הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

Abstract

Β-עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד הידרופוביות עם נטייה מהותי בעצמם לתוך אגרגטים. בין אגרגטים שונים, Aβ אוליגומר מקובל כמו עצבי מוביל בההתקדמות של מחלת אלצהיימר (AD), נחשבת לאירוע מכריע בפתוגנזה של המודעה. לכן, Aβ אוליגומר מעכבי יכול למנוע הקשורים ניוון מוחיים ו יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. עם זאת, צורה שונה הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל oligomers עם מאפיינים שונים. יתר על כן, אין שיטות רבות מעכבי אוליגומר מסך ביעילות_1-42 Aβ. נוגדן A11 יכולה להגיב עם ערכת משנה של רעילים אוליגומר_1-42 Aβ במבנים β-גיליון אנטי-מקביל. ב פרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד להכין דוגמה אוליגומר עשיר A11-חיוביות Aβ_1-42 סינתטי Aβ_1-42 פפטיד במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של A11-חיוביות Aβ_1-42 אוליגומר בדגימות מאת סופג נקודה ניתוח באמצעות A11 ו Aβ_1-42-נוגדנים ספציפיים 6E10. באמצעות פרוטוקול זה, מעכבי של A11-חיוביות Aβ_1-42 אוליגומר יכולים גם להיות מוקרן מתוצאות הניסוי הכמותיים למחצה.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת ממחלות ניווניות החשוב ביותר המשפיעים על קשישים ברחבי העולם¹. מקובל כי הצבירה חריגה של β-עמילואיד (Aβ) עשוי להיות הגורם המוביל פתולוגי של AD. Aβ אגרגטים הם המרכיבים העיקריים של הפלאק סנילי, אחד סמנים ביולוגיים במוחם של חולי אלצהיימר. יתר על כן, אגרגטים Aβ, כולל oligomers בפרט, לייצר neurotoxicity חזק, אשר עשוי להיות הגורם למוות עצביים התקדמות לספירה. לכן, עיכוב של היווצרות אוליגומר Aβ עשוי למנוע הקשורים ניוון מוחיים, Aβ אוליגומר מעכבי יכול להתפתח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. מחקרים רבים השתמשו פפטיד Aβ סינתטי כדי ליצור oligomers חוץ גופית בתוך, מורפולוגיות ו מבנים של oligomers Aβ מלאכותיים, ולחקור את מעכבי של Aβ אוליגומר באמצעות במבחנה מודלים^{2,3 , 4}. עם זאת, שונה במבחנה היווצרות הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל אוליגומר עם מאפיינים מורפולוגיים שונים, אשר עלול לגרום התוצאות למחפשי בקרב קבוצות מחקר שונות. לכן, עבור Aβ אוליגומר פרוטוקול סטנדרטי היווצרות דרוש בדחיפות.

עד עכשיו, שיטות רבות לא דווחו ישירות לאתר Aβ oligomers. שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) שאינם denaturing בג'ל, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), נקודה סופג ניתוח יכול לשמש כדי לבחון את כמות ו/או המורפולוגיה של Aβ אוליגומר במבחנה^{5, 6}. לדוגמה, המורפולוגיה ואת המבנה של Aβ אוליגומר יכול להיות שנצפו ב- TEM. כמויות יחסיות והגודל המולקולרי של הסיכומים Aβ יכול להימדד על-ידי-denaturing בג'ל. אליסה יכול לשמש כדי לקבוע Aβ אוליגומר סרום, פלזמה, תמציות של רקמת המוח. לבסוף, נקודה סופג ניתוח, טכניקה המשמשת לזיהוי, ניתוח וזיהוי של חלבונים, ניתן להשתמש כדי להעריך את הריכוז היחסי של Aβ אוליגומר בדגימות שונות בעזרת נוגדנים אוליגומר וספציפיות Aβ. יתר על כן, נקודה סופג assay מציעה חיסכון משמעותי בזמן, בג'ל וההליכים blotting ג'לים אינם נדרשים. לכן, assay זה משמש בדרך כלל כדי מסך פוטנציאלי Aβ אוליגומר מעכבי. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה יחסית פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור להכין דוגמה אוליגומר עשיר_1-42 . Aβ, כדי לנתח את הכמויות של Aβ_1-42 אוליגומר על ידי dot סופג ניתוח, וכדי מסך Aβ אוליגומר מעכבי באמצעות תוצאות ניסויי למחצה כמותית.

Protocol

1. פתרון הכנה

הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ריאגנט מקורות.

1. להכין פתרון 5% אלבומין שור (BSA) על-ידי הוספת 5 g של BSA 100 מ של מים מזוקק פעמיים. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
2. להכין פתרון A11 נוגדן אנטי אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של הפתרון BSA 5%. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
3. להכין פתרון 6E10 נוגדן anti-Aβ (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
4. להכין פתרון OC נוגדן anti-fibrillar אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
5. להכין באגירה טריס מלוחים (TBS) מניות פתרון על-ידי הוספת 24 גרם של טריס בסיס ו- g 88 של NaCl 1,000 מיליליטר מים מזוקק פעמיים. להתאים את ה-pH ל 7.4. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 3 חודשים.
6. להכין תמיסת מלח באגירה טריס והפתרון Tween-20 (TBST) על-ידי הוספת 1 מ"ל של רצף-20 100 מ של TBS מניות פתרון ו- 900 מל מזוקק פעמיים מים.
7. להכין פתרון נוגדנים משניים על-ידי הוספת 10 µL של חזרת peroxidase (HRP) העז נגד הארנב IgG (H + L) עד 10 מ"ל של פתרון TBST. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.
8. להמיס 3.68 g של כורכומין ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות כורכומין 10 מ מ.
9. להמיס 5 מ"ג של Aβ סינתטי_1-42 ב- 2 מ של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-פרופנול (HFIP) כדי ליצור פתרון מונומר Aβ 2.5-מ"ג/מ"ל. מקום זה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 20 דקות להפוך 100 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.
   הערה: הליך זה אמורה לפעול מהר ככל האפשר. אמור לנתק את הטיפים פיפטה כדי להבטיח pipetting מדויק.
10. להכנת נוזל electrochemiluminescence (ECL) על ידי ערבוב ECL נוזל A ו- B עם יחס נפח של 1:1. הפתרון צריך להיות מוכן רק לפני השימוש.

2. הכנת הדוגמא

הערה: בצע את הכנת הדוגמא 2 ימים לפני הנקודה סופג ניתוח.

1. להוסיף µL 900 של מים מזוקק פעמיים שפופרת של Aβ_1-42 מונומר פתרון; הריכוז של Aβ_1-42 תהיה 0.25 מ"ג/מ"ל. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
2. להתנדף הפתרון עם גז חנקן טוהר גבוהה עד הנפח שלה µL עם-850. הריכוז של הפתרון_1-42 Aβ יהיה על 0.29 מ"ג/מ"ל.
   הערה: הפתרון צריך מנערים מפעם לפעם כדי להבטיח ש-HFIP הוא התאדה במלואו. בדרך כלל, לאחר 30 דקות של אידוי, אמצעי האחסון של הפתרון שיורית נמצא µL עם-850.
3. את הפתרון מניות כורכומין הפתרון עובד כורכומין (0.2 ו- 2 מיקרומטר) מדולל עם מים מזוקק פעמיים. מערבבים את פתרון_1-42Aβ וכורכומין עובד פתרון עם יחס נפח של 1:1. הריכוזים הסופי של כורכומין יהיה 0.1 1 מיקרומטר.
   הערה: מעכבי אוליגומר פוטנציאלי יכול להיות מעורב עם הפתרון_1-42 Aβ כל יחס במידת הצורך.
4. לנער את הפתרון באופן רציף ב מסית מגנטי (ראה טבלה של חומרים).
   1. לתקן תיבה מפריד פלסטיק התועמלן מגנטי. מניחים 2 מגנטי מערבבים ברים ב 2 פינות של תיבת ולמקם הצינורות מדגם במרכז תיבת.
   2. לנער את תיבת בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 48 שעות.
      הערה: המהירות של התועמלן מגנטי הוא בסביבות 60 סל ד.
5. Centrifuge הצינורות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו- g x 18,000 לאסוף תגובת שיקוע.

3. נקודה סופג ניתוח

הערה: כל incubations המבוצעות מטרף אופקי.

1. חתוך ניטרוצלולוזה ממברנה לרצועות רחב 1 ס"מ.
   הערה: הרוחב של קרום ניטרוצלולוזה ניתן להתאים בהתאם לצרכים ניסיוני.
2. במקום 2-µL דגימות באופן שווה על 2 רצועות (רצועת 1 ו- 2) עם כל מרווח נקודת-0.5 ס מ.
3. מניחים את הרצועות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עד ה-droplet על הלהקה יבש.
4. דגירה את הרצועות עם פתרון BSA 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. יש לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. האחות הפתרון TBST. עבור h 1 בטמפרטורת החדר, דגירה רצועת 1 עם נוגדן אנטי אוליגומר A11 פתרון ולהפשיט 2 עם פתרון 6E10 של נוגדן anti-Aβ.
7. לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. האחות הפתרון TBST. דגירה את הרצועות עם פתרון נוגדנים משניים עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר.
9. לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. באופן שווה להחיל את הנוזלים ECL מעורב השטח של הרצועות. לחשוף את הרצועות ב chemiluminescence אוטומטית מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: בדרך כלל, µL 300 של נוזל ECL מספיקה ממברנה אחת. הקרום חייב להישמר לח במהלך החשיפה. זמן החשיפה מחושבת באופן אוטומטי על ידי מערכת הדמיה.
11. לעשות ניתוח גווני אפור באמצעות ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) או תוכנות עיבוד תמונה אחרת כדי להשיג תוצאות כמותיות למחצה.

תוצאות

כדי לבדוק אם מונומר_1-42 Aβ יכול ליצור אוליגומר_1-42 של Aβ לאחר הכנה, שימש ניתוח TEM. אין אגרגטים גלוי נצפו במדגם מומס HFIP Aβ_1-42 מונומר (איור 1א'). יתר על כן, אגרגטים בעיקר הכדוריים בקוטר של סביב 10-80 ננומטר נצפו במדגם_1-42 Aβ לאחר 48 שעות של ט...

Discussion

פרוטוקול זה, אנחנו דיווחו שיטה להכין דגימות המכיל Aβ_1-42 אוליגומר, וכדי לנתח כמויות A11-חיוביות Aβ_1-42 אוליגומר ידי נקודה סופג ניתוח. למרות השיטות שלנו עבור הכנת Aβ_1-42 אוליגומר עשיר דגימות די פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור, ישנם עדיין כמה נקודות כדי שישימו לב אלינו. ראשית, HFIP משמש כדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi