 mL de solución de BSA de 5%. Mezclar completamente por Vortex. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes.
4. Preparar una solución OC de anticuerpo anti-fibrilar oligómero (1:1, 000) agregando 10 μl de la solución madre de anticuerpo a 10 mL de solución de BSA de 5%. Mezclar completamente por Vortex. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes.
5. Preparar una Tris-buffer salino (TBS) solución mediante la adición de 24 g de Tris base y 88 g de NaCl en 1000 mL de agua destilada doble. Ajustar el pH a 7.4. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por 3 meses.
6. Preparar una solución de Tween-20 (TBST) y solución salina con tampón Tris añadiendo 1 mL de Tween-20 a 100 mL de TBS común solución y 900 mL doble y agua destilada.
7. Preparar una solución de anticuerpo secundario agregar 10 μl de rábano con peroxidasa (HRP) cabra anti-IgG de conejo (H + L) a 10 mL de solución TBST. Mezclar completamente por Vortex ellos. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes.
8. Disolver 3,68 g de cúrcuma en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para formar una solución stock de 10 mM la curcumina.
9. Disolver 5 mg de sintético Aβ_1-42 en 2 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para formar una solución de monómero de Aß de 2.5 mg/mL. Lugar a temperatura ambiente (25 ° C) para alícuotas de 20 min hacer 100 μl y almacenar a-20 ° C hasta por 6 meses.
   Nota: Este procedimiento se debe correr tan rápido como sea posible. Deben cortarse las puntas de pipetas para pipeteo exacto.
10. Preparar electrochemiluminescence (ECL) líquido mezclando ECL líquido A y B con una relación de volumen de 1:1. Esta solución debe ser preparada inmediatamente antes de uso.

2. preparación de la muestra

Nota: Realizar la preparación de la muestra 2 días antes de la dot blotting análisis.

1. Agregar 900 μl de agua doble destilada a un tubo de solución de monómero Aβ_1-42 ; la concentración de Aβ_1-42 será 0.25 mg/mL. Coloque la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
2. Evaporar la solución con gas nitrógeno de alta pureza hasta que su volumen es cerca de 850 μl. La concentración de la solución Aβ_1-42 será de 0,29 mg/mL.
   Nota: La solución debe agitarse de vez en cuando para asegurar que el HFIP se evapora completamente. Normalmente, después de 30 min de la evaporación, el volumen de la solución residual es cerca de 850 μl.
3. Diluir la solución madre de curcumina a una solución de trabajo de la curcumina (0,2 y 2 μm) con agua destilada doble. Mezclar la Aβ_1-42solución y solución con una relación de volumen de 1:1 la curcumina. Las concentraciones finales de curcumina será 0,1 y 1 μm.
   Nota: Potenciales inhibidores de oligómero se pueden mezclar con la solución Aβ_1-42 en cualquier relación si es necesario.
4. Agite continuamente la solución en un agitador magnético (véase Tabla de materiales).
   1. Arreglar una caja de plástico separador para el agitador magnético. 2 lugar magnético remover barras en 2 esquinas de la caja y colocar los tubos de muestras en el centro de la caja.
   2. Agitar la caja a temperatura ambiente (25 ° C) durante 48 h.
      Nota: La velocidad del agitador magnético es alrededor de 60 rpm.
5. Centrifugar los tubos durante 15 min a 4 ° C y 18.000 x g. recoger el sobrenadante.

3. dot Blotting análisis

Nota: Todas las incubaciones se realizan en un agitador horizontal.

1. Cortar la membrana de nitrocelulosa en tiras ancho 1 cm.
   Nota: El ancho de la membrana de nitrocelulosa se puede ajustar según necesidades experimentales.
2. Coloque las muestras 2 μl uniformemente en 2 tiras (tira 1 y 2) con cada intervalo punto a 0,5 cm.
3. Coloque las tiras a temperatura ambiente durante 5 minutos hasta que se seque la gota en la banda.
4. Incube las tiras con una solución de BSA de 5% durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Enjuague las tiras con una solución TBST por 5 min a temperatura ambiente.
6. Aspirar la solución TBST. Por 1 h a temperatura ambiente, incubar 1 tira con un anticuerpo anti-oligómero solución A11 y pele 2 con una solución de 6E10 del anticuerpo de anti-Aß.
7. Enjuague las tiras con una solución TBST tres veces, cada vez durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Aspirar la solución TBST. Incube las tiras con una solución de anticuerpo secundario durante 40 min a temperatura ambiente.
9. Enjuague las tiras con una solución TBST tres veces, cada vez durante 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Aplique uniformemente el líquido mezclado de ECL para la superficie de las tiras. Exponga las tiras en una quimioluminiscencia automático sistema de imagen (véase Tabla de materiales).
    Nota: Normalmente, 300 μL de líquido ECL es suficiente para una membrana. La membrana debe mantenerse húmeda durante la exposición. El tiempo de exposición se calcula automáticamente por el sistema de proyección de imagen.
11. Hacer un análisis de escala de grises con ImageJ (institutos nacionales de salud) u otro software de procesamiento de imágenes para obtener resultados semi-cuantitativos.

Resultados

Para investigar si un monómero Aβ_1-42 puede formar un oligómero Aβ_1-42 después de la preparación, se usó análisis TEM. No agregados visibles fueron observados en la muestra de monómero disuelto HFIP Aβ_1-42 (figura 1A). Por otra parte, agregados globulares principalmente con un diámetro de alrededor de 10-80 nm fueron observados en la muestra Aβ_1-42 después de 48 h de agitación, lo que ...

Discusión

En este protocolo hemos reportado un método para preparar las muestras que contienen oligómero Aβ_1-42 y analizar las cantidades de oligómero de A11 positivo Aβ_1-42 , un punto de análisis el borrar. Aunque nuestros métodos para la preparación de Aβ_1-42 oligómero ricas muestras son bastante simples, fiables y reproducibles, todavía hay algunos puntos a ser notado. En primer lugar, HFIP se utiliza para disolver el péptido sintético de_1-42 de Aβ. Un péptido de_42...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi