A11-позитивных β-амилоида олигомера подготовки и оценки, с помощью Dot промокательной анализ

Резюме

Этот протокол описывает, как подготовить олигомеров значения из синтетических пептидов в пробирке и оценить относительные количества значения олигомера, точка промокательной анализа.

Аннотация

Β-амилоида (значения) – гидрофобная пептид с внутренней тенденцией самостоятельно собрать на агрегаты. Среди различных агрегатов значения олигомера широко признается в качестве ведущих нейротоксина в прогресс болезни Альцгеймера (AD) и считается важным событием в патогенезе AD. Таким образом, значения олигомера ингибиторов может предотвратить нейродегенеративные и имеют потенциал, чтобы быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Однако различные формирования протоколов олигомера значения может привести к олигомеров с различными характеристиками. Кроме того не есть много методов, чтобы эффективно экран значения_1-42 олигомера ингибиторов. Антитело A11 может реагировать с подмножеством токсичных значения_1-42 олигомера с β-лист анти параллельной структуры. В этом протоколе мы опишем, как подготовить пример олигомер богатые A11-положительные значения_1-42 из синтетических значения_1-42 пептида в пробирке и оценить относительные количества A11-положительные значения_1-42 олигомера в образцах, точка промокательной анализ с помощью A11 и значения_1-42-конкретные 6E10 антител. Используя этот протокол, ингибиторы A11-положительные значения_1-42 олигомера также может быть изолированы от полуколичественного экспериментальные результаты.

Введение

Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из наиболее важных нейродегенеративных заболеваний, затрагивающих пожилых людей во всем мире¹. Широко признается, что аномальные агрегации β-амилоида (значения) может быть ведущим фактором патологических AD. Aβ агрегаты являются основными компонентами старческое бляшек, один из биологических маркеров в мозгах пациентов AD. Кроме того статистические значения, в частности олигомеров, производят мощный нейротоксичности, который может быть причиной гибели нейронов как AD прогрессирует. Таким образом, ингибирование значения олигомера формирования может предотвратить нейродегенеративные, и значения олигомера ингибиторы могут быть разработаны как Болезнь модифицирующие лечения AD. Многие исследования использовали синтетический пептид значения образуют олигомеров в пробирке, изучения морфологии и структур искусственных значения олигомеров и расследовать ингибиторов Aβ олигомера с помощью в vitro модели^{2,3 , 4}. Однако, различные в vitro формирование протоколов олигомера значения может привести к олигомера с различных морфологических характеристик, которые могут привести к несравненный результаты среди различных исследовательских групп. Таким образом срочно необходима стандартная формирования протокола для значения олигомера.

До сих пор не так много методов поступили непосредственно обнаружить значения олигомеров. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА), -Денатурирующий гель-электрофорез, энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) и точка промокательной анализ может использоваться для изучения объема и/или морфология Aβ олигомера в vitro^{5, 6}. Например, морфологии и структуре значения олигомера может наблюдаться в ТЕА. Относительные количества и молекулярного размера значения агрегатов может быть измерено-Денатурирующий гель-электрофорез. ELISA может использоваться для определения значения олигомера в сыворотке, плазме и выдержки из ткани мозга. И наконец точка промокательной анализ, метод, используемый для выявления, анализа и идентификации белков, могут использоваться для оценки относительной концентрации Aβ олигомера в различных образцах с помощью олигомер значения зависимости и антител. Кроме того точка промокательной пробирного предлагает значительную экономию времени, как электрофорез геля и blotting процедуры гели не требуются. Таким образом этот assay обычно используется для экрана потенциальные значения олигомера ингибиторов. Общая цель настоящего Протокола заключается в описания метода сравнительно простых, надежных и воспроизводимых подготовить пример олигомер богатые значения_1-42 , проанализировать количество значения_1-42 олигомера точка промокательной анализа и экран значения олигомер Ингибиторы с помощью полуколичественного экспериментальные результаты.

протокол

1. решение подготовка

Примечание: См. Таблицу материалов для реагент источников.

1. Приготовляют раствор 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА), добавив 5 g BSA до 100 мл двойной дистиллированной воды. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
2. Подготовьте раствор антител анти олигомера A11 (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
3. Подготовьте раствор 6E10 антитела анти Aβ (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
4. Подготовьте раствор OC антитела анти фибриллярный олигомера (1:1, 000), добавив 10 мкл антител Стоковый раствор 10 мл 5% раствора БСА. Смешайте их полностью vortexing. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
5. Подготовьте трис буфер (TBS) акций физраствора, добавив 24 g Tris база и 88 г NaCl в 1000 мл двойной дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Хранят раствор при температуре 4 ° C на срок до 3 месяцев.
6. Подготовьте трис амортизированное saline и Tween-20 (TBST) решение, добавив 1 мл Tween-20 до 100 мл TBS акций решения и 900 мл двойной дистиллированной воды.
7. Приготовляют раствор вторичные антитела путем добавления 10 мкл хрен пероксидазы (ПХ) коза анти кролик IgG (H + L) по 10 мл раствора TBST. Смешайте их полностью vortexing их. Хранят раствор при температуре 4 ° C до 1 месяца.
8. Растворите 3,68 г куркумина в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) сформировать 10-мм куркумин Стоковый раствор.
9. Растворяют 5 мг синтетических значения_1-42 в 2 мл 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-пропанол (HFIP) для формирования решения мономера значения 2,5 мг/мл. Поместите его при комнатной температуре (25 ° C) для 20 минут сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до 6 месяцев.
   Примечание: Эта процедура должна запускаться так же быстро, как можно скорее. Наконечники должны быть отрезаны обеспечить точное дозирование.
10. Подготовка electrochemiluminescence (ЭСЛ) жидкости путем смешивания ECL жидкости A и B с тома соотношении 1:1. Это решение следует готовить непосредственно перед использованием.

2. Пробоподготовка

Примечание: Выполните подготовку образца за 2 дня до точки промокательной анализа.

1. 900 мкл двойной дистиллированной воды для трубки значения_1-42 мономера решения; концентрация значения_1-42 будет 0,25 мг/мл. Поместите смесь при комнатной температуре в течение 20 мин.
2. Испарится решение с высокой чистоты азот, до тех пор, пока ее объем составляет около 850 мкл. Концентрация раствора_1-42 значения будет о 0,29 мг/мл.
   Примечание: Решение должно быть поколеблен время от времени чтобы убедиться, что HFIP полностью испарилась. Обычно после 30 мин испарения, объем остатков раствора составляет около 850 мкл.
3. Разбавьте куркумин Стоковый раствор для рабочего раствора куркумин (0,2 и 2 мкм) с двойной дистиллированной воды. Mix решение значения_1-42и куркумин рабочего раствора с тома соотношении 1:1. Окончательный концентрации куркумин будет 0.1 и 1 мкм.
   Примечание: Потенциальных ингибиторов олигомера могут быть смешаны с значения_1-42 решения в любом соотношении, при необходимости.
4. Встряхнуть решение непрерывно в магнитной мешалки (см. Таблицу материалы).
   1. Исправьте ящик пластиковый делитель для магнитной мешалкой. Место 2 магнитные перемешать баров на 2 углы окна и поместите образец трубки в центре окна.
   2. Встряхните при комнатной температуре (25 ° C) в течение 48 часов.
      Примечание: Скорость магнитные мешалки составляет около 60 об/мин.
5. Центрифуга для трубы 15 мин при температуре 4 ° C и 18 000 x g. собирать супернатант.

3. точка промокательной анализ

Примечание: Все инкубаций выполняются на горизонтальной шейкер.

1. Нитроцеллюлозная мембрана нарежьте полосками шириной 1 см.
   Примечание: Ширина нитроцеллюлозную мембрану можно отрегулировать согласно экспериментальной потребности.
2. Поместите образцы 2 мкл равномерно на 2 полосы (полоса 1 и 2) с каждой точки интервала на 0,5 см.
3. Место полосы при комнатной температуре за 5 мин до капли на полосе сухой.
4. Инкубируйте полоски с 5% BSA раствор для 30 мин при комнатной температуре.
5. Промойте полоски с TBST решение для 5 мин при комнатной температуре.
6. Аспирационная решение TBST. За 1 ч при комнатной температуре инкубировать газа 1 с антитело против олигомера A11 решения и газа 2 с решением 6E10 антитела анти значения.
7. Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Аспирационная решение TBST. Инкубируйте полоски с раствором вторичное антитело для 40 мин при комнатной температуре.
9. Промойте полоски с раствором TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. Равномерно нанесите ECL жидкости, смешанные к поверхности полос. Разоблачить полоски в автоматическое хемилюминесценция Система (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Как правило, 300 мкл ECL жидкости достаточно для одного мембраны. Мембраны должны храниться влажной во время экспозиции. Время экспозиции автоматически вычисляется системой обработки изображений.
11. Сделайте анализ серого с помощью ImageJ (Национальный институт здоровья) или другой обработки изображений программное обеспечение для получения полу количественных результатов.

Результаты

Расследовать ли значения_1-42 мономера могут образовывать значения_1-42 олигомера после подготовки, анализ ТЕА был использован. Без видимых агрегатов наблюдались в образце мономера растворяют HFIP значения_1-42 (рис. 1А). Кроме того гл...

Обсуждение

В этом протоколе мы сообщали метод подготовить образцы, содержащие значения_1-42 олигомера и для анализа количества A11-положительные значения_1-42 олигомера с точкой промокательной анализа. Хотя наши методы для подготовки значения_1-42 олигомер богатые образцы являются дов?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All - automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi