A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

要約

このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。

要約

Β アミロイド (a β) は集計に自己組み立てるに本質的な傾向と疎水性ペプチドです。各種骨材の中で a β オリゴマーはアルツハイマー病 (AD) の進行中の主要な神経毒として広く受け入れられている、AD の発症に重要なイベントであると見なされます。したがって、a β オリゴマー阻害剤が神経変性を防ぐため、疾患修飾として開発される可能性を秘めている AD の治療。しかし、a β オリゴマーの異なる形成プロトコルは、異なる特性を持つオリゴマーに可能性があります。さらに、効果的に画面 a β_1-42オリゴマー阻害する多くの方法がないです。A11 抗体は逆平行 β シート構造を持つ有毒な a β_1-42のオリゴマーのサブセットと反応できます。このプロトコルでは、合成 a β_1-42ペプチド体外から A11 正 a β_1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備し、ドットのしみが付くことによってサンプルの A11 正 a β_1-42のオリゴマーの相対量を評価する方法について述べるA11 と a β_1-42を用いた解析-特定 6E10 抗体。このプロトコルを使用して、A11 正 a β_1-42のオリゴマーの阻害剤は、半定量的な実験結果から上映されることができます。

概要

アルツハイマー病 (AD) は、高齢者の世界的な¹に影響を与える最も重要な神経変性疾患の一つです。Β アミロイド (a β) の異常凝集が広告の主要な病理要因かもしれないことが広く受け入れられます。A β の凝集体は、老人斑、AD 患者の脳の生物学的マーカーの 1 つの主要なコンポーネントです。さらに、特に、オリゴマーを含めて、a β の集計は、AD の進行性神経細胞死の原因かもしれない強力な毒性を作成します。したがって、a β オリゴマー形成の抑制、神経変性を妨げる可能性し、a β オリゴマー阻害剤は、疾患修飾として開発される可能性 AD の治療。多くの研究は、オリゴマー体外を形成、人工の a β オリゴマーの構造と形態を探検し、調査を使用して生体外モデル^2,3 a β オリゴマーの阻害剤を合成 a β ペプチドを使用しています。^,4します。 しかし、a β オリゴマー形成プロトコル別の in vitroの異なる研究グループ間で比類のない結果が生じる別の形態学的特性を持つオリゴマーに 。したがって、a β オリゴマーの形成の標準的なプロトコルが急務します。

今までは、a β オリゴマーが直接検出することがない多くの方法を報告されています。透過電子顕微鏡 (TEM)、非変性ゲル電気泳動法、酵素免疫測定法 (ELISA) と分析にしみが付く点は、量および/または a β オリゴマー体外^5,の形態を検討する使用ことができます。⁶。 形態と a β オリゴマー構造を TEM で観察するたとえば、します。相対的な量、a β の集計の分子サイズは、非変性ゲル電気泳動法によって測定できます。Elisa 法は、血清、血漿、脳組織からの抽出物で a β オリゴマーを決定する使用できます。最後に、ドット解析技術で検出すると、しみが付くことを分析して、タンパク質の同定に使えるオリゴマーおよび a β に固有の抗体の助けを借りて、異なるサンプル a β オリゴマーの相対濃度を評価します。また、試金を吸い取りドット ゲル電気泳動およびゲルのあぶらとりのプロシージャは必要ないため大幅な時間節約を提供しています。したがって、この試金は通常、画面 a β オリゴマー阻害剤を使用します。このプロトコルの全体的な目標は、ブロッティング解析、ドット、画面 a β オリゴマー a β_1-42のオリゴマーの量を分析するため、a β_1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備する比較的単純な信頼性と再現性のあるメソッドを記述するのには半定量的実験結果を用いた阻害剤。

プロトコル

1. ソリューションの準備

注: は、試薬ソースの材料表を参照してください。

1. 5% ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションを準備するには、二重蒸留水 100 mL に BSA の 5 g を追加します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
2. 5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L の追加によって反オリゴマー抗体 A11 溶液 (1:1, 000) を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
3. 抗 a β 抗体 6E10 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
4. アンチ維オリゴマー抗体 OC 溶液 (1:1, 000) を準備するには、5 %bsa 溶液 10 mL に抗体原液の 10 μ L を追加します。ボルテックスでは、完全にそれらをミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
5. 二重蒸留水 1,000 mL に 24 g のトリス基地と NaCl の 88 g を追加することによって、含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 原液を準備します。7.4 に pH を調整します。3 ヵ月 4 ° C でソリューションを保存します。
6. 準備トリス緩衝生理食塩水とトゥイーン 20 (TBST) ソリューション Tween 20 1 mL を 100 mL の TBS に追加することによって在庫ソリューションと 900 mL ダブル蒸留水。
7. わさびの 10 μ L 追加ペルオキシダーゼ (HRP) ヤギ抗うさぎ IgG (H + L) TBST 溶液 10 mL に二次抗体溶液を準備します。ボルテックスによってそれらを完全にミックスします。1 ヶ月の 4 ° C でソリューションを保存します。
8. ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM クルクミン在庫ソリューションを形成するための 1 つの mL でクルクミンの 3.68 g を溶解します。
9. 2 mL の 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) 2.5 Mg/ml と a β の単量体ソリューションを形成するのに合成 a β_1-42の 5 mg を溶解します。室温 (25 ° C) で 20 分、100 μ 因数の配置し、-20 ° C で 6 ヶ月保存します。
   注: この手順をできるだけ速く実行する必要があります。ピペット チップは、正確なピペッティングを確実に切断する必要があります。
10. 1:1 の容積比で ECL 流体 A と B を混ぜて電気化学発光 (ECL) 液を準備します。このソリューションは、使用直前準備する必要があります。

2. サンプル準備

注: は、ブロッティング解析ドットの前に 2 日間サンプル準備を実行します。

1. A β_1-42モノマー溶液のチューブに二重蒸留水の 900 μ L を追加します。a β_1-42の濃度は 0.25 mg/mL になります。20 分間室温で混合物を配置します。
2. その量は約 850 μ L まで高純度の窒素ガスでソリューションを蒸発させます。A β_1-42溶液の濃度は、0.29 mg/mL になります。
   注: ソリューションを随時で動揺して、HFIP が完全に蒸発することを確認する必要があります。通常、蒸発の 30 分後に残液量は約 850 μ L です。
3. 二重蒸留水でクルクミン作業ソリューション (0.2 2 μ M) にクルクミン原液を希釈します。A β_1-42のソリューションとクルクミン作業ソリューション 1:1 の容積比で混ぜます。クルクミンの最終濃度は、0.1 と 1 μ M になります。
   注: 必要な場合任意の割合で a β_1-42のソリューションの潜在的なオリゴマー阻害剤に混在できます。
4. 磁気攪拌機でソリューションを継続的に振る (材料の表を参照してください)。
   1. 磁気攪拌機にプラスティック ボックスを修正します。場所 2 磁気は 2 ボックスのコーナーでバーをかき混ぜるし、ボックスの中央にサンプル チューブを置きます。
   2. 48 時間室温 (25 ° C) でボックスを振る。
      注: 磁気攪拌機の速度は約 60 rpm です。
5. 4 ° C で 15 分間チューブを遠心し、18,000 x g. 収集上清。

3. ドットのしみが付く分析

注: すべての孵化は水平シェーカーで行われます。

1. 硝酸セルロースの膜は、1 cm 幅の短冊状にカットします。
   注: 硝酸セルロースの膜の幅は、実験のニーズに応じて調整できます。
2. 2 ストリップ (ストリップ 1 と 2) 各ポイント間隔 0.5 cm に 2 μ L のサンプルを均等に配置します。
3. バンドに液滴が乾くまで、5 分間室温でストリップを配置します。
4. 室温で 30 分間 5 %bsa 溶液によるストリップを孵化させなさい。
5. 室温で 5 分間 TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
6. TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 1 時間インキュベート ストリップ 1 反オリゴマー抗体 A11 ソリューションとストリップ抗 a β 抗体 6E10 ソリューションと 2。
7. 3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
8. TBST ソリューションを吸い出しなさい。室温で 40 分間二次抗体溶液でストリップを孵化させなさい。
9. 3 回部屋の温度で 5 分間ずつ TBST ソリューションとストリップをすすいでください。
10. ストリップの表面に混合の ECL 流体を均等に適用されます。イメージング システム自動発光でストリップを公開 (材料の表を参照してください)。
    注: 通常、300 μ L の ECL 流体膜 1 つのための十分です。膜は、露光中に湿った保たれなければなりません。露出時間は、イメージング システムによって自動的に計算されます。
11. 半定量的な結果を取得する ImageJ (健康の国民の協会) または別の画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール分析を行います。

結果

A β_1-42の単量体が準備の後 a β_1-42オリゴマーを形成できるかどうかを調べるには、TEM 分析を使用しました。HFIP 溶解 a β_1-42モノマー サンプル (図 1A) で表示される集計は認められなかった。また、周りの直径を持つ主に球状骨材 10 80 nm で観察された a β_1-42サンプルの振動、48 時間後 a β_1-42の?...

ディスカッション

このプロトコルでは a β_1-42のオリゴマーを含む試料を準備する分析をしみが付くことのドットで A11 正 a β_1-42のオリゴマーの量を分析する方法を報告しています。A β_1-42オリゴマーの豊富なサンプルの準備のための私たちの方法はかなりシンプルで、信頼性と再現性のある、まだ気づかれるべきいくつかのポイントがあります。まず、HFIP、合成 a β_1-42ペプチド...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi